Üretimli kas dokusu hastalığı modeli olarak hem de eti için alternatif bir kaynak olarak, rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahiptir. Burada fare miyoblast projenitör hücreleri ve elektrik sinyalleri tarafından uyarılması, bu durumda, bir kas yapısının mühendislik açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular
Bu makalede
Özet
Özet
Engineered kas dokularının ve rejeneratif ilaç için bir alternatif et 1. basınç ülserleri çalışmak için in vitro olarak örneğin, bir hastalığın örnek olarak kullanım için dokuların üretimi, dahil çeşitli farklı amaçlar için kullanılabilir. İlk rapor 3D kas yapıları yıllar önce yapılan ve alanında öncü Vandenburgh ve arkadaşları 2,3 olan oylandı. Kas doku mühendisliği alanındaki ilerlemeler biyokimyasal faktörler, kök hücre ve progenitör hücrelerin bilgisi engin kazanç gelen sonuç değil sadece, ama fiziksel faktörlerin hücre davranış kontrolünde önemli rol oynadığı araştırmacılar tarafından kazanılan öngörüleri özellikle tabanlı olan ve doku gelişimi. State-of-the-art mühendislik kas anda hücre nüfuslu hidrojel yapıları oluşur oluşturur. Bizim laboratuvarımızda bu genellikle C2C12, mil murin arka bacak kasları izole sıçan miyoblast progenitör hücreleri, ya da bir fare miyoblast hücre hattı oluşurkollajen / Matrigel oluşan bir karışım ile Duran ve iki ankraj noktası arasındaki kaplama, kas bağları taklit. Diğer hücrelerin yanı gibi L6 sıçan miyoblastları 4, yenidoğan kas kaynaklı progenitör hücreleri 5, insan 6 hatta indüklenen pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) 7 gibi diğer türlerden erişkin kas dokularının türetilen hücreler olarak örneğin alternatif hücre hatları kabul edilebilir . Hücre kontraktilite yapı 8,9 ve kültür yaklaşık bir hafta sonra kas progenitör hücrelerin farklılaşma uzun ekseni boyunca hücre hizalama yapar. Dahası, elektrikli uyarım uygulama ölçüde 8 farklılaşma sürecini geliştirmek olabilir. Çünkü sınırlı boyutu (8 x 2 x 0,5 mm) tam doku örneğin canlılığı, farklılaşma ve hücre hizalama izlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilebilir. Söz konusu uygulamaya enginee için gereksinimleri bağlı olarakkırmızı kas dokusu değişecektir; diğer türler için bir et alternatif çeviri gerekli olarak hizmet ederken rejeneratif tıp örneğin kullanımı, doku boyutu ve vaskülarizasyon yukarı ölçeklendirme gerektirir.
Protokol
1. Mürin myoblast Progenitör Hücreleri veya C2C12 Hücre Kültürü
- Başlangıçta Shefer ve arkadaşları 10 tarafından yayımlanan ve Collins et al. 11 ve Boonen ve ark. 12 göre adapte protokolüne göre hücreler izole ve sıvı azot içinde bu saklayın. Bu fareler, örneğin, C57BL / 6 gerektirir. Alternatif yöntemler örneğin Li, Y ve arkadaşları ile görselleştirilmiş Deney yayınlanan bir yöntemi, diğer laboratuarlarda kullanılmaktadır. 13. Reaktifler ve cihazlar için, sayfa 7 ve 8'de verilen tabloda verilir. Tek bir fare kas itibaren genellikle sıvı azot içinde yaklaşık 20 şişeleri cryopreserve yeterli hücre elde edecektir. Sonra, sıvı azot depolama hücrelerinin çözülme için protokol başlar.
- 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) kaplanmış doku kültürü şişesi içine 1 şişeden hücrelerin yerleştirin ve oluşan büyüme ortamı (GM) (335 ml DMEM gelişmiş, 100 ml cenin bovin eklemeke serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml L-glutamin, 5 ml tavuk embriyo özü (OA)).
Not: Oda sıcaklığı az 2 saat süreyle ceket ve aspirasyon ile Matrigel çıkarın.
- Hücrelerin yaklaşık olarak 3 gün boyunca her 01:03 alt kültür.
Bu şu anlama gelir: 3. gün: biri 75 cm 2 balon iki 150 cm 2 matara (kaplamasız şişeler preplating 30 dk) geçişi hücreleri: günde 6, 75 cm 2 balon bir 25 cm 2, gelen Passage hücreler. Günde 9 tek transfer 150 cm 2 balon üç 150 cm 2 matara (gerekirse preplate tekrar hücrelerin fenotipi bağlı olarak) kullanılamayabilir 1 üçlü 150 cm 2 balon veya eğer. Günde 12 hücreleri kas yapı içine tohum hazır bulunmaktadır.
Notlar: - Üçlü 150 cm 2 başına hücre sayısı yaklaşık 4,5 x 10 6 hücre olacak.
- Via kullanınfarklı izolasyonların gelen ls ekimi sırasında hücre karışık bir nüfus elde etmek karıştırın.
Not: birincil piller ile çalışmak istemezseniz, C2C12 miyoblastları iyi bir alternatiftir.
2. Mühendislik İskelet Kası Dokular
- "Sertleştirici" (10:1) ile "elastomer" karıştırılarak silikon yapıştırıcı hazırlayın. Tek üçgen tarafı (; Şekil 1 şekil ev gibi) ile Velcro 5 mm kare bölümler + / - Kes. Kare arasında yaklaşık olarak 12 mm arasında bir boşluk bir 6-kuyulu kültür plakasının kuyu içine Tutkal Velcro.
Notlar: - Sadece Velcro yumuşak tarafı kullanın ve bu yan yukarıya dönük.
- Çatıları birbirine baktığından emin olun.
- Sadece silikon yapıştırıcı ile Velcro kapak, iyi boyunca tutkal yayılır yok.
- Daha sonra elektriksel stimülasyon için bu iyi bir maç dikey yönde yapıları hizalamak alakalı(uzun ekseni boyunca) yedik.
- Vakumlu fırın içinde gece boyunca kurumaya bırakın, ısıtmalı değil, öncelikle hava kabarcıklarını çıkarmak için. 15 dakika için inkübe kuyuları ve% 70 EtOH ilave edilerek sterilize edin. PBS ile 3x durulayın ve 15 dakika UV altında koymak. Kuyulardan tüm PBS ve kullanıma kadar kuvöz Velcro ve yer çıkarın.
- Buzdolabında Matrigel çözüm çözülme ve kısa süre 3D yapıları yapmadan önce istenilen konsantrasyona kollajen solüsyon hazırlanır. Steril% 0.02 asetik asit (nihai konsantrasyon 3.2 mg / ml) ile stok kollajen seyreltilir.
Not: buz üzerinde her şeyi bırakın.
- GM ve sayısında tekrar süspansiyon hücreleri, Trypsinize. Inkübatör santrifüj tüpündeki hücreler bırakın.
- Bu kollajen çözüm 0.5M NaOH ekleyin, bir tüp (Tablo 1 'e göre) yapmak istediğiniz yapıları numaraları için Kollajen stok solüsyonu istenilen miktarda Ekle açık pembe Colo kadarr 7,5 arasında bir pH değerine işaret etmektedir. Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve kabarcık oluşumunu önlemek. Sonra Matrigel ekleyin ve yavaşça ama iyice çok karıştırın. Nihayet, Kollajen / Matrigel karışımı (uygun miktarlarda için Tablo 1'e bakınız) için GM ekleyin.
Notlar: - buz üzerinde her adımı gerçekleştirin! Matrigel ve kollajen artan sıcaklıkta kolayca jel olacaktır.
- Rengi aslında pembe olduğunu dikkat! PH seviyesindeki artış da hızlı jelleşme neden olacaktır.
Kollajen - nihai konsantrasyon: 1.6 mg / ml.
- 5 dakika için 1000 rpm'de hücrelerin istenen miktarda santrifüjlenir ve süpernatant çıkarın.
Not: - yapı başına hücre sayısı ayarlanması gerektiğinde hücre faaliyeti bağlı olarak değişir. Tipik olarak, hücre sayısını yapı başına 750,000 ila 1,250,000 hücreler yer alır.
- Hücre pelet tekrar süspansiyon jel karışımı bazı kullanınve kalan karışımı içine hücreleri aktarmak ve iyice karıştırın, ama hava kabarcıkları tanıtan olmadan.
- Kuvöz ve pipet Velcro ilk içine hücre jel karışımı 0.35 -0.4 ml ısıtılmış kuyucuğu çıkarın. Ardından, ek siteler arasında merkezine karışımı Pipeti ve Velcro uzatmak başlar. Son olarak, Velcro parçaları etrafında iki Velcro çapa ve pipet arasındaki boşluğu doldurmak için jel kalanını da kullanabilirsiniz.
- Jeller aktarılacak yeterince sağlam olup olmadığını dikkatlice 5-10 dakika sonra kontrol edin, yani hafifçe yemekleri dokunun ve jel katı ise görsel inceleyin. Eğer öyleyse, bir inkübatörde yemekleri dikkatle yerleştirin. Genellikle, onlar on dakika sonra alınabilir. Daha sonra, 1-2 saat sonra, yavaşça sıcak GM 4 ml her biri jel üzerinde görüntülenir.
Not:-Do tabak tutarken güçlü hareketleri yapamaz.
- (Büyüme ortamında farklılaşma, orta GM değiştirincivciv embriyo özü olmadan) 24 saat sonra, ve taze orta 2-3 günde bir ile değiştirin. Gün 7 sitesinde sigortalı kas liflerinin çapraz çizgili gelişimi için boyama ile değerlendirilebilir gibi, olgun odaklı kas liflerinin elde olmalıdır.
3. Elektriksel Stimülasyon
- Bir güvenlik kabininde UV altında% 70 etanol ve sonra kuru kullanmadan önce ionoptix plaka elektrotlar (reaktifler ve ekipman tabloya bakınız) sterilize edin. Yapıları ile kültür plaka üzerine elektrotlar ile plaka yerleştirin ve kültür plaka ve bir inkübatöre transfer kapağı ile kapatın. Kablolar ile uygun Ionoptix C-pacer bağlayın.
Not: Elektrotlar kas yapı (Şekil 2) ile birlikte paralel olarak yerleştirilir.
- Beklendiği gibi stimülasyon protokolü uygulayın.
Not: Biz genellikle, 4 V / CM kullanın2Hz bir frekansta 6ms bakliyat. Kültür ortamı uyarılma sırasında her 24 saat değiştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Son ürün olarak Şekil 3 'de gösterilen kas yapı olacaktır. Doku büyüklüğü yaklaşık 8 mm uzunluğunda, 2 mm genişliğinde ve 0,5 mm kalınlığında olacaktır. Farklılaşması sırasında elektrik stimülasyonu miyozin ağır zincir izoform ifadesi değişecektir, ancak farklılaşma orta 8 ile uyarılan olarak büyük ölçüde farklılık sürecini geliştirmek değil, aynı zamanda elektrik stimülasyonu kas işlevselliğinin kontrol etmek için işlem sonunda uygulanabilmektedir çünkü, tam gelişmiş sarkomer ile kas elektriksel da...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kas dokularının mühendislik rejeneratif tıpta ilaç tarama için bir hastalık modeli olarak ve et üretimi için kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, bu tür uygulamalar için gereksinimleri değişir. Kollajen hücre hizalama sağlar çünkü önceki 2B çalışmaları 12 yılında belirlenen miyoblast progenitör hücreler bazal membran kaynaklı proteinlerin varlığını gerektirir çünkü, kollajen ve Matrigel kombinasyonu ile çalışmayı seçti. Ayrıca, fibrin jel bizim laboratuvarda test ve kollajen ve ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Teşekkürler
Yazarlar kültürleme Şekil 2'de sunulmuştur dokular için Yabin Wu teşekkür etmek istiyorum, resmi Bart van Overbeeke tarafından çekildi. Iş mali SenterNovem, hibe ISO 42022 tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Matrigel-büyüme faktörü azalır | Beckton ve Dickinson | ||
| DMEM (yüksek glukoz) * | Gibco | 42430 | |
| Gelişmiş DMEM | Gibco | 12491 | |
| At serumu | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovin serumu | Greiner | 758075 | |
| 0.45 ve 0.22 mikron şırınga filtresi * | Whatmann (Schleicher ve Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamin | Gibco | 25030024 | |
| Penisilin / streptomisin | Gibco | 10378016 | |
| Amfoterisin | Gibco | 15290-018 | |
| Kültür plastik | Greiner | Kültür şişeleri ve pipetler içerir | |
| Civciv embriyo özü | Amerika Birleşik Devletleri Biyolojik | C3999 | |
| Pasteur pipeti * | Hilgenberg | Pamuk, açık ucu L daralma ile Pasteur pipetler,: 0,9 ucu çapı 230 mm - 1,1 mm | |
| Pasteur pipeti * | Hilgenberg | Pamuk, açık ucu L daralma ile Pasteur pipetler,: 1,4 ucu çapı 230 mm - 1,6 mm | |
| Pasteur pipeti | VWR | 612-1702 | |
| Kollajenaz tip I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 mikron hücre süzgecinden * | BD Falcon | 352340 | |
| 19G iğne | |||
| Elastomer | Dow Corning şirketi | 3097358-1004 | Silastik MDX 4-4210 # |
| Ajan Kür | Dow Corning şirketi | Silastik MDX 4-4210 # | |
| Velcro | Düzenli mağaza | Siz düzenli bir mağazasında bu satın alabilirsiniz, sadece yumuşak tarafı kullanın | |
| Kollajen tip I, sıçan kuyruğu | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Kültür Pacer | Ionoptix | ||
| Elektriksel uyarım için 6-kuyulu kültür tabaklarında | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon # 353846 | |
| C-Bulaşık kültür çanak elektrotlar | Ionoptix | ||
| * Hücrelerin izolasyonu (puan 1.1) için ihtiyaç duyulan # Birlikte tek bir kit içerisinde |
Kaynaklar
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
