Yöntem makalesi
Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.
Biyofiziksel özellikleri ve tek nöronların fonksiyonel organizasyon anlama ve nasıl işlem bilgileri beynin nasıl çalıştığını anlamak için esastır. Herhangi bir sinir hücresinin temel işlevi, genellikle birden fazla kaynaktan gelen elektrik sinyalleri, işlemek için. Nöronal süreçlerin elektriksel özellikleri detaylı ölçümler yokluğunda tahmin etmek için olağanüstü, kompleks dinamik ve genel durumda, imkansızdır. Biri olur böyle bir ölçüm elde etmek için, ideal, onlar nöronal süreçleri ve aksiyon potansiyeli inisiyasyon etkileme belirli yerlerde summate ilgili menşe sitelerinden giderken, birçok bölgeden, eşikaltı olayları izlemek edebilmek istiyorum. Bu hedef elektrotlar istihdam ölçümleri teknik sınırlamaları nedeniyle herhangi bir nöron elde edilmemiştir. Bu dezavantajı ortadan kaldırmak için, bu geniş paralel recordin izin görüntüleme teknikleri ile yama elektrot yaklaşımı tamamlayıcı çok arzulanan bir durumdurBir nöronun her yerinden gs. Alt-milisaniye ve alt-mikrometre çözünürlük ile karakterize - Organik voltaj duyarlı boyalar (V m-görüntüleme) ile membran potansiyeli Transientlerin optik kayıt - İşte, biz böyle bir tekniği tanımlar. Bizim metodumuz voltaj duyarlı moleküler problar 2 öncü çalışmalarına dayanmaktadır. İlk teknolojinin birçok yönü sürekli onlarca yıl 3, 5, 11 den fazla geliştirilmiştir. Ayrıca, daha önceki çalışmaları V m-görüntülemenin iki temel özellikleri belgelenmiştir. Öncelikle, floresan sinyalleri tüm fizyolojik aralığı (; 10, 14, 16 +100 mV -100 mV) üzerinde membran potansiyeli doğrusal orantılıdır. İkincisi, burada kullanılan voltaj duyarlı boya (JPW 3028) ile yükleme nöronlar saptanabilir farmakolojik etkisi yoktur. Kaydedilen boya yükleme sırasında başak genişletilmesi, 7 4 tamamen düzelir. Buna ek olarak, deneysel kanıtlar elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedirherhangi bir tespit fototoksik etkilerini 4 öncesinde kayıt önemli bir sayısını (yüz), 6, 12, 13. Şu anda, biz V m-görüntüleme tekniğinin hassasiyetini maksimize etmek için yakın uygun dalga boyunda bir lazer ışık kaynağı parlaklık ve istikrar yararlanmak. Yürürlükteki duyarlılık akson ve akson teminatlar, terminal dendritik dalları ve bireysel dendritik dikenler içeren bir nöronun her yerinden gelen V m Transientlerin birden fazla site optik kayıtları verir. Sinyal etkileşimleri Elde edilen bilgiler, aynı zamanda, bir film şeklinde doğrudan doğruya görselleştirildiği gibi nicel olarak analiz edilebilir.
1. Ekipman Ayarı
1.1 Adım. Görüntüleme kurulum
Voltaj duyarlı boya sinyallerini kayıt etmek anahtarı uygun kurulum tasarımıdır. Biz üç kamera ile donatılmış bir dik mikroskop (BX51WI Olympus veya Zeiss AxioExaminer) kullanın. Kurulum Nikon 60X/1.0 NA veya Zeiss 63X/1.0 NA su daldırma hedefleri kullanarak epi-floresan, geniş alan mikroskopisi modunda ikaz ışığı ile beyin dilimleri aydınlatıcı bireysel nöronlar için tasarlanmıştır. Bizim mikroskoplar bir titreşim izolasyonu tabloya cıvatalı ve motorlu hareketli aşamaları ile donatılmıştır. Her bir mikroskop üç kamera portu ile donatılmıştır. Bir kamera bağlantı noktası Video-mikroskopi (IR-1000, Dage MTI, ABD) kızılötesi DIC için standart bir yüksek uzaysal çözünürlüklü CCD kameraya sahiptir. İkinci kamera bağlantı noktası nispeten düşük uzaysal çözünürlüğü (80 x 80 piksel) ama olağanüstü dinamik aralık (14 bit) ve okunması son derece düşük hızlı veri toplama makinesi (20 kHz'e kadar kare hızı) vargürültü (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Için konfokal görüntüleri z yığınları toplamak için kullanılan bir iplik-disk konfokal tarayıcı (CSU-10, Yokogawa, Japonya) üzerine monte; üçüncü kamera bağlantı noktası yüksek uzaysal çözünürlüklü bir CCD kamera (PCO AG, Almanya PixelFly, 1392x1024 piksel) sahip lekeli hücrenin ayrıntılı morfolojik rekonstrüksiyonu. Bir frekans katlamalı diyot pompalı Nd: 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Çin) de YVO4 sürekli dalga lazer (400 mW) yayan uyarma ışık kaynağıdır. Çekim (LS6; Vincent Associates) tarafından kapı 2 mm çapında lazer ışını arkasına diyafram doldurmayın için tasarlanmış bir tek portlu Epifloresans kondansatör (Fotonik GmbH, Gräfelfing KADAR, Almanya) aracılığıyla mikroskop birleştiğinde bir ışık kılavuzu yönlendirilir objektif ve nesne düzlemi Eşit aydınlatmalı yakınında sağlayabilir. Lazer ışını tarafından V m-görüntüleme maksimize etmek için geleneksel bir Xenon ark lambası yerine kullanılmaktadır: (1) bir tek renkli ex kullanılarakboya 9, 10, (2), bir yay-lamba ile elde edilebilir seviyesinin ötesinde uyarma ışığın yoğunluğunu arttırmak V m maksimize etmek için absorbsiyon spektrumu ve kırmızı kanat alıntı ışık. Uyarma ışığı 560 nm ve kaydedilmiş bir floresan ışık 610 nm bariyer filtre (a Schott RG610) geçirildi ve bir orta dalga boyuna sahip bir dikroik ayna tarafından hazırlama yansıtılmıştır. Işık yoğunluğundaki artış ve en iyiye yakın monokromatik uyarma dalgaboyu kullanımının kombine etkisi önceki ölçümleri 6 kıyasla yaklaşık 50 kat gerilim görüntüleme duyarlılığı dramatik bir gelişme oldu.
1.2 Adım. Üniforma aydınlatma için ayarlama
Bir floresan slayt standart (yeşil uyarma / kırmızı salma) kullanın. CCD doymuş değil böylece lazer ışını yolu uygun nötral yoğunluk filtreleri takın. Yüzeyinde hedef Odakslayt. Lazer başlatıcısı objektif önünde kuvars ışık kılavuz alma ucunun konumunu ayarlayın ve elde etmek için epi-floresan kondenser üzerindeki uygun aktüatörleri kullanarak mikroskop bağlı ışık kılavuz çıktısı sonu konumunu ayarlamak merkezli ve üniforma görüş alanının aydınlatılması.
1.3 Adım. Titreşim gürültü belirleme
Floresan kayar yüzeyi üzerinde bir küçük siyah mürekkep işareti koyun. Sürekli kayıt modunda NeuroCCD ile Tutanak ışık şiddeti. Siyah mürekkep işareti karanlık bir kenarında objektif odaklanın. 2 kHz kare hızında yaklaşık 100 msn için ışık yoğunluğu kaydedin. Üniform aydınlatılan alandan ve mürekkep işareti kenarındaki ~ 20 piksel arasında ışık alma ~ 20 piksel arasında kesirli ışık yoğunluğunu izleri (hızındaki / F) mekansal ortalama görüntüleyin. Yüksek kontrastlı kenarları piksel kayıtlarında aşırı gürültü titreşim gürültüsü yansıtırsistem.
1.4 Adım. Titreşim izolasyonu
Bu deneysel kayıt koşullarına karşılaştırılabilir ışık şiddetlerinde atış gürültü altında bir seviyeye bir titreşim izolasyonu tablosunu kullanarak titreşimleri azaltmak için zorunludur. Görüntünün keskin kenar kapsayan piksel ışık yoğunluğundaki titreşim gürültü ihmal edilebilir kadar titreşim izolasyonu masa ayarlayın. Hareketli parçaları (mekanik panjurlar, fanlar) ile ekipmanlardan hiçbiri masaya monte edilebilir. Titreşim izole olmayan diğer bileşenlere bağlı masaya donanımdan gelen kabloların mikroskop mekanik titreşimlerin iletimi olmadığı gevşek öyle olmalı.
2. V m-Imaging için Uygun Nöron seçimi
2.1 Adım. Nöronların seçimi
Standart prosedürlere göre beyin dilimleri olun. I tek tek sinir hücreleri EGFP ifade bir fare hattı kullanınfaiz. Bir dönen diske konfokal sistemi ile, dilim EGFP etiketli nöronlar görselleştirmek. Bozulmamış aksonal / dendritik ağaçları ile V m-görüntüleme için nöronlar seçin ve süreçlerin dilim yüzeyine paralel ve yakın çalışan. Akson ve ince dendritler, çoğunlukla, DIC mikroskop modunda görünür değildir çünkü bu wild-tip farelerde başarılı olamaz.
3. Voltaj duyarlı Boya ile yüklüyor Nöronlar
3.1 Adım. Yama pipet Dolum
Elektrot konik 2/3 'ü kadar yaklaşık 15 s için negatif bir basınç uygulayarak boya serbest hücre içi solüsyon ile ikinci ucu cam pipet yama doldurun. Uç boya serbest çözelti eşiğe artar ve önemli ölçüde sinyal gürültü oranı azalır dilim üzerine boya dökülme önlemek için gereklidir. Çözünmüş Membran geçirgenliği olmayan voltaj duyarlı boya JPW3028 içeren solüsyonu ile elektrot Back-dolguHücre içi çözelti (0.8 mM).
JPW3028, hücre içi uygulama için en çok başarılı gerilim probu, yine mikroenjeksiyon için kullanılmak üzere yeterince çözünür su lipofilik stiril boyaların ANEP dizi iki kat bir pozitif yüklü bir analoğudur. Bu boya di-etil analog ve hemen hemen aynı özellikleri (voltaj-duyarlılık dahil olmak üzere) ve JPW1114 (bkz. Tablo 1) gibi ticari olarak temin edilebilir. Biz distile H 2 O 20 mM stok solüsyonu hazırlamak Stok çözelti 50 ul hacimde -20 ° C de donduruldu tutulur 0.8 mM nihai konsantrasyon boya için, stok solüsyonu 2 ul deney gününde hücre içi çözelti 50 ul içinde çözülür. Stok boya çözeltisi sabittir ve birkaç ay süreyle oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. Bu tükenene kadar Böylece, oda sıcaklığında bir 50 ul kısım tutun.
3.2 Adım. Hızlı bir giga-mühür Kurmak
Patch daha önceden seçilmiş bir nöron ve 20-45 dakika süreyle tam hücreli yapılandırma soma bir somatik yama pipetle boya serbest difüzyona izin. Bu uç boya serbest çözelti miktarı küçük tutulabilir, böylece mümkün olduğu kadar hızlı bir mühür elde etmek için gereklidir. Elektrot boya kullanılmadan hızlı yama uygulayarak başlayın. Çevreleyen doku kirlenmesine olmadan uç boya içermeyen çözüm kullanarak az miktarda amacı ile boya ile İleri, uygulama yama ve yükleme nöronlar. Uygulama ile, 1-2 dk içinde bir mühür kurmak mümkündür.
3.3 Adım. Boyama düzeyinin izlenmesi
Tam hücreli yapılandırmada boya difüzyon sırasında, akım-klemp modunda uyarılmış aksiyon potansiyelleri kaydederek nöronun fizyolojik durumunu izlemek. Ayrıca, 2 k bir kare hızında hücre soma gelen dinlenme ışık yoğunluğunu (RLI) kaydederek boyanma miktarını izlemek Hz ve nötral yoğunluk filtreleri (biz bir 400 mW lazer lazer ışık şiddetinin% 0.04 kullanan) ile düzeltilmiş tam ışık şiddetinin bir kısmını. Aksiyon potansiyeli elektrot boyutu ve direnç bağlı olarak genellikle 20-40 dakika sonra, genişletmek başlayana kadar boya yükleme işlemi devam edin.
Başak genişletilmesi tamamen geri dönüşümlü ve somatik membran boya doymuş konsantrasyonunun kapasitif yük etkisi nedeniyle büyük olasılıkla. Boya konsantrasyonu nöron boyunca dengelenmiş sonra başak dalga tam olarak geri kazanılır.
3.4 Adım. Boya elektrot çıkarın
Dönem boyanma sonunda, dikkatli bir şekilde dış çıkış yama konfigürasyonu için tüm-hücre geçiş işleminde elde edilmesini sağlamak voltaj kelepçesi konfigürasyonda soma uzağa yama pipet çekin.
3.5 Adım. Boya difüzyon bekleyin
ent "> nöronal işlemleri içine yaymak için voltaj duyarlı boya için izin vermek üzere, oda sıcaklığında ilave 1.5-2 saat için inkübe dilim. aksonal ve dentritik süreçleri, dalga içine soma uzak boya difüze önemli bir miktarda sonra AP tamamen restore edilmiştir.4. Optik Kayıt
4.1 Adım. Görüntüleme için hücresel bir bölme seçin
Düşük ışık seviyeli floresans ve yeniden yama DIC altında bir standart (hayır boya) yama elektrot ile nöron altında lekeli nöronun soma bulun. Voltaj görüntüleme için CCD sürekli kayıt modunda 10-40 Hz kare hızı düşük ışık seviyesinin altında nöronal süreçleri gözünüzde canlandırın. Ilgi nesnesi görselleştirmek için gerekli minimum nötral yoğunluk filtreleri ile ışık seviyesini azaltın. Biz lekeli nöronun konumlandırma sırasında 400 mW lazer yoğunluğu 0.01% kullanabilirsiniz. Bir XY tablası kullanma, t ilgi nöronal süreci konumlandırmakgörüntüleme alanının ortasına diye. Mikroskop kısmen kapalı alana durak iris kullanarak uyarma ışık soma koruyun. Yüksek yoğunluklu uyarma ışık soma Koruyucu anlamlı kayıt sırasında fotodinamik hasarı azaltacaktır.
Membran potansiyeli transientler ilgili 4.2 Tutanak optik sinyalleri Adım
Bireysel dendritik dallarında backpropagated AP'ler ilgili optik sinyalleri kaydedin. Akson AP'ler ilgili optik sinyalleri kaydedin. Dendritik dikenler aplar backpropagating ilgili optik sinyalleri kaydedin. Sinyali dalga doğru rekonstrüksiyonu için uygun kare hızları kullanın ve ağartma boya ve fotodinamik hasarı en aza indirmek için kayıt dönemleri ve yüksek yoğunluklu uyarma ışığa maruz kalma mümkün olduğunca kısa tutun. Örneğin, akson tek aksiyon potansiyeli oluşumu ve ilerlemesi sırasını inceleyerek 5-10 msn kayıt süreleri gerektirir. Uyarma ışık yoğunluklarıkayıt sırasında lik bir taraftan, sinyal-gürültü oranı ve boya ağartma derecesi ve diğer taraftan fotodinamik hasarı arasında bir uzlaşmadır. Biz çapı 300 mikron bir alan aydınlatılır aksonların uzun bölümler arasından kayıt 400 mW lazer yoğunluğu% 100 kullanmaktır. Uyarma ışık dendritik omurga görüntüleme için 30 mikron çaplı alana odaklandığı zaman, biz lazer ışık yoğunluğunu% 10-25 oranında kullanın. Kayıt gerekli süresinin optimum uyarma ışık yoğunluğu önemli bir belirleyicisi olduğunu; kısa kayıt süreleri daha yüksek ışık yoğunluğuna izin verir. Optimal ışık yoğunluğu en her bir hazırlama ve ölçüm ayarları için ampirik olarak belirlenir.
5. Veri Analizi
5.1 Adım. Bilinen hatalar için ham verileri düzeltin
Verilerin analizi ve gösterimi IDL (ITT Görsel Bilgi Solut yazılmış NeuroPlex programı (RedShirtImaging) kullanılarak yapılmıştıriyonları, Boulder, Colorado) ve özel bir Visual Basic yordamları. Düşük ışık koşulları altında, arka plan floresan hızındaki / F sinyalinin büyüklüğü önemli bir belirleyici olmaktadır. Ham veriler öncelikle dilim üzerinde bir boyanmamış alan belirlenen ortalama floresan yoğunluğu arka plan çıkarılması ile bu etki için düzeltilmiştir. Daha sonra, sinyal hizalama yazılım AP başlatma bölgesindeki zamansal kaymayı yanı sıra ortalama sırasında hazırlanması için olası küçük hareketleri için düzeltmek için kullanılmıştır. Zamansal etki alanında, AP sinyallerinin ortalama başlangıç (Şekil 1B) iktisap referans sinyali her denemede elektriksel olarak kaydedilerek AP çapraz korelasyon hale getirilmiştir. Mekansal etki alanında, görüntülerin hazırlanması olası küçük yanal hareketleri telafi etmek için görüntü çapraz korelasyon iki boyutlu çevrimdışı hizalanmış edildi. Z-boyut görüntünün doğru odaklama her duruşma öncesinde doğrulandı; smal l ayarlamalar çoğu zaman gerekli idi. Şekil 1B 'de gösterildiği gibi uzaysal ve zamansal olarak hizalanmış sinyalleri ortalamaları alınmıştır. Boya ağartma dolayı ışık yoğunluğundaki değişiklik yavaş yok uyarım (Şekil 1B) ile kayıt çalışmalardan elde edilen uygun bir çift üstel fonksiyon tarafından veri bölünmesi ile düzeltilmiştir. AP sinyalin dalga Kübik Spline İnterpolasyon, her veri noktası üzerinden geçen bir parçalı sürekli eğrisi kullanarak veri noktaları bir dizi yeniden inşa edildi. Voltaj-duyarlı boya sinyali milisaniye ölçeğinde önemli bir bozulma olmadan zar potansiyeli parça olduğunu doğrulamak için, soma elde edilen elektrik sinyali AP Şekil 3B 'de gösterildiği gibi bitişik akson tepecik ikinci optik sinyalin AP ile karşılaştırılmıştır. Iki sinyal optik kayıt atış gürültü için izin, çok yakından üst üste.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
Şekil 1. Veri analizi (Animasyon). (A) Üst panel: Kayıt pozisyonunda akson ile lekeli bir nöronun yüksek çözünürlüklü konfokal görüntü. Kayıt elektrot soma ve şematik olarak gösterilmiştir bazal dendrit yanındaki ekstraselüler uyarıcı elektrot bağlı. Aksiyon potansiyelleri ekstraselüler, sinaptik uyarılması tarafından uyarılmış. Alt panel:. V m görüntüleme için kullanılır (B) soma (siyah iz) den Elektrot kayıtları, AIS (kırmızı iz) dan optik kayıtları ve Ranvier düğümü (yeşil iz) den CCD ile elde akson düşük uzaysal çözünürlüğü floresan görüntü . Üst izleri: AP başlamasında zamansal jitter gösteren 9 çalışmalarda elde edilen ham veriler. Izleri İkinci sıra: zamansal sinyalleri hizalanır. Izleri Üçüncü satır: ortalamalı sinyali. Izleri Dördüncü satır: bleach düzeltme. Alt izleri: zamansal yumuşatma tek geçişe sahip kübik spline interpolasyon.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Başarılı konfokal mikroskopi dilim yüzeyine yakın ve odak bir düzlemde bulunan bozulmamış nöronal süreçleri net bir şekilde belirlenmesi izin vermelidir. Önce voltaj duyarlı boya yükleme gerilim görüntüleme için uygun olan sinir hücrelerinin seçimi önemlidir. Kortikal bir dilim (Crym transjenik fare çizgisi) olarak ifade EGFP L5 piramidal nöronların konfokal görüntüleri bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Bireysel nöronların akson açıkça görülebilir. Dilim yüzeyine yakın bir odak düzlem içinde bozulm...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makalede, alt-mikrometre ve alt milisaniyelik zamanmekansal çözünürlük ile bireysel nöronların elektriksel aktivitesini izlemek için bir voltaj duyarlı boya kayıt yöntemi açıklanır. Yakın optimum dalgaboyu (sinyal boyutu ile ilgili) de Lazer uyarılma ~ 50 önceki yaklaşımlar üzerinde bir faktör tarafından kayıt hassasiyeti artırıldı. Yürürlükteki duyarlılık dendritler, akson, akson teminatlar ve akson terminallerinin yanı sıra bireysel dendritik dikenler dahil bireysel nöronlar, her yerinden elektrik sinyalleri izler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Dejan Zecevic o LLC RedShirtImaging bir eş sahibi., Voltaj duyarlı boya kayıt kullanılan yüksek hızlı, düşük gürültü CCD kameralar konusunda uzmanlaşmış bir şirket olduğunu beyan eder. Diğer tüm yazarlar hiçbir mali çıkarlarının veya geçerli çalışma ile ilgili potansiyel çıkar çatışmaları rapor.
Biz işbirlikçileri nazik boyalar sağlamak için bu tekniğin ilk geliştirme yanı sıra Leslie M. Loew katıldı Knut Holthoff, Arthur Konnerth ve Marco Canepari minnettarız. NSF hibe IOS-0817969, NIH hibe NS068407 ve M136043 tarafından ve Yale Üniversitesi Nörobilim Kavli Enstitüsü tarafından desteklenir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bileşenin Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Kurulum bileşenleri | |||
| Upright Mikroskop | Olympus A.Ş. | BX51WI | Üç kamera yuvaları ile |
| Motorlu Hareketli Sahne | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Olympus BX51 için Epi-floresans Kondenser | Fotonik KADAR | 0000-560-11659 | |
| Upright Mikroskop | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | Üç kamera yuvaları ile |
| Motorlu Üst Plaka | Scientifica Sınırlı | MMBP | |
| Zeiss AxioExaminer için Epi-floresans Kondenser | Fotonik KADAR | ||
| Veri Toplama Makinesi | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | Yüksek hız, düşük okuma sesi |
| IR-DIC için CCD | Dage-MTI | IR-1000 | |
| İplik-Disk Konfokal Tarayıcı | Yokogawa | CSU-10 | |
| Konfokal Tarayıcı Yüksek Uzaysal Çözünürlük CCD | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 piksel |
| DPSS CW Lazer (532 Nm) | CNI Optoelektronik Tech. Co, Ltd | MLL-III-532 400mW | Uyarma ışık kaynağı |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Işık Kılavuzu | Fotoğraf KADARNIC | 0000-515-11524 | |
| Panjur | Vincent Associates | LS6 | |
| Titreşim İzolasyonu Tablo | Eksi k Teknolojisi | MK26 | |
| Belirli reaktifler | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Yaşam Teknolojileri | D-6923 | Gerilimi hassas boya |
| Crym-EGFP Fare Hattı | GENSAT (MMRRC) | STOK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd | Seyrek Katman 5 kortikal nöronlarda EGFP ifade |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste