Yöntem makalesi

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

DOI:

10.3791/4350

⸱

28 Eylül 2012

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, canlı zebra balığı embriyosundaki fotokonvertibl floresan proteinlerin (PCFP'ler) fotoaktif geçişi ve gelişim sırasında belirli zaman noktalarında fotokonvertif proteinin daha fazla izlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu metodoloji, canlı bir omurgalı organizmasında farklı gelişimsel süreçlerin altında yatan hücre biyolojik olaylarının izlenmesine izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyogenez, gelişimsel değişikliklerin in vivo olarak belgelenmesine izin veren teknikler kullanılarak en iyi şekilde incelenen dinamik bir süreçtir. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin kullanımı, bozulmamış organizmada meydana gelen dinamik morfogenetik süreçleri aydınlatmak için değerli bir strateji olduğunu kanıtlamıştır. Son on yılda, fotoaktif ve fotokonvertibl floresan proteinlerin geliştirilmesi, etiketli proteinlerin ayrı alt popülasyonlarının kaderini araştırma olasılığını açmıştır1. Fotoaktive edilebilir proteinlerin aksine, fotokonvertibl floresan proteinler (PCFP'ler), fotokonversiyondan önce doğal emisyon durumlarında kolayca izlenir ve görüntülenir, bu da optik inceleme ile bölgelerin tanımlanmasını ve seçilmesini kolaylaştırır. Kaede2, KikGR3, Dendra4 ve EosFP5 gibi PCFP'ler, UV veya mavi ışığa maruz kaldıklarında, ışıkla katalize edilmiş bir β-eliminasyonu ve ardından π-konjuge bir sistemin3. PCFP'ler ve monomerik varyantları, sırasıyla6-10 hücrelerini izlemek ve protein dinamiklerini11-14 incelemek için yararlı araçlardır. Son yıllarda, PCFP'ler, hücre kaderi takibi için zebra balığı 6, tavuk 7,8 ve fare9,10 gibi farklı hayvan modellerinde ifade edilmiştir. Burada, canlı zebra balığı embriyosunda PCFP'lerin hücreye özgü fotodönüşümü ve daha sonraki gelişim aşamalarında fotokonvertif proteinlerin daha fazla izlenmesi için bir protokol bildiriyoruz. Bu metodoloji, zebra balığı hayvan modelinde morfogenezin altında yatan hücre biyolojik olaylarının dokuya özgü bir şekilde incelenmesine izin verir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fotokonversiyon Testi için Embriyo Elde Edilmesi

PCFP'yi eksprese eden transgenik zebra balığının çaprazlanması üzerine, en parlak olanları homozigot embriyolar seçilir ve istenen embriyonik aşama15'e kadar 28.5 °C'de büyütülür.

Not 1: Bu ön seçim, embriyoların düşük lazer gücü ile taranmasına olanak sağlayarak fototoksisiteyi ve fotobleachingi önleyecektir.

Not 2: Kaede ve KikGR gibi PCFP'lerin gün ışığı da dahil olmak üzere ışığa maruz kalmaya karşı yüksek hassasiyeti nedeniyle, embriyoları görselleştirirken düşük yoğunluklu ışık kullanmanızı ve onları karanlık koşullarda tutmanızı öneririz.

2. Gömme

  1. Yumurta suyu ile cam bir kapta, forseps kullanarak stereomikroskop altında embriyoları dekoryonat.
  2. Dekoryonlanmış bir embriyoyu 0.16 mg / ml Trikain (3-amino benzoik asitilester, Sigma-Aldrich) çözeltisine (1 ml E3 ortamı 1X içinde 40μl 4 mg / ml stok çözeltisi) transfer ederek embriyoları uyuşturun.

Not 1: Embriyolara zarar verme riskini en aza indirmek için embriyoları bir cam pipet veya kesik uç (P1000) ile transfer edin.

Not 2: Dekoryonlu genç embriyolar havaya maruz bırakılmamalı veya su/hava arayüzüne kaldırılmamalıdır, çünkü yumurtalar mekanik strese maruz kaldıklarında kolayca yırtılırlar.

  1. Anestezi uygulanmış embriyoyu bir kültür kabının kapağına aktarın ve embriyoyu mümkün olan en küçük ortam hacminde tutun.
  2. Embriyoyu 30 ° C'de 0.16 mg / ml Trikain içeren% 1 düşük erime sıcaklığına sahip agaroz (LMA, Lonza) ile pipetleyerek embriyoyu agaroza aktarın ve kapak camı tabanlı bir kültür kabının (MatTek Corp. Ashland MA USA) kapak camına yerleştirin. Daha sonra, embriyoyu pürüzsüz bir plastik uç (örneğin kesilmiş bir Mikro Yükleyici Pipet Ucu, Eppendorf) yardımıyla yönlendirin ve LMA polimerize olduğunda, agarozu 0.16 mg / ml Trikain çözeltisi ile örtün.

Not 1: %1 LMA'yı 60 °C'de eritin ve erimiş agarozu 30 °C'de tutun.

3. Fotoğraf dönüştürme

  1. Zeiss LSM 710 gibi 405 nm, 488nm ve 561nm lazer kaynağı ile donatılmış ters konfokal bir mikroskopta, numuneyi fotodönüştürülecek numunenin tüm yapısını kapsayan bir z-Stack taraması ile görselleştirin ve daha sonra 488 nm lazer (yani, 30 mW Ar lazer,% 5-7 yoğunlukta, dedektör 493-540 nm'ye ayarlanmış) ve 561 nm lazer (örn., 10 mW DPSS 561 lazer, %7-9 yoğunlukta, dedektör 587-651'e ayarlanmış) doku/organı sırasıyla fotokonvertibl proteinlerin yeşil ve kırmızı floresansı için taramak için.

Not 1: Foto dönüştürme öncesi tarama için bir Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objektif kullandık.

Not 2: Yanlışlıkla oluşturulmuş herhangi bir kırmızıya dönüştürülmüş PCFP'nin mevcut olup olmadığını dışlamak için deneyden önce her zaman kırmızı floresan tarayın.

  1. Zaman serisi aracını seçin ve aralıksız 2 döngü için ayarlayın (biri foto dönüştürme öncesi ve diğeri fotodönüştürme sonrası için).
  2. Bölgeler aracını seçin ve fotoğraf dönüştürme için bir veya daha fazla ilgi alanı (ROI) tanımlayın.

Not 1: Öncelikle, hücre veya protein hareketinin beklendiği sabit bir örnekte, her üçünde de (xy ve z yönünde) fotodönüştürülmüş doku/hücrelerin alanını ölçerek, ROI'de tarama lazeri tarafından gerçekten foto-dönüştürülen bölgenin yazılımda seçilen ROI ile eşleştiği hassasiyeti belirlemenizi öneririz. Bu uygulamada açıklanan ayarlar için, ROI, fotodönüştürülen bölgeyle büyük bir hassasiyetle eşleşti, ancak bu, kullanılan hedefe ve foto dönüştürme için uygulanan lazer miktarına bağlıdır. ROI'nin boyutu, objektifin sayısal açıklığına, yakınlaştırma faktörüne ve fotodönüştürme için kullanılan lazer ışığı miktarına bağlı olarak tek bir hücrenin boyutuna indirgenebilir.

  1. Ağartma aracını seçin ve 1/2 taramasından sonra ağartmayı başlat olarak ayarlayın. Foto dönüşüm için 30 mW 405 nm diyot lazer kullandık ve çoğunlukla lazer ışığının yoğunluğunu, ROI'nin tarama yinelemelerini ve piksel süresini (yani tarama hızı) değiştirerek elde edilen tam fotodönüşüm için gerekli olan minimum lazer ışığı miktarı için dikkatlice optimize ettik.

Not 1: Fotodönüşüm için Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objektif kullandık.

Not 2: Lazerin gücü ve yineleme sayısı, her deney ayarı için ampirik olarak belirlenmeli ve fototoksisiteyi azaltmak için gereken minimum miktarda lazer ışığı ile ROI içinde yeşilden kırmızıya PCFP'ye tam fotodönüşümü sağlamalıdır. Düşük yineleme sayılarıyla (örneğin 20) birlikte düşük lazer gücü (örneğin, hedef planında 0,03 mW'a karşılık gelen %3) kullanarak testleri başlatmanızı ve ardından elimizdeki lazer gücünde (hedef planda 0,1 mW'a karşılık gelen) tam fotodönüşüm elde edilene kadar lazer gücünü artırmanızı öneririz. Bu koşullar altında, test edilen tüm embriyolar tedavi planından kurtuldu. Bununla birlikte, yolk zarının lazer darbelerine karşı hassas olduğunu ve embriyonun ölümüne neden olacak şekilde kolayca zarar görebileceğini gözlemledik. Bu nedenle, fotokonversiyon sonrası embriyo ölümcüllüğü, hedef dokunun pozisyonunun yumurta sarısı gövdesine yakın olması durumunda ortaya çıkabilir.

  1. PCFP'nin kalan yeşilini ve fotodönüştürülmüş kırmızı floresansını görselleştirmek için 488 nm ve 561 nm lazerler kullanarak numuneyi bir z-Stack ile tarayın.

Not 1: Foto dönüştürme sonrası tarama için bir Plan Apochromat 20x/NA 0.8 kullandık.

4. Agarozdan Embriyoyu Çıkarın

  1. Solüsyonu atın ve embriyoyu bir iğne veya pürüzsüz bir plastik uç yardımıyla %1'lik LMA'dan dikkatlice çıkarın.
  2. İstenilen gelişim aşamasına kadar embriyoyu karanlıkta 28.5 ° C'de yumurta suyunda tutun.

Not 1: Embriyoların, özellikle gelişimin ilk günlerinde, embriyonik vücudun genişlemesi sırasında, yumurta suyunda gelişimlerini sürdürmeleri önemlidir. Gerçekten de, bazı embriyonik dokular/organlar gelişim sırasında pozisyon değiştirir ve bu nedenle gömme sırasında ilgilenilen belirli dokuya/organa ve analizin istenen gelişimsel aşamasına bağlı olarak özel yönelimler gerektirir.

5. Yeniden gömme

  1. Bu protokolün 2. maddesindeki gibi devam edin.

6. Daha Sonraki Embriyonik Aşamalarda Fotokonvertif Doku İzleme

  1. Yeşil ve kırmızı floresan sinyaller için sırasıyla 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak ilgilenilen bölgenin (z-Stack) taranması.

Not 1: Fotodönüşümden x saat sonraki tarama için bir Plan Apochromat 20x/NA 0.8 kullandık.

Not 2: Bu protokol embriyonun normal gelişimini etkilemediğinden, fotokonvertif embriyoyu gelişimin sonraki aşamalarında gözlemlemek mümkündür (bunun için 4. - 6. maddelerde belirtildiği gibi ilerleyin).

7. Temsili Sonuçlar

Fotodönüşüm testinin bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Zebra balığı gelişimi sırasında endotel hücrelerini izledik (gelişmekte olan zebra balığının vasküler anatomisinin gözden geçirilmesi için bkz.16). Buna göre, endotel çekirdeği17 içinde KikGR'yi eksprese eden bir zebra balığı Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 raportör hattı kullandık. Homozigot ve parlak eksprese eden embriyolar, döllenmeden 48 saat sonrasına (hpf) kadar 28.5 ° C'de büyütüldü. Dekoriyonasyon üzerine, embriyolar uyuşturuldu ve baş damarların daha iyi görüntülenmesi için embriyonun ön-dorsal tarafını kapak camına doğru konumlandırarak LMA'ya gömüldü. 405 nm, 488 nm ve 561 nm'de çalışan lazerlerle donatılmış ters konfokal bir mikroskop (Zeiss LSM 710 Meta) ve fotokonversiyon testi ve fotokonversiyon testi ve fotokonvertif proteinin daha fazla izlenmesi için bir Plan Apochromat 20x/NA 0.8 objektifi kullanıyoruz. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, fotokonversiyondan önce, KikGR endotel dokusu içinde eksprese edildi ve sadece 488 nm Argon lazer kullanılarak yeşil floresan olarak tespit edilebildi. Kırmızı floresan için 561 nm DPSS 561-10 lazerle yapılan kontrol taramaları, fotokonversiyondan önce herhangi bir fotokonversiyonlu KikGR tespit etmedi (Şekil 1A). Daha sonra, ROI 405 nm Diyot lazer ( yoğunlukta, 20 yineleme) kullanılarak tamamen fotodönüştürüldü ve baş damarlar 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak tekrar tarandı (Şekil 1B). Şekil 1B'de gösterildiği gibi, yeşil KikGR, ROI içinde tamamen kırmızıya dönmüştü. Fotokonversiyon testinden sonra, embriyo agarozdan çıkarıldı ve yumurta suyunda 28.5 ° C'de büyütüldü. Son olarak, embriyo, fotokonversiyondan 24 saat sonra, daha sonraki aşamalarda fotokonversiyon endotel hücrelerini izlemek için yaklaşık 72 hpf tekrar gözlendi (Şekil 1C). Böylece, embriyo LMA'ya gömüldü ve örnek 488 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak yeniden tarandı. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, fotokonvertif ROI'den kaynaklanan endotel dokusu içinde, kırmızı floresan fotokondüktörlü KikGR'nin stabilitesi ve yeni yeşil fotokonversiyonsuz KikGR'nin yeniden sentezi nedeniyle hem fotokonversiyonlu hem de fotokonversiyonlu olmayan KikGR proteinleri gözlenmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1. Zebra balığı gelişimi sırasında KikGR'nin fotodönüşümü. (A,B) Endotel başı vaskülatürünün spesifik bir bölgesi, Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 transgenik embriyolarda 48 hpf'de fotokonversiyon ve (C) fotokonversiyondan 24 saat sonra tekrar gözlendi (yaklaşık 72 hpf). KikGR (yeşil), fotoconvertlenmiş KikGR (kırmızı) ve birleştirilmiş kanalların floresansı gösterilir. Noktalı daireler, foto dönüşüm öncesi, sonrası ve 24 saat sonrası yatırım getirisini gösterir. Görüntüler, zebra balığı embriyosunun dibe doğru ön kısımdaki dorsal görünümleridir. Ölçek çubukları: 50 μm.

Protein (kısaltma) Eski (nm) Em (nm) Ec QY (Türkçe) Kuaterner Yapı parlaklık uygulama Ref Kaede_G 508 518 adet 99 0,9 tetramer 259 Hücre izleme 2,6 Kaede_R 572 580 adet 60 0,3 tetramer 59 KikGR_G 507 517 54 0,7 tetramer 112 Hücre izleme 3,6,8-10 KikGR_R 583 593 35 0,6 tetramer 68 mKikGR_G 505 515 49 0,7 monomer 101 Dinamik izleme Süper çözünürlüklü görüntüler 13 mKikGR_R 580 adet 591 28 0,6 monomer 53 EosFP_G 506 516 adet 72 0,7 tetramer 150 Hücre izleme 5,20 EosFP_R 571 581 41 0,5 tetramer 67 tdEos_G 506 516 adet 34 0,7 Tandem Dimer 165 Süper çözünürlüklü görüntüler 12,14,21 tdEos_R 569 581 33 0,6 Tandem Dimer 59 mEos2_G 506 519 56 0,7 monomer 140 Dinamik izleme Süper çözünürlüklü görüntüler 11,18 mEos2_R 573 584 46 0,7 monomer 90 Dendra2_G 490 507 45 0,5 monomer 67 Dinamik izleme Süper çözünürlüklü görüntüler 4,11 Dendra2_R 553 573 35 0,55 monomer 57

Tablo I. Fotokonvertibl floresan proteinlerin özellikleri. Her PCFP'nin ortak adı ve/veya kısaltması ile birlikte, tepe uyarma (Ex) ve emisyon (Em) dalga boyları, molar sönme katsayıları (EC, 10-3 M-1 cm-1 ), kuantum verimi (QY), fizyolojik olarak ilgili kuaterner yapı, bağıl parlaklık (EGFP'nin %'si olarak), uygulama ve referanslar tabloda gösterilmektedir. Day ve Davidson, 2010'dan uyarlanan tablo1.

PCFP (PCFP) Zebra balığı transgenik hatları kaynak Kaede Tg(elavl3:Kaede)rw0130a Okamoto Laboratuvarı Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:Kaede)   Tg(ins:Kaede)   Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)   Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ ZIRC (Türkçe) Tg(myl7:kaede)   Tg(olig2:Kaede)   Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t ZIRC (Türkçe) Tg(UAS:Kaede)rk8 ZIRC (Türkçe) Tg(vsx2:Kaede)nns2 Higashijima Laboratuvarı KikGR Tg(kdrl:nlsKikGR)   Tg(krt4:NTR-KikGR)   Tg(myl7:nlsKikGR)   Tg(sox10:KikGR)   Tg(UAS:KikGR)   EosFP Tg(sox10:EosFP)   Tg(sox10:nlsEosFP)   Dendra Tg (-8mpx: Dendra2)   Tg(UAS:Dendra-kras)  

Tablo II. PCFP'leri ifade eden zebra balığı transgenik çizgileri. Zebra Balığı Model Organizma Veritabanında (ZFIN, http://zfin.org/) elde edilen veriler. Zebra Balığı Uluslararası Kaynak Merkezi'nde (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/) hatların kullanılabilirliği belirtilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, Kaede veya KikGR gibi fotokonvertibl proteinlerin ekspresyonu için transgenik hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bu hayvanlar normal şekilde gelişir, bu da bu proteinlerin embriyonik gelişim üzerinde toksik etkisi olmadığını gösterir. Hayvan embriyolarındaki hücreleri izlemek için bir fotokonversiyon testi hakkındaki ilk rapor, Hatta ve işbirlikçileri tarafından, Kaede'yi kodlayan mRNA veya DNA'nın her yerde ekspresyon için tek hücreli zebra balığı embriyolarına enjeksiyonu veya Gal4-UAS sistemi6 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toronto, Kanada'daki Hasta Çocuklar Hastanesi'nde zebra balığı transgenik Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 hattını sağladığı için Dr. Ian C. Scott'a teşekkür ederiz. Konfokal ve 2-Foton Mikroskobu Çekirdek Tesisine (Max-Delbrueck-Moleküler Tıp Merkezi) ve Dr. Zoltan Cseresnyes, mükemmel teknik yardım ve genel görüntüleme desteği için. S.A.-Ş. Deutsche Forschungsgemeinschaft'ın (DFG) Heisenberg bursu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma DFG hibesi SE2016/7-1 ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Materials:<
StereomikroskopLeica LeciaMZ6 Stereomikroskop488 nm'de çalışan lazerle donatılmıştır
Konfokal lazer tarama mikroskobuZeissZeiss LSM 710 NLO488 nm, 561 nm ve 405 nm'de çalışan lazerlerle donatılmıştır
Isıtma bloğu
Dumont #5 forseps
Kapaklı cam tabanlı kültür kabıMatTek CorpAshland MA USA
Mikro Yükleyici Pipet UçlarıEppendorf
Vorteks
iğneleri
Reagents:
Yumurta suyu ortamı
60 μ g/ml Anında Okyanus Deniz Tuzları ddH2O
E3 ortamı
>5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0.00001% (a/h) Metilen Mavisi
4 mg/ml Trikain stok çözeltisi
400 mg Trikain (3-amino benzoik asitetilester)Sigma-Aldrich
97.9 ml ddH2O
2.1 ml 1M Tris (pH9)
pH 7'de ayarlayın, alikot ve -20 &°C saklayın; C
1% LMA (Düşük erime sıcaklığı agarozu, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 ortamı 1X
Aliquot ve 4 &°C'de saklayın; Ç
td colspan="4">Balık yetiştirmek ve yumurta toplamak için gerekli ekipman (ayrıntılar için Zebra Balığı Kitabına22 bakın).çifti

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
  4. Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  5. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
  6. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
  7. Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
  8. Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
  9. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
  10. Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
  11. Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
  12. Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  14. Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
  17. Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  19. Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
  20. Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
  21. Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
  22. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Confocal MicroscopyPhoto ConversionFluorescent ProteinsTissue Specific ExpressionLow Melting Temperature AgaroseEgg Water MaintenanceEndothelial Cell Tracking

İlgili makaleler