Yöntem makalesi

Mürin Norovirüs için Plak Testi

58.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4297

⸱

22 Ağustos 2012

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan, Ann Arbor

Bu makalede

Özet

Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Özet

Mürin norovirusa (MNV) verimli doku kültürü 1, 2 yetişir Norovirüs cinsinin tek üyesidir. Hücre parçalama ve sitopatik etki (CPE) fare dendritik hücreler veya makrofajlar 1 MNV-1 enfeksiyonu sırasında görülür. MNV-1 Bu özellik, bir plak deneyi 1 gerçekleştirerek, belirli bir örnek içinde bulaşıcı maddelerin sayısını ölçmek için kullanılabilir. Plak tahlil olmuş akyuvarlar ve plaklar 3 olarak adlandırılan bir birleşik hücre monolayer, delik oluşturmak için MNV-1 yatmaktadır.

Birden çok doku kültürü teknikleri, hasat edilmiş doku, klinik, çevre örneklerde viral enfeksiyonların tespit etmek için kullanılır, fakat hepsi değil ölçü bulaşıcı parçacıklar (örn. qRT-PCR). Edilebilir Bulaşıcı virüs parçacıkları ölçmek için bir yolu, aşağıda daha detaylı olarak tarif edilecektir bir plak deneyi 3, gerçekleştirilmesidir. MNV plak tahlil bir varyasyonu flor olduğunuMNV antijen hücre mono tabakaları 4 immunohistokimyasal edilir escent odak tahlil. Viral antijen ekspresyonu plak oluşumu önündeki tarihi Bu testte, daha hızlı olabilir. Aynı zamanda, plak oluşturan yapamaz virüs titrasyonu için yararlıdır. Ancak, floresan odak tahlil gibi antikorlar ve odak oluşturan birim saymak için bir mikroskop gibi plak testin ötesinde ek kaynaklar gerektirir. Bulaşıcı MNV ayrıca% 50 Doku Kültürü Enfektif Doz (TCID 50) 3 belirlenerek ölçülebilir. Bu tahlil, uç 5 ile titrasyon aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarını ölçer. Ancak, algılama sınırına bir plak tahlil 4 ile karşılaştırıldığında daha yüksektir.

Bu yazıda, etkili biyolojik ya da çevresel numuneler 1, 4, 6 mevcut bulaşıcı MNV parçacıkların sayısını belirlemek için kullanılabilecek bir plak tahlil protokol açıklar. Bu yöntem olup baizin veren hücreler (RAW 264.7 mürin makrofaj hücreleri) bir tek tabaka aşılamak için kullanılır MNV ihtiva eden numuneler, 10-kat seri seyreltiler hazırlanması sed. Virüs zaman belirli bir süre için hücre mono tabakasında bağlanmasına izin verilir ve daha sonra agaroz ve hücre kültür ortamı bir karışımı hücreleri kapsayan önce aspire edilir. Soğuk bir şekilde yer alan hücrelere yaymak sınırlandırarak agar komşu hücreler, viral soy yayılmasını sağlar. Sonuç olarak, enfekte olmuş hücreler lize ve mono tabakasında deliklerin şekil plaklar olarak bilinir. Virüsün yeterli yayılması üzerine, plaklar nötr kırmızı, metilen mavisi veya kristal viyole gibi boyalar ile hücrelerin görünür aşağıdaki boyama olur. Düşük dilüsyonları, her plak komşu hücrelere yayılmış tek bir bulaşıcı viral partikül ve döl, kaynaklanır. Böylece, plakların sayısını sayma biri seyreltilmemiş numune 3 mevcut plak oluşturan birim (PFU) hesaplamak için izin verir.

Protokol

1. 264.7 RAW Makrofaj Hücre Hattı ekimi

  1. % 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (<10 EU / ml) ile yüksek glikoz DMEM oluşur DMEM-10 ortamı içinde RAW 264.7 hücreleri (ATCC, katalog # TIB-71), 10 mM HEPES bakımı , 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin. Hücreler tipik olarak şişesi başına ortam 35 ml içeren 175 cm2 doku kültürü şişeleri içinde muhafaza edilmekte ve 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde CO2. Ancak, herhangi bir boyut şişenin şişenin boyutu için uygun bir ortam hacmi ile de kullanılabilir.
  2. Hücreleri ayırmak için: eski medya kapalı aspire hücrelere taze DMEM-10 ortamı 10 ml eklenir, sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin alt hücreler kazıma. Sonra, bir 10 ml pipet içine hücreleri çizerek homojen bir çözelti içine hücreleri tekrar süspansiyon ve zorla pipet pr hücreleri sıkmaşişenin dibine Essed. En az 3 kez hücreler artık yığın birlikte böylece bu işlemi tekrarlayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde edildiği ışık mikroskobu ile kontrol edin. Yeni bir 175 cm 2 şişesine hücre süspansiyonu 2 ml (1:5 seyreltme veya ~ 2x10 7 hücreleri), ve medya son hacim kadar getirmek - Sonra 1 ml (1:10 seyreltme veya ~ 1x10 7 hücreleri) aktarmak 35 ml.
  3. Bölünmüş hücreleri (~ 1x10 8 hücreleri total/175 cm 2 matara) neredeyse konfluent zaman: 1:5 seyreltme ile başlayan eğer 1:10 seyreltme, ya da her iki gün ile başlayan üç günde eğer. Yarma hücreleri önce hücre morfolojisi kontrol etmek için ışık mikroskobu kullanın. Hücrelerin çoğu yuvarlak bakmak ve aktif olmamalıdır. Aktif hücreler cılız morfolojisi ekleri ile, granül ve / veya genişletilmiş var. Bu hücreleri genellikle plak yok gibi hücrelerin sarmak izin vermeyin. Geçit sayısı takip edin ve sık sık hücrelerin bir alt geçit kısım eritilmesi ile başlamak. (Biz bir cut-off olarak geçit 30 kullanın).

2. MNV İnokulum RAW 264.7 Hücreleri Infect

  1. Tohum RAW 264.7 1x10 6 canlı hücre / DMEM-10 ortamı içinde ml 'lik bir yoğunlukta 6 oyuklu plakalar (3.5 cm çapında) içine hücreleri, ve her bir kuyu için bu süspansiyon 2 ml ekleyin. Bu el en az 10 kat plakaları sallama ile ya da yaklaşık 10 dakika için bir sallanan tertibatım kullanarak ya da eşit bir şekilde kuyu hücrelere yaymak için önemlidir. Girdap plakaları bu kuyunun merkezinde küme hücreleri neden olur gibi yapmayın. Sıra plakalar bir doku kültürü kuluçka makinesi içine (37 ° C ve% 5 CO2). Hücreler 37 ° C de bir gece boyunca ya da en azından 4 saat için takmak için izin Hücreler 60 olmalı -% 80 plak tahlil için birleşik ve iyi boyunca eşit olarak dağıtılır.
  2. Ertesi gün, doku kültüründe MNV-enfekte hücreleri veya MNV-enfekte farelerde Homojenize dokularda veya dışkı örneklerinden olabilir virüs inokulum hazırlamak. doku örnekleri kullanılarak, bezelye büyüklüğünde pidoku eces bir doku homojenleştirici (; Roche örneğin MagnaLyser) kullanılarak DMEM-10, 1 ml steril silis boncukları ihtiva eden 2 ml vidalı kapak tüp içinde homojenize edilir. Dışkı numuneleri için, en fazla 3 fare pislikleri 1 ml ortam içinde homojen hale getirilmelidir. Tüm numuneler sonra dondurulan (-80 ° C'de) ve plak tahlil yapmadan önce bir kez çözdürülmelidir edilir.
  3. DMEM / yüksek glukozlu,% 5 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (<10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 oluşan tam bir DMEM-5 ortam içinde virüs inokulum 10 kat dilüe U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin.
  4. On-kat seri seyreltiler, 24 oyuklu plakalar olarak hazırlanmıştır: Bir yükseltici pipet çoklu kuyu içine 1.35 ml ortam dağıtmak için kullanılır, 10 -1 seyreltme ortamı 1.35 ml, virüs ihtiva eden numune 0.15 mL karıştırılması ile yapılmıştır ve daha sonra 10 -1 seyreltme 0.15 mi 10 -2 dilutio etmek için ortam 1.35 ml ilave edilirn ve böyle devam eder. Bu ipuçları yeni bir seyreltme yapmak her zaman değiştirmek için önemlidir. Bir çok kanallı bir pipet kuyu başına 0,15 ml 'lik bir toplam hacim (Şekil 3A bakın) transfer eden bir 24-kuyulu plakanın iyi birine uygun iki uç ile aynı anda birden fazla numune seyreltmeler yapmak için kullanılabilir.
  5. Doku homojenatlarında ve fekal içerik için tipik bir seyreltme aralığı 10 -1 10 -3 olduğunu. Bununla birlikte, bu örneklerden doku kültür plakları örnekleri ile karşılaştırıldığında daha küçük olma eğilimindedir. Ayrıca, bazı durumlarda, dışkı örnekleri, 1:100 dilüsyon böylece plaklar saymak için engellemektedir, yeterli derecede tek tabakalı hücre bozabilir dışkı herhangi bir zehirli bileşenleri sulandırmak için gereklidir. Doku kültürü lizatları seyreltme aralığı virüs ömrü çevrimi esnasında ilgi zaman noktasına bağlıdır. 10 -9 kadar gitmek Dilüsyonlar enfeksiyon zirvesinde gerekli olabilir.
  6. Seri dilüsyonları hazırlandıktan sonra, 6-well plakasındas örnek adını ve kaplama olmak dilüsyonları ile RAW 264.7 mono tabakaları (bölüm 2.1) içeren. Bir seferde bir tabak, dışarı Flicking veya aspire tüm ortamı çıkarın. Hemen ardından bir seyreltilmiş örnek 0,5 ml ekleyin, iyi, sonra bir sonraki seyreltme geçmeden önce, yinelenen bir de tekrarlayın. Tüm 3 dilüsyonları tüm hücreleriyle kaplanmış oylandı sağlamak için elle ileri geri bir plaka, eğim plaka eklenir sonra. Hücrelerin kurumasına olmayacak emin olmak için bir kerede bir tabak tutun.
  7. Her bir kuyucuğa seyreltmeler ve 0,5 ml eklendikten sonra, dikey plakaları üst üste ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya onları. Hacim, her bir oyuğa ilave tamamen tek tabakalı karşılamak için yeterli olmadığı için, plakalar nazikçe yandan her 10-15 dakikada tarafından ileri geri hareket ettirildiğinde veya bir sallama cihazı (dakika başına ~ 18 salınım) üzerine yerleştirilmesi gerekir. Bu kurumasını hücrelerini engeller.

3. Düşük Erime Noktası Agaroz (SeaPlaque) Overlay Hazırlık

Not: otoklavlanmış SeaPlaque agaroz ile birkaç şişe olması önerilir vaktinden hazırlanmıştır. Agaroz kullanmadan önce bir mikrodalga yeniden eritilebilir.

  1. 1 saat inkübasyon işlemi tamamlanmadan önce levha toplam hacim için gereken kaplama miktarını hesaplar. Gerekli hacim / de veya 12 ml/6-well plakası 2 ml. Agaroz (bkz. bölüm 3.2) ve ayrıca medya (bkz. bölüm 3.3) hazırlayın.
  2. Agaroz hazırlamak için, bir cam şişe içinde, damıtılmış su (% 3 w / v) ve 100 ml 'lik bir toplam hacim içinde SeaPlaque agaroz 3 g askıya. 20-30 dakika süreyle otoklav. (Agaroz zaten mikrodalga yeniden erime agaroz-elden önce hazırlanan varsa.) Bu agaroz çok sıcak ise ° C Kullanmadan önce bir su banyosunda, bu hücreleri öldürecek çünkü 42 SeaPlaque agaroz dengelenmesi önemlidir. Su seviyesi istenmeyen katılaşma önlemek için agaroz düzeyine eşit veya üzerinde olduğundan emin olun.
  3. Ortam hazırlamak için: oluşur 2x MEM medya, 100 ml olun2x MEM,% 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (<10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 4 mM L-glutamin. ° C su banyosunda 37 medya dengelenmesi.
  4. Enfekte hücre mono tabakaları üzerine yayılmış hemen önce, bir 1:1 oranında SeaPlaque agaroz ve bir steril şişe içinde bir araya 2x MEM ortam hem de karıştırılır. Fazla 200 ml paylaşımı gerekiyorsa, bölünmüş çok sayıda şişe içine hacmi ve 37 tutmak ° C su banyosunda kullanıma hazır oluncaya kadar.
  5. 1 saat inkübasyon (bölüm 2.7 'e bakınız) sonunda her kuyunun inokulum kapalı aspire. Yavaş yavaş her çukurun duvarına pipet koyarak her bir kuyunun kenarına bindirme 2 ml ekleyin. En fazla 5 plakalarına hücrelerin kurumasına fırsat vermeden aynı anda işlenebilir.
  6. Bindirme doku kültürü inkübatör içine dik plakaları koymadan önce oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika katılaşmasını bekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de 48 saat boyunca levhalar inkübe edin.
  7. Sonrakuluçka dönemi, plaklar çıplak gözle belli belirsiz görünür, bu yüzden plak varlığı için boyanmamış plakaları kontrol edin. Plak yok görünmüyorsa, ek 4 saat boyunca inkübe ve tekrar kontrol edin. Bununla birlikte, en fazla 72 saat inkübasyon süresi geçmemelidir.

4. Neutral Red Boyama tarafından Plaketlerinin Görselleştirme

  1. , - 1 x PBS, 97 ml (doku kültürü derecesi, Mg 2 + etmek; plaklar görselleştirmek için, nötr kırmızı boyama çözeltisi nötr kırmızı, 3 ml (Sigma, katalog # N2889 DPBS içinde% 0.33 w / v) ilave edilmesi ile hazırlanır Ca 2 + - ücretsiz; Gibco, katalog # 10010). 12 ml nötr kırmızı boyama çözeltisi her bir 6-plaka için gereklidir: deney için gerekli olan nötür kırmızı boyama çözeltisinin hacmi hesaplayın. Ardından, her bir kuyucuğa 2 ml ekleyin. Bazı plak tahlil protokolleri agaroz fişi kuyulardan çıkarılması gerektirmesine rağmen, bu protokolde nötral kırmızı boyama çözüm bindirme doğrudan eklenir.
  2. Bir saat sonra birplaklar hala kuyularda nötral kırmızı boyama çözeltisi ile görünür durumdaysa 37 ° C'de cubation, kontrol edin. Plaklar kolaylıkla görünür değil iseniz, boyama başka bir saat boyunca devam etmesine izin verin. Plaklar görebilir kadar kuluçka devam edin. (Not:. Fazla 3 saat boyunca Boyama optimal değildir ve hiçbir plaklar boyanma 3 saat sonra pozitif kontrol örneği görünür ise, plak tahlil düzgün çalışmadı) boyama tamamlandıktan sonra, nötral kırmızı boyama çözüm aspire , agaroz fiş sağlanması rahatsız ve sonra plaklar sayma devam edilmez.
  3. Bir ışık kutusu üzerinde baş aşağı plakası yerleştirerek ve yinelenen sayar önlemek için sayılır plaklar üzerinde bir nokta işaretleyerek plaklar sayın. (Birlikte plaklar füzyon hiçbir görsel kanıtlar yani) plaklar açıkça ayrılır kuyularda plaklar saymak için seyreltme seçin. Eğer mümkünse, iki dilüsyonlarda plaklar sayılır. O plak boyutu MNV suşları, virüs inokulum arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir, ve bağlıdırplak tahlil sırasında RAW 264.7 hücreleri koşulu.
  4. Plak yok, iyi görünür, her iki numune içinde mevcut herhangi bir virüs ya da virüs miktarı plak tahlil saptama sınırının altında olduğunu olsaydı. Bu durumda, diğer plaka kuyuları içeren kuyu olarak benzer bir kırmızı renk ile leke. Belirli bir seyrelti içinde mevcut çok sayıda viral partiküller olduğunda Alternatif olarak, plak yokluğunda da görülmektedir. Bu tüm monolayer parçalanma yol açar ve kuyular rengi sarı / turuncu görünür.
  5. Viral titreleri hesaplayın. Tek bir dilüsyon kuyularda hem plakların sayısını ekleyin ve seyreltme faktörü (yani 1 ml 2 kuyu 0,5 ml ile enfekte olup olmadığını) ile çarpın. Bu 1 ml sizin inokülum hacminin plak oluşturan birim miktarı (PFU) verecektir. Örneğin, 10 -2 seyreltme de Şekil 4 ', iyi bir ("II" işaretli) 14 plaklar vardır ve diğer iyi ("V" işaretli) 17 plaklar vardır. Böylece, viral titresi 14 olacakx10 17x10 2 + 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Bulaşıcı MNV-1 parçacıklar Şekil 1 'de şematik olarak belirtildiği gibi bir plak deneyi kullanılarak ölçülebilir. Şekil 2A hemen önce enfeksiyon, RAW 264.7 hücreleri, bir tek tabaka ile iyi göstermektedir, Şekil 2B, I, II, roman numaraları ile gösterilen üç görünür plaklar gösterirken Bir kuyu içinde ve III. Testin bireysel adımları Şekil tasvir edilmektedir F. Şekil 3A ile 3A, bir virüs içeren bir örnek, 10-kat inceltilmiş serileri hazırlanması gösterilmektedir. Şekil 3B, bir 6-kuyulu plakanın kuyularının çoğaltmak için dilüsyonları transferi gösterir. Şekil 3C 1 saat için oda sıcaklığında inokulum ile RAW 264.7 hücreleri inkübe etmek için kullanılan cihaz sallanan gösteren Şekil 3B hücreleri SeaPlaque ile kaplanmış olan gösterir:. MEMŞekil 3F hücreler daha sonra bir% 0.01 nötral kırmızı solüsyon 48 saat ile boyanmış olan gösterirken, bir karışım. Şekil 3E, kaplama katılaşmasını sağlamak için oda sıcaklığında bir plaka göstermektedir. 1-3 saat boyunca boyanan hücrelerin ve nötral kırmızı boyama çözüm aspire sonra, plaklar görebilir ve (Şekil 4) sayılabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1. MNV plak tahlil protokolü şematik.

figure-protocol-2
Şekil 2. Enfeksiyon öncesi ve plak oluşumundan sonra bir tek tabakalı bir iyi Temsilcisi görüntüler. A) RAW 264.7 hücreleri 20x büyütmede ışık mikroskobu altında geceleme ve görüntülü kültüre edildi. B) Hücreler 48 saat sonra 0,01% nötral kırmızı çözeltisi ile boyandıenfeksiyon r ve 4x büyütmede ışık mikroskobu altında görüntülendi. Romen rakamları I, II ve III üç görünür plaklar göstermektedir.

figure-protocol-3
Şekil 3. Farklı plak tahlil adımlar Temsilcisi görüntüler. A) MNV-1 inokulum 10-kat dilüsyonu hazırlanır. B) Aşı, yinelenen bir kuyu içinde hücre mono tabakaları eklenir. C) hücreleri ile inokulum, oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan ile inkübe edilir. D) hücreler SeaPlaque agaroz ve 2x MEM ortam bir 1:1 karışımı ile üst üste. E) Levhalar kaplama katılaştırmak için izin vermek üzere oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı. Nötral kırmızı boyama çözüm 48 saat sonrası enfeksiyon hücrelerin F) Boyama.

figure-protocol-4
Hücre monol Şekil 4. MNV-1 formları plaklarayers. Burada gösterilenler inkübasyon 1 saat sonra nötral kırmızı boyama çözüm lekeli plaklar gösteren, 48 saat sonrası enfeksiyon temsili bir plak tahlil plakadır. Plakası üç 10 kat dilüsyonlarının yinelenen kuyuları gösterir. I ve IV 10-1 seyreltme karşılık roman numaraları ile etiketlenmiş Wells, II ve V 10-2 seyreltme karşılıktır; III ve VI 10-3 seyreltme karşılık gelir. Numunenin viral titresi (hesaplama ayrıntıları için bakınız Bölüm 4.5) aşağıda belirtilmiştir.

Tartışma

Burada sunulan MNV-1 için plak metodu bulaşıcı MNV parçacıkların miktarının bir yoludur. Şekil 3'de gösterilen tahlil adımı takip ederek, tekrar üretilebilir bir viral titreler elde edebilir. Testin tespit limiti kullanılan başlangıç ​​seyreltme bağlıdır. Yukarıda açıklandığı gibi örnek bir 1:10 seyreltme ile başlarken, plak testin saptama sınırının 10 pfu (yani, 10 -1 seyreltme görülebilir 1 plak) 'dir. Her bir plak tek bir virüs temsil ettiği için, plak deneyi, izole plaklar çekme ve bunları daha önce tarif 1 yayarak MNV klonal popülasyonları saflaştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, plak saflandırma da karışık virüs popülasyonlarının tek başına bir virüs popülasyonunun ayırmak için de kullanılabilir. MNV enfeksiyonun tespiti için bir plak tahlil kullanarak bir sınırlaması tüm MNV suşların plaklar 4 oluştururlar olmasıdır. Bununla birlikte, inabili üstesinden gelmek mümkündürseri doku kültürü 7 bu virüsler pasajlanmasını tarafından plak oluşturan hayvanlardan izole edilen bazı suşları MNV, ve ty. Plak tahlil alternatif TCID 50 tekniği 3, 4 ile bulaşıcı partikülleri ölçmektir. Bu tahlil, uç nokta seyreltmeleri ile MNV 4-tamamlanması 1 hafta sürer aşağıdaki aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarı miktarını belirler. Bir plak deneyi daha yavaş olmasına ek olarak, TCID 50 tahlil ayrıca şu şekilde duyarlı değildir (tespit limiti = 200 TCID 50 / ml), RAW 264.7 hücreleri, 4 doku örneklerinin toksisite nedeniyle.

Protokolü içerisindeki kritik adımlar protokol boyunca tarif edilmiş olmasına rağmen, aşağıdaki bölümde sorun giderme kolaylaştırmak için bir özet sunar. Protokolde en kritik adım RAW 264.7 hücreleri virüs çoğaltması desteklemek için test boyunca canlı kalmasını sağlamaktır. Bu canışık mikroskobu ile testin her aşamasında izlenecektir. Hücre canlılığı, iki yolla sağlanır. Birincisi, bakım plakaları tutarken hücrelerin kurumasına izin vermeyin alınmalıdır. Böylece, plakaları, bir defada bir aşılanmış enfeksiyon döneminde sarsan ve onlar ele edilmemesi zaman kalır kapalı olmalıdır edilmektedir. İkinci olarak, çözeltiler hücrelerin üzerine ilave ~ 37 ° C 'ye dengelenmiş olmalıdır Bundan başka, hücrelerin aktivasyonu sınırlayan düşük endotoksin serum (<10 EU / ml) içeren ortam içinde bakımı için de RAW 264.7 hücreleri genel sağlığı için hayati önem taşır. Pasaj 30 ya da daha yüksek bir ikinci hücreleri kullanılarak Buna ek olarak, plak deneyi daha yüksek bir başarısızlık oranı gözlemledik. Bu büyük olasılıkla laboratuvardan laboratuvara değişir rağmen, yüksek geçit RAW 264.7 hücreleri kullanarak, özellikle tekrarlanabilir titreleri sağlamak için (örneğin, bilinen bir viral titreye sahip bir örnek) bir pozitif kontrol dahil etmek önemlidir. Yüksek geçit hücrelerin kullanımını sınırlamak için, erken passa şişeleri dondurmak tavsiye edilirRAW 264.7 hücrelerin alınması ve sıklıkla dondurulmuş flakonlarından yeni bir kültür başlamak üzerine ge hücreleri. Hücreleri değişmiş gibi, hücre morfolojisi değişiklikler uymak (örneğin yuvarlak çırpı ve yaymak) başarısızlık gibi özellikler, veya mikoplazma kirlenme tespit edildiğinde sergilemek zaman düşük geçişi hücre kültürleri üzerinde başlayarak da yararlı olacaktır. Dikkat etmek önemli bir nokta da pipet uçları örnekleri arasında ve dilüsyonları sırasında değiştirilen sağlamaktır. Bu doğru seri dilüsyonları sağlamak ve örnekler arasında çapraz bulaşmayı önlemek olacaktır. Aynı örnek seri dilüsyonları kuyucuklara ilave edilmesi ile aynı pipet ucu tekrar kullanılabilir protokol içinde bir adımdır. Bu durumda, bir çok seyreltilmiş inokulum den az başlar ve yeni bir seyreltme çizerken şiddetle aşağı yukarı pipetle etmelidir.

Plak tahlil protokolü bazı modifikasyonlar iyileştirilebilir. T yapılabilir bir modifikasyonuburada iki kopya halinde kuyu inokülasyon için yeterli hücre olmayan her bir seyreltme için sadece tek bir iyi aşılamak için. Inokulum hacmi 0.5 ml olan Bununla beraber, plaklar sayı daha sonra pfu / ml 'ye normalleştirmek için 2 faktör ile çarpılır gerekmektedir. Plak tahlil da MNV replikasyon desteklemek mümkün olan herhangi bir diğer yapışık hücre hattı ile kullanım için adapte edilebilir, ve bu fare mikroglial BV-2 hücre dizisi 8 için tarif edilmiştir. Uygulanabilir diğer değişiklikler diğer virüsler için geliştirilen plak tahlil protokolleri için tarif edilmiştir uyarlamalar vardır. MNV halinde, aşağıdaki modifikasyonlar önceden başarılı bir şekilde uygulanmıştır; metil yerine Deniz Plak selüloz agaroz 9, ve kristal mor ya da yerine nötr kırmızı 10, 11 ve metilen mavisi ile boyanması hücrelerin kullanımı.

Diğer plak oluşturan virüs ölçmek için gerekli ya da oth için kullanılır Genel olarak, bu protokol kolayca adapte edilebilirgenel olarak bulaşıcı viral parçacıkların ölçmek için yararlı bir araç yapma, RAW 264.7 hücrelerinde litik enfeksiyonlara neden er virüsler.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz eleştirel görüş ve önerileriniz için Wobus laboratuar üyelerine teşekkür. CEW ve laboratuvarda çalışma Michigan Üniversitesi, Biyo-Savunma Mükemmeliyet NIH / NIAID Bölgesel Merkezi ve Gelişmekte Olan Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma (RCE) Programı, Bölge V 'Büyük bir kariyer geliştirme hibe start-up fonları tarafından finanse edildi Göller RCE (NIH ödülü 1-U54-AI-057153) ve NIH R01 AI080611. MBG-H. Michigan Üniversitesi Deneysel İmmünoloji (NIH T32 A1007413-16) ve Mikrobiyal Patogenezinde Moleküler Mekanizmalar (NIH T32 A1007528) eğitim hibeleri tarafından finanse edildi. JBC Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nivel Superior (Pelerin), Brasilia, Brezilya tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
DMEM / Yüksek glukoz Hyclone SH30243.02
2x MEM Gibco 11935
100x Penisilin ve streptomisin Hyclone SV30010
10 mM olmayan esansiyel amino asitler Hyclone SH30238.01
1M Hepes Hyclone SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamin Hyclone SH30034.01
Fetal Bovine Serum Gibco, Hyclone 10437, SH30070.02
Deniz Plak Agaroz Lonza 50100
Nötr Kırmızı 0.33% Sigma N2889
1x PBS Gibco 10010
1,0 mm Zirkonya / Silika boncuk BioSpec Ürünler 11079110z
Model 35 Hız Rocker Labnet S2035
Magna Lyser Enstrüman Roche 03358968001
Ham 264.7 hücre hattı ATCC TİB-71
Doku kültürü inkübatör Sanyo MCO-18AIC

Kaynaklar

  1. Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432(2004).
  2. Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis. Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).
  3. Condit, R. C. Ch. 2. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).
  4. Thackray, L. B. Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence. Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).
  5. Reed, L. J., Muench, H. A simple method for estimating 50% endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).
  6. Chachu, K. A. Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection. Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).
  7. Barron, E. L. Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute. PLoS ONE. 6, e21435(2011).
  8. Cox, C., Cao, S., Lu, Y. Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line. Virology journal. 6, 196(2009).
  9. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
  10. Hyde, J. L. Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway. Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).
  11. Simmonds, P. Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses. Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Seri Dil syonRAW 264 7 H creleriN tral K rm z BoyamaPlak Olu turan BirimlerDoku K lt rVir s KantifikasyonuAgaroz OverlayH cre Monotabakas

İlgili makaleler