Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

Özet

Bu protokolü biz galvanotaksis sırasında nöral prekürsör hücre translokasyon edilen erişkin beyninin time-lapse görüntüleme sağlamak için bir doğru akım elektrik alanın uygulanmasına izin özel odaları oluşturmak nasıl gösterilmektedir.

Özet

Nöral kök ve erişkin memeli beynindeki progenitor hücreler (toplu olarak adlandırılır sinir öncü hücreleri) (NPC) keşfedilmesi neuroregenerative stratejilerin geliştirilmesi için bu hücrelerin multipotent ve proliferatif özellikler kullanılarak yönelik araştırmalar bir gövde yol açmıştır. Bu tür stratejilerin başarısı için kritik bir adım eksojen Transplantasyon sonrası lezyon yerinde doğru veya MSS periventriküler bölgede bulunan endojen öncüleri yanıtı arttırmak için NPCs harekete geçirilmesidir. Buna göre, teşvik rehberlik ve NPC göç geliştirmek mekanizmaları anlamak için önemlidir. Galvanotaksis olarak bilinen bir olgu - Bizim iş tanıtmak için doğru akım elektrik alanların kullanımı (dcEFs) ve doğrudan NPC göç üzerinde duruluyor. Endojen fizyolojik elektrik alanları normal gelişimi ve yara onarımı sırasında hücre göçü için kritik ipuçları olarak işlev görür. Farmakolojik bozulmasıAxolotl embriyolar trans-nöral tüp potansiyeli ciddi gelişimsel malformasyonlar ¹ neden olur. Yara iyileştirme bağlamında, yaralı, kornea tamir oranı doğrudan bu dcEF ^2-3 farmakolojik olarak artırma ya da bozulma ile gösterildiği gibi, yaralanma sonrası ortaya çıkan epitel yara potansiyel büyüklüğü ile ilişkilidir. Biz bir şekilde dıştan uygulanan dcEF maruz kaldığında yetişkin subepandimal YZK'lar in vitro hızlı ve yönetmenliğini cathodal göç tabi olduğunu göstermiştir. Bu protokolü biz yüksek çözünürlüklü, bir tek hücre düzeyinde yönettiği hücre gövdesi translokasyon (göç) uzun vadeli gözlem için basit ve etkili bir galvanotaksis tahlil oluşturmak için laboratuvar tekniklerini açıklar. Bu tahlil, transgenik veya nakavt fareleri kısa müdahale RNA, ya da özel bir reseptör agonistleri / antagonistleri kullanımı yoluyla hücre hareketliliği içine dcEF transdüksiyon düzenleyen mekanizma araştırılması için uygun olacaktır.

Protokol

Hayvan taşıma içeren tüm prosedürler kurumsal düzenlemeler (protokol no. 20009387) uyarınca Toronto Hayvan Bakım Komitesince Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki yöntemler uygulanabilir durumlarda bir laminer akış kaputu, steril alet ve teknikler kullanılarak yapılmalıdır.

Aşağıdaki protokol metninde, ifade "EFH-SFM" epidermal büyüme faktörü, temel fibroblast büyüme faktörü ve heparin ile takviye serum serbest medya anlamına gelir. Bu mitojenler kendi ayrışmamış devlet ⁴ YZK'lar korumak için farklılaşmamış NPCs galvanotaksis araştırılırken EFH-SFM kullanılır. Olgun hücre tipleri farklılaşması için indüklenebilir NPCs galvanotaksis araştırırken, "FBS-SFM"% 1 fetal sığır serumu serum serbest medya anlamına gelir. FBS olgun nöral fenotipleri ⁵ içine NPCs farklılaşma teşvik etmektedir.

1. Sinir Öncüleri izolasyonu ve Kültür (Değil) Videoda gösterilen

1. Servikal dislokasyon yoluyla isofluorane ve özveri ile bir CD1 fare (6-8 haftalık) Anesteziyoloji.
2. % 70 etanol içinde baş söndürün ve keskin disseksiyon makas ile hayvan başını kesmek.
3. Cerrahi forseps ile kafa tutarken, kafatası maruz dorsal yüzeyi üzerinde cilt kaldırmak.
4. Bir neşter ve hiçbir kullanma. 11 bıçak, mediyolateral eksen boyunca ön sinüs de kafatası puan, ve aynı zamanda rostro yönde dikiş boyunca sagital.
5. Uzakta olmayan baş parietal kemikler Peel. 7 kavisli bir forseps, delmek için beyin dokusu umursamadı alıyor.
6. Beyincik altından başlayarak ve olfaktor doğru ilerleyen beyin altında ince bir spatula yerleştirin. Forseps ile yerde kafatası tutarken, yavaşça kafatası beyin çekin ve hemen buz yapay beyin omurilik sıvısı (aşağıda tarifleri bakınız) yerleştirin.
7. Bir diseksiyon mikroskobu altında, steril kullanarakDiseksiyon makas ve forseps orta hat boyunca yarım beyin kesti. Medial (kesim) yüzey yukarı bakacak şekilde her hemisferin döndürün.
8. Bir hemisfer seçin ve medial yüzeyi yukarı bakacak şekilde, korpus kallozum (KK posterior bölgesi) splenium bulun.
9. Korteks yüzeyinden dorsoventral ekseni boyunca korpus kallozum spleniumda bir kesi olun.
10. Lateral ventrikül medial ve lateral duvarları açığa koku ampul doğru kazılı korteks Peel.
11. Dorsal yüzeyi yukarı bakacak şekilde yarımkürede döndürün ve NPC'ler ⁶ ikamet periventriküler bölge içerir maruz medial ve lateral duvarlar, kesip toplamak için kavisli microscissors kullanın.
12. Tekrar diğer yarımkürede için 1,8-1,11 adımları.
13. Bir 15 cc tüp içinde tripsin solüsyonu (aşağıda tarif bakınız) 7 ml içine izole edilmiş doku pipet, ve 37 ° C de bir rocker tüp yerleştirmek25 dakika inkübatör.
14. 5 dakika boyunca 1,500 rpm'de santrifüje tüp, süpernatan aspire, ve (aşağıda tarif bakınız) tripsin inhibitörü çözelti 2 ml doku tekrar süspansiyon.
15. Yavaşça hava kabarcıkları önlemek için dikkatli bir küçük kuyu Pasteur pipeti 30-50 kez doku çiğnemek.
16. 5 dakika boyunca 1,500 rpm'de santrifüje tüp, süpernatan aspire ve pelet 3-5 kez triturating ile SFM 1-2 ml (aşağıda tarif bakınız) içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
17. 3 dakika 1.500 rpm'de tüp santrifüjleyin, SFM + EFH arasında bölgesindeki süpernatant ve tekrar süspansiyon 1 ml aspire.
18. SFM + EFH içinde başına 10 ul hücre yoğunluğunda bir T25 kültürü şişesi içinde bir haemocytometer ve plaka hücreler ile hücre yoğunluğu, canlı sayın.
19. Kültür NPC oluşan serbest yüzen birincil neurospheres verim örselenmemiş 7 gün büyümeye izin verin.

2. Galvanotaksis Odası Hazırlama

1. Hayır 3 kare cam yerleştirin. 1 kapak camları (22 x 22 x 0.17 mm) iGecede 6N hidroklorik asit na şişe.
2. Ertesi gün, kare hiçbir gelen cam 6 dikdörtgen şeritler (22 x 5 x 0.17 mm) kesmek için bir elmas uçlu cam kesici kullanın. 1 kapak fişleri.
3. Bir laminer akış kaputun içine asitle yıkanmış kare fişleri ve dikdörtgen fişleri aktarın. Doku kültürü dereceli otoklava su ile, sonra% 70 etanol ile ilk dikdörtgen ve kare şeritler yıkayın ve silin bir Kim üzerinde kurumasına izin (ilave sterilite, cam hava kuru izin verilebilir).
4. Kare cam slaytlar bir yüzeyi çevre vakum gres sürün ve 60 mm plastik Petri kaplarının tabanına onları mühür.
5. Dikdörtgen cam şeritleri bir yüzeyi uzun ekseni boyunca vakum uygula yağ, ve bir merkezi oluk oluşturmak için kare cam slaytların zıt kenarları (birbirlerine paralel olduğu gibi) ile geri kapatın.
6. Laminer akış kaputu en az 15 dakika süreyle odaları UV sterilize.
7. Poli-L-lysi pipetle 250-300 ul2 saat oda sıcaklığında inkübe odaları ve merkezi oluk üzerine ne.
8. İnkübasyon süresinin sonunda önce yaklaşık 15 dakika, (aşağıda tarif bakınız) Matrigel solüsyon hazırlanır.
9. , Poli-L-lizin aspire otoklavlanmış 1 mL su, ve merkezi oluklar üzerine Matrigel solüsyonu bir pipet 250-300 ul ile merkezi çukurların yıkayın.
10. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe odaları.
11. Matrigel çözüm aspire ve yavaşça SFM 1-2 ml merkezi çukurların yıkayın.
12. Pipet 100 merkez çukurların üzerine EFH-SFM veya FBS-SFM ul ve sayma mikroskop sahneye galvanotaksis odaları aktarın.
13. Pipet 3-4 60 mm Petri kabı içine neurosphere içeren kültür ml ve sayma mikroskop aşamasına Petri kabı aktarın.
14. 5x görüntüleme amacı, her galvanotaksis merkezi çukur üzerine 5-8 bütün neurospheres (dört bir defada) aktarmak için bir P10 pipet kullanınOnları dissociating ve dikkatle Matrigel substrat aksatmadan merkez çukur etrafında neurospheres yayılmış olmadan oda.
15. Merkez oluklar üzerine EFH-SFM veya FBS-SFM ek 150-200 ul ekleyin.
16. 37 ° C,% 5 _CO2, 17-20 saat süreyle% 100 nemlendirilmiş kuluçka makinesi içine galvanotaksis odaları aktarın (eğer farklılaşmamış analiz NPC) Şekil 1 'de gösterildiği gibi neurospheres Matrigel substrata yapışır ve tek hücre halinde ayrıştırmak için izin vermek için . Farklılaşmış NPC analiz ise, kuluçka süresi, hücrelerin farklılaşması izin vermek için 69-72 saat için genişletilmelidir.

3. Hücre Time-Lapse Görüntüleme Canlı

1. Canlı hücre görüntüleme sistemi 37, denge sağlaması için izin ° C,% 5 lik önce geçen zaman kaydının başlatılması için 30 dakika arasında, en az _CO2.
2. Bir ucundan 1 mm çaplı gümüş tel, bobin ikisi 12 cm parçalar koparıp ve Clorox b koyunleach 20 dakika için Ag / AgCI elektrotlar oluşturur.
3. Bir sayma mikroskop sahneye galvanotaksis odaları aktarın ve aşağıdaki kriterlere göre canlı hücre görüntüleme göçü analiz için kullanılacak olan kamara seçin: i) neurospheres hücreleri sahip olmalıdır) tek hücreler ve ii içine neredeyse tamamen ayrılmış olmalıdır az-hayır süreçleri yuvarlak morfolojileri hücre gövdeleri uzanan.
4. Ayrı bir kare hayır birlikte, bir laminer akış kaputun içine seçilen galvanotaksis odasına aktarın. 1 cam kapak kayma ve vakum gres.
5. Kapak otoklavlanmış su ile, sonra% 70 etanol ile ilk kayma ve Kapak kayma iki paralel kenarlarında vakum gres bir şerit uygulayın yıkayın.
6. , Odasının merkezi çukur gelen kültür ortamı aspire sonra hızlı bir şekilde, iki paralel dikdörtgen cam şerit üzerinde kalan yağ şeritler, etkili bir çatı yaratılması da bu tür oda üzerine kapak slipi (yağ-yüzü aşağı bakacak şekilde) yerleştirmekodasına.
7. Kapiller eylem yoluyla merkezi çukur içine taze EFH-SFM veya FBS-SFM Pipet 100 ul.
8. Şekil 2'de gösterildiği gibi, merkezi oluk her bir ucunda, kültür besiyeri havuzları için sınırlarını oluşturmak için vakum yağ kullanır.
9. PVC boru, iki 15 cm parçalar koparıp ve dikkatle hiçbir kabarcıklar tüpler oluşmaya sağlanması, boru içine agaroz enjekte çözüm için bir 18 gauge iğne ile 10 cc şırınga kullanmak ve jel 5 dakika boyunca katılaşmaya izin.
10. Agaroz jel tüpler, Ag / AgCI elektrodları, ve kültür ortamı rezervuar olarak kullanılmak üzere boş 60 mm Petri kapları bir çift ile birlikte, bir canlı hücre görüntüleme sistemi için galvanotaksis oda aktarın ve Ag / AgCI elektrot içerir. Galvanotaksis odası 37 içinde dinlenmek için izin ° C, 20-30 dakika süreyle% 5 CO ₂ ortamında.
11. Bu süre zarfında, sondaj delikleri ile 2 boş Petri kaplarının kapakları ve galvanotaksis odasının en Petri kabı kapağı hazırlamakbunların Şekil 3 'de gösterildiği gibi bir Dremel ya da benzer araç ile içine.
12. Pipet her boş Petri kabına merkez çukur iki yüzüne EFH-SFM veya FBS-SFM 1-1.5 ml ve SFM 7-8 ml. Her yemeğin içine galvanotaksis odasının merkezi çukur ve yerde bir Ag / AgCl elektrot her tarafında il birini Petri. Şekil 4'te gösterildiği gibi agaroz jel köprüleri ile elektriksel süreklilik kurmak için galvanotaksis haznesi ve Petri kutularına arasındaki boşluğu.
13. Elektrik akımı ölçmek için seri bir ampermetre ile, harici bir güç kaynağına Ag / AgCl elektrot bağlayın ve güç kaynağını açın. Doğrudan merkezi çukur boyunca elektrik alanın gücünü ölçmek için bir voltmetre kullanın ve istenen elektrik alan şiddeti (Bu laboratuarda yapılan deneyler ile 250 mV / mm dcEF gücü kullanmak elde edilene kadar güç kaynağının çıkış ayarlayabilirsiniz 1 ve 1.5 mA arasında elektrik akımı).
14. Inisiyatifite time-lapse canlı hücre görüntüleme sistemi üzerinde modül ve deney süresi istenilen miktarda için çalışmasına izin. Tahlil tamamlanmasından sonra, standart bir immun analiz için% 4 paraformaldehit içinde hücreler düzeltmek.

Sonuçlar

Kinematik analizi bir 250 mV / mm dcEF varlığında, farklılaşmamış NPC katot karşı yönlendirilmiş ve çok hızlı galvanotaksis (Şekil 5A, Film 1) gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bir dcEF yokluğunda, hücrelerin rasgele hareketi (Şekil 5B, Film 2) görülmektedir. Bu alan gücü az, farklılaşmamış NPCs>% 98'i yansıması olduğu için tüm 6-8 saat boyunca göç ve ölü hücreleri göç etmezler çünkü bu bir dcEF yokluğunda veya varlığında bu dönemde canlı kalır düşündürmektedir.

Tartışma

Bu protokol, önceki çalışmalarda ^7-9 köklü yöntemler adapte edilmiştir. Galvanotactic odaları hücre ekimi kısıtlanmasının veya merkez çukur ^10,11 mikroimalat için _CO2 lazer ablasyonu kullanmak için de ayrı bir cam yapım dahil olmak üzere farklı teknikler kullanarak çeşitli inşa edilebilir. Bazı teknikler diğerlerinden daha zahmetli ve masraflı olabilir. Biz genellikle çoğu hücre biyoloji laboratuvarlarında bulunan malzemeler kullanılarak bir NPC galvanotaksis odası oluşturmak için basit ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Öğenin ismi	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
			Sinir Prekürsör Hücre İzolasyonu
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g 100 ml dH 2 O içerisinde çözündürüldü
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g 100 ml dH 2 O içerisinde çözündürüldü
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g 100 ml dH 2 O içerisinde çözündürüldü
155 mM NaHCO 3	Sigma	S5761	1.302 g 100 ml dH 2 O içerisinde çözündürüldü
0.5M Glikoz	Sigma	G6152	9.01 g 100 içinde çözülmüşml dH 2 O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g 100 ml dH 2 O içerisinde çözündürüldü
Penisilin-streptomisin	Gibco	15070
Sığır pankreasın tripsin	Sigma	T1005
Koyun hyaluronidaz testisler	Sigma	H6254
Kynurenic asit	Sigma	K3375
Ovomucoid tripsin inhibitörü	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
% 30 Glikoz	Sigma	G6152
% 7.5 NaHCO3	Sigma	S5761
1M Hepes	Sigma	H3375	23.83 g 100 ml dH 2 O içerisinde çözündürüldü
L-glutamin	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	20 ul birimler halinde hormon karışımı ve kısım 1 ml sulandırın.
FGF	Invitrogen	PHG0226	20 ul birimler halinde hormon karışımı ve kısım 0.5 ml sulandırın.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R & D Systems	3188-AT	0.1 g 4 ml dH 2 0 içine çözünmüş
Putressin	Sigma	P7505	Apo-transferrin içine 9,61 mg böylece çözülürgeçirdikleri evrim
Ensülin	Sigma	I5500	0.1N HCl 0.5 ml içine 25 mg çözülür ve dH 2 0 3.5 ml ekleyin
Selenyum	Sigma	S9133
Progesteron	Sigma	P6149
Standart Diseksiyon araçları	Güzel Bilim Araçları
Diseksiyon mikroskobu	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaksis Odası Hazırlama
Kare cam kapak slaytlar	VWR	16004
6N hidroklorik asit	VWR	BDH3204-1
Yüksek vakum gres	Dow Corning
60 mm Petri kapları	Fisher Scientific	0875713A
Poli-L-lisin	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	150 ul birimler halinde çözülme ve kısım
FBS	Invitrogen	10082139	NPC farklılaşma inducing Yalnızca kullanınız aksi SFM kullanımı + EFH kültür ortamı yukarıda da belirtildiği gibi
Mikroskop Sayma	Olimpos	CKX41
			Hücre Time-Lapse Görüntüleme Canlı
Gümüş tel	Alfa Aesar	11434
Ultrapure Agaroz	Invitrogen	15510-027
Isı Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC boru	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Beyazlatıcı	Clorox
10 cc şırınga	BD	309604
18 gauge iğne	BD	305195
Dremel matkap	Dremel	Model 750
Ters mikroskop nemlendirilmiş, İnkübe odası ile donatılmıştır	Zeiss	Axiovert-200M
			Tarifler Madde Hacim 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 mi 155mm NaHCO 3 16.9 ml 1M Glikoz 1 mL 108 mM CaCl2 0,09256 mL Penisilin-streptomisin 1 mL Otoklavlanmış su 74 mL Yapay beyin omurilik sıvısı Madde Hacim veya Yığın Yapay beyin omurilik sıvısı 30 ml Sığır pankreasın tripsin 40 mg Koyun hyaluronidaz testisler 22.8 mg Kynurenic asit 5 mg Tripsin Çözüm Madde Hacim veya Yığın SFM 15 ml Ovomucoid tripsin inhibitörü 10 mg Tripsin İnhibitör Çözüm Madde Hacim Otoklavlanmış su 37 ml 10X DMEM/F12 10 mL % 30 Glikoz 2 ml % 7.5 NaHCO3 1.5 ml'lik 1M Hepes 0.5 ml Transferrin, putressin çözümü 4 mL 25 mg ensülin çözelti 4 mL Selenyum 100 & Mu; L Progesteron 100 ul Hormon Mix (-20 ° C'de 100 ml toplam mağaza) Madde Hacim Otoklavlanmış su 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml % 30 Glikoz 1 mL % 7.5 NaHCO3 0.75 ml 1M Hepes 0.25 ml'lik Hormon mix 5 ml L-glutamin 0.5 ml Penisilin-streptomisin 0.5 ml Serum Ücretsiz Media EFH-SFM: EGF 10 ul, FGF 10 ul ve Heparin FBS-SFM 3.66 ul ekleyin: 0.5 ml FBS ekleyin Madde Hacim Matrigel 150 ul SFM 3.6 ml Matrigel Çözüm Matrigel kısım bir buz kutusuna yerleştirilir ve SFM ile karıştırılmadan önce viskoz bir sıvı oluşturmak için 4-5 saat içinde yavaş yavaş çözülme izin verilmelidir. Bu alt tabaka Matrigel düzgün bir tabaka oluşumunu temin edecektir. Yavaş yavaş çözülmüş değil, elde edilen substrat muhtemelen hücre göçü engelleyen, Matrigel kümeleri ihtiva edecektir. Madde Hacim veya Yığın Ultrapure Agaroz 10 ml GKD 2 0 içinde 300 mg SFM Isı İnaktive FBS 8 ml 2 ml MatrigelÇözelti bir 15 cc şahin tüp içinde 2 ml ısı ile aktifliği giderilmiş FBS SFM 8 ml karıştırılır. Mix 10 ml GKD bir Erlenmeyer şişesinde 2 0 ile agaroz ve 10 sn aralıklarla 30 saniye mikrodalga ısı, her 10 sn aradan sonra mikrodalga çözüm kaldırmak ve iyice karışması sağlanır. Son 10 sn mikrodalga döneminin ardından, 57 ° C su banyosunda SFM / FBS çözüm ve mağaza ile agaroz çözüm karıştırmak.