Yöntem makalesi

Zebra balığı larvalarının Microgavage

17.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

20 Şubat 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Standart embriyo mikroenjeksiyonu ve stereomikroskopi ekipmanları kullanılarak, zebrafish larvalarının mikrogavage işlemi için yeni bir yöntem sunuyoruz. Mikrogavage işleminin, çeşitli materyallerin kontrollü miktarlarda özellikle zebrafish larvalarının intestinal lümenine iletilmesi için kullanışlı, güvenli ve etkili bir teknik olduğunu gösteriyoruz.

Özet

Zebra balığı; bağırsak gelişimi1-5, fizyolojisi6-11, hastalıkları12-16 ve konak-mikrop etkileşimlerinin17-25 incelenmesi için güçlü bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Bağırsak biyolojisini incelemeye yönelik deneysel yaklaşımlar genellikle seçilen materyallerin bağırsak lümenine in vivo olarak verilmesini gerektirir. Larva zebra balığı modelinde bu işlem tipik olarak balıkların seçilen materyalin bir çözeltisine daldırılmasıyla veya abdominal duvar üzerinden enjeksiyonla gerçekleştirilir. Daldırma yöntemi kullanıldığında, materyalin bağırsağa iletilme yolu veya zamanlamasını doğru şekilde izlemek veya kontrol etmek zordur. Bu nedenle, daldırma yoluyla maruz bırakma; bağırsak dışı dokularda istenmeyen toksisiteye ve diğer etkilere neden olarak bağırsağa iletilebilecek materyal miktarlarının potansiyel aralığını kısıtlayabilir. Ayrıca, daldırma yoluyla maruz kalma sırasında alınan materyal miktarı, bireysel larvalar arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir26. Abdominal duvar üzerinden yapılan doğrudan enjeksiyonlarda bu sorunlarla karşılaşılmasa da, uygun enjeksiyon yapmak zordur ve deneysel sonuçları etkileyebilecek doku hasarına yol açar. Zebra balığı larvaları için bir mikrogavage yöntemi sunuyoruz. Bu yöntemin amacı, larva zebra balıklarında materyallerin ön bağırsak lümenine kontrollü zamanlamayla doğrudan iletilmesi için güvenli, etkili ve tutarlı bir yol sağlamaktır. Mikrogavage; zebra balığı araştırmaları yapan çoğu laboratuvarda bulunan standart embriyo mikroenjeksiyon ve stereomikroskopi ekipmanlarını kullanır. Balıklar metilselüloz içerisinde uygun şekilde konumlandırıldıktan sonra, gavage işlemi dakikada yaklaşık 7-10 balık hızında hızlıca gerçekleştirilebilir ve gavage sonrası sağkalım oranı, verilen materyale bağlı olarak %100'e yaklaşır. Ayrıca mikrogavage'ın, daldırma yoluyla maruz bırakıldığında balıklar için öldürücü olan yüksek konsantrasyonlardaki materyallerle bağırsak lümeninin doldurulmasına olanak tanıdığını gösteriyoruz. Bu yöntemin kullanışlılığını kanıtlamak için, bağırsak lümeninden bağırsak dışı boşluklara geçişi nicelendirmek için kullanılabilecek bir floresan dekstran mikrogavage testi sunuyoruz. Bu test, mikrogavage prosedürünün doğru uygulandığını doğrulamak için kullanılabileceği gibi, farklı deneysel koşullar altında (örneğin genetik manipülasyon, ilaç tedavisi veya çevresel faktörlere maruz kalma) bağırsak epitel bariyer bütünlüğünü incelemek için yeni bir zebra balığı testi sağlar. Ayrıca, floresan mikroküreler verilerek ve bunların sonraki geçişleri izlenerek, gavage yönteminin bağırsak motilitesini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Mikrogavage; canlı mikroorganizmalar, salgılanan mikrobiyal faktörler/toksinler, farmakolojik ajanlar ve fizyolojik problar gibi çeşitli materyallerin iletilmesi için uygulanabilir. Bu yeteneklerle, larva zebra balığı mikrogavage yöntemi, zebra balığı model sistemini kullanan geniş bir araştırma alanını geliştirme potansiyeline sahiptir.

Protokol

Mikrogavage için larva elde etmek amacıyla standart zebra balığı bakımı ve yetiştirme işlemleri için yayınlanmış protokolleri kullandık27. Balıkları çoğaltmak için öncelikle doğal üremeyi kullanıyoruz ve balıklar 14 saat ışık/10 saat karanlık döngüsünde tutuluyor. Bu protokol, fertilizasyondan sonraki 6-7. günlerdeki (dpf) zebra balığı larvalarının mikrogavage işlemi için optimize edilmiştir. Bu yöntemlerin, küçük modifikasyonlarla daha genç ve daha yaşlı gelişim aşamalarına da genel olarak uygulanabileceğini öngörüyoruz. Aksi belirtilmedikçe, 6 dpf'lik vahşi tip TL zebra balığı suşunu kullandık ve balıklara yem verilmedi. Tüm deneyler, konvansiyonel zebra balığı akuakültür tesisimizden temin edilen sistem suyunda gerçekleştirildi; ancak herhangi bir uygun zebra balığı medyumu (örneğin embriyo medyumu veya gnotobiyotik zebra balığı medyumu (GZM)28) kullanılabilir. Bu protokolde, kullanıcının tercih ettiği medyumu ifade etmek için 'zebra balığı medyumu' terimini kullanıyoruz.

1. Metilselüloz Hazırlanması, Gavage Kalıbı ve Mikro-gavage İğnesi Üretimi

Deneyden bir gün önce veya deney gününün erken saatlerinde; metilselüloz, larvaları sabitlemek için agaroz kalıp ve mikro-gavaj iğnelerini hazırlayın.

  1. %3'lük bir çözelti hazırlamak için 3 g metilselülozu 100 ml steril, deiyonize su veya zebra balığı ortamında (uygulamanıza bağlı olarak) çözün. Şişeye bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin, suyu kaynama noktasına yakın bir dereceye ısıtın ve yüksek ısıdaki bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Topaklanmayı önlemek için metilselülozu yavaşça serperek ekleyin ve bu sırada karıştırmaya devam edin. Gün boyunca, çözelti oda sıcaklığına gelene kadar karıştırma hızını ve karıştırıcı plakanın sıcaklığını yavaşça düşürün.
  2. Metilselüloz tamamen çözünene kadar gece boyunca yavaşça karıştırmaya devam edin. Çözelti, sızdırmaz bir kapta oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklanabilir.
  3. Üretici talimatlarına göre, plastik bir kalıp (Adaptive Science Tools, TU-1) kullanarak 10 cm'lik bir Petri kabında %3'lük agaroz jel kalıbı hazırlayın. Kurumayı önlemek için parafille kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın. Deneyden önce oda sıcaklığına veya 28 °C'ye kadar ısıtın. Agaroz kalıpları genellikle birkaç kez yeniden kullanılabilir.
  4. Borosilikat cam kapilerler ve geniş oluklu ısı filamanına sahip bir Flaming Brown Mikropipet Çekici (FT330B) kullanarak birkaç adet gavage iğnesi çekin. İğne üretimi için kullandığımız programlar şunlardır:
İğne tipiBasınçIsıÇekmeHızSüre
embriyo50031510050200
gavaj50031512575200

Filamanlar cihazlar arasında farklılık gösterebildiği için rampa süresini (aktif ısıtma süresi) kaydedin. Bu program için rampa süremiz 8.57-8.79 ms arasındadır. Bu program, geleneksel mikroenjeksiyon iğnelerinden daha kısa ve daha kalın iğneler oluşturur (Şekil 1). Bu ayarların, farklı mikropipet çekicilerde kullanımı için optimize edilmesi gerekebilir.

2. Mikrogavaj İğnelerinin Kesilmesi, Doldurulması ve Kalibrasyonu

Not*: İğne uçlarının kırpılması bu protokoldeki kritik bir adımdır. Ayrıca, iğne yükleme ve kalibrasyon yöntemleri kullanılan mikroenjeksiyon ünitesinin tipine göre değişiklik gösterecektir. Bu protokolü Drummond II mikroenjektörleri kullanarak optimize ettik, ancak küçük modifikasyonlarla diğer mikroenjeksiyon cihazları için de uygulanabileceğini öngörüyoruz. Enjeksiyon düzenekleri ve iğne çekiciler laboratuvarlar arasında farklılık göstereceği için, enjeksiyon hacimlerinin ölçülmesi/kalibre edilmesi önemli olacaktır (bkz. bölüm 2.8).

  1. İğneler bir stereomikroskop altında kesilir. 2,5x büyütmeye ayarlanmış bir Leica S6E stereomikroskop kullanılır. Bu ayarda, 100 bölmeli oküler mikrometresi 2 mm uzunluğundadır.
  2. İğnenin ucunu mikrometre cetvelinin sonuna (100. bölme işareti) hizalayın ve ince uçlu saatçi pensleri kullanarak iğneyi uçtan ~1 mm mesafeden (48-50. bölme işaretleri) kesin (Şekil 1A).
  3. İğne çapı yaklaşık 27-30 μm olmalı ve ucu küt olmalıdır. İğne uçlarını 100x büyütmede inceleyin. Keskin veya tırtıklı iğneler, gavage sırasında hasar olasılığını artırır ve mümkünse bunlardan kaçınılmalıdır.
  4. Alternatif olarak, mevcutsa, iğne kesim noktasını daha iyi kontrol etmek ve keskin kenarları gidermek için iğne uçlarını ateşle parlatmak amacıyla bir mikroforge (mikro-dövme cihazı) kullanılabilir (Şekil 1B).
  5. Gavage solüsyonunu hazırlayın. Çoğu uygulama için, mikroenjektörün düzgün çalıştığını izlemek ve gavage solüsyonunun anterior bulb içine yerleşimini gözlemlemek amacıyla solüsyonun stereomikroskop altında görünür olmasını sağlamak için, Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu solüsyon (DPBS) (Sigma-Aldrich) içinde 0,5% fenol kırmızısı solüsyonunun 1:10 oranında seyreltilmiş hali eklenerek hazırlanır. Fenol kırmızısı dışındaki yükleme boyaları değerlendirilmemiştir ancak kullanılabilir.
  6. 25G 5/8-iğneli 1 ml'lik bir şırınga ile mineral yağı doldurarak gavage iğnesini hazırlayın. Nanoject II mikroenjeksiyon ünitesine monte edin.
  7. Düz ve su geçirmez bir yüzey sağlamak için 10 cm'lik plastik bir Petri kabını parafilm ile kaplayın ve parafilmin üzerine ~2 μl gavage solüsyonu paylaştırın. Mineral yağı içinde hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat ederek gavage iğnesini manuel olarak geriye doğru doldurun.
  8. Mikroenjektör fonksiyonunu test etmek ve püskürtme hacmini kalibre etmek için, 3 cm'lik bir Petri kabını mineral yağı ile doldurun ve damlacıklar boyut olarak tutarlı hale gelene kadar yağın içine enjeksiyon yapın. Damlacıkların çapını mikrometre veya varsa stereomikroskobun ölçüm fonksiyonu ile ölçün. Damlacık hacmini hesaplayın (Denklem: V=4/3πr3). İğneler arasındaki hacim tutarlılığı grafiğe dökülmüştür (Şekil 1C).
  9. Gavage işlemine başlamadan önce, kalıntı mineral yağını temizlemek için iğnenin ucunu temiz zebra balığı besiyerine defalarca daldırarak yıkayın. Mineral yağı çok yoğundur ve iğne ucundan yıkanmadığı takdirde epitel dokulara zarar verebilir.

3. Zebrafish Larvalarının Anestezi Edilmesi, Sabitlenmesi ve Gavajı

  1. Deneyden önce agaroz kalıbını oda sıcaklığında veya 28 °C'de ısıtın.
  2. Gavage işlemi için agaroz kalıbının 3 oluğunu %3 metilselüloz ile kaplayarak hazırlayın. Olukları kapatmaya ve balıkları tutmaya yetecek miktarda metilselüloz kullanın, ancak hızla kurumayacak kadar yeterli miktar olduğundan emin olun.
  3. Temiz bir 6 kuyucuklu plaka içinde, her biri 3.5-4.0 ml zebrafish besiyeri içeren ayrı kuyucuklara, her bir deney grubu için zebrafish larvalarını paylaştırın.
  4. Uygun zebrafish besiyerinde 3x trikayn çözeltisi (0.05% w/v) hazırlayın. Larvaların bulunduğu kuyucuğa, nihai konsantrasyon 1.5x (0.025%) olacak şekilde eşit hacimde 3x trikayn ekleyip hafifçe çalkalayarak balıkları tek tek kuyucuklarda anesteziye alın.
  5. Zebrafish'ler hareket etmeyi bıraktığı anda, onları geniş ağızlı bir cam Pasteur pipeti ve pipet pompası kullanarak kuyucuktan çıkarın ve başları oluğun 45° açısında, kuyrukları ise oluğun 90° açısına doğru gelecek şekilde birer birer metilselüloz üzerine yerleştirin. Pozisyonlarını sabitlemek için küt bir diseksiyon probu ile onları nazikçe metilselüloza bastırın.
  6. Nanoject II mikroenjeksiyon düzeneğini, iğnenin agaroz kalıbının 45° açısına yaklaşık olarak paralel ve sığ bir açıyla eğimli olacağı şekilde ayarlayın. Balıklar yerleştirildikten sonra daha az ayar yapılması için, iğnenin uzama aralığının kalıp kuyucuğunun tabanını geçmeye yetecek kadar olduğundan emin olun.
  7. Mikroenjeksiyon ünitesini, yavaş enjeksiyon ayarında (23 nl/sec) maksimum 4.6 nl salacak şekilde ayarlayın. Bu ayarlarda, iletilen hacim sadece bağırsağın anterior bulbunu doldurmalı ve özofagustan veya kloakadan dışarı sızmamalıdır. Deneyin amacına bağlı olarak daha küçük hacimler kullanılabilir.
  8. Bir elinizle immobilize larvaların bulunduğu plaka üzerinde küçük ayarlamalar yaparken, diğer elinizle eş zamanlı olarak mikroenjeksiyon ünitesinin manipülatörünü kontrol edin.
  9. Gavage iğnesini nazikçe anestezi altındaki balığın ağzına, özofagus boyunca ilerletin ve gavage iğnesinin ucunu anterior intestinal bulbun hemen içine yerleştirmek için özofageal sfinkteri hafifçe bastırın (Şekil 2, adım 1-2, a&b).
  10. Anterior bulbun içine girildiğinde, materyali uygulamak için ayak pedalına veya enjeksiyon düğmesine nazikçe basın. Özofagusa önemli miktarda materyal salmamaya dikkat ederek iğneyi hızlı ve pürüzsüz bir şekilde geri çekin (Şekil 2, adım 3-4).
  11. Gavage sonrası, zebrafish larvalarını nazikçe taze besiyerine taşımak için geniş ağızlı bir cam Pasteur pipeti ve pipet pompası kullanın. Pipeti, boyun kıvrımının yaklaşık 1 inç üzerine kadar suyla doldurun, larvanın başı yanındaki metilselülozda küçük bir su cebi oluşturarak onu serbest bırakın, başı nazikçe pipetin ağzına kaldırın ve larvayı metilselülozdan çekip çıkarın. Balığı ve tüm suyu pipetten taze besiyeri içeren bir kaba nazikçe boşaltın.
  12. Metilselülozu temizlemek ve larvaları anesteziden uyandırmak için, larvaları taze besiyeri içinde nazikçe yukarı-aşağı pipetleyerek veya birkaç kez besiyeri sıçratarak durulayın. Larvaları, sonraki görüntüleme ve analiz işlemleri için gerekene kadar bir Petri kabına veya 6 kuyucuklu plakaya aktarın.

4. Gavage Güvenliğini ve Bağırsak Bariyer Bütünlüğünü Test Etmek İçin Dekstran Analizi

Mikrogavage, bağırsak içine çeşitli materyallerin iletilmesi için kullanılabilir. Örnek olarak, bağırsak epitelyumunun bariyer bütünlüğünü analiz etmek amacıyla Texas Red ile konjuge edilmiş 10 kD dekstran gavage işlemi için aşağıda bir protokol sunuyoruz. Paraselüler geçirgenlik için, çözünenlerin yüküne ve boyutuna dayalı seçicilik farklılıkları olan ve "pore" (gözenek) veya "leak" (sızıntı) yolları olarak adlandırılan en az iki potansiyel rota mevcuttur29. Bu dekstran, paraselüler gözenek yoluyla bağırsak epitelyumu boyunca absorbe edilemeyecek kadar büyük olduğundan (boyut sınırlaması ~4Å, 10kD dekstran= ~23Å)9,30-32, bağırsak bariyer bütünlüğü bozulmadığı sürece lümen içinde kalmalıdır. 10 kD dekstran paraselüler sızıntı yoluyla taşınabilse de, bu yolun kapasitesi daha düşük ve kinetiği daha yavaştır29,33, bu nedenle bu analiz süresi içerisinde gerçekleşmesi olası değildir. Bariyer bütünlüğünü bozmak için yapılan 'pozitif kontrol' işlemi, epitelyal sıkı bağlantıları bozan EDTA'nın eklenmesiyle sağlanır34,35. Bu dekstran gavage analizi, gavage prosedürünün istenmeyen doku hasarı olmaksızın güvenli bir şekilde gerçekleştirildiğini kanıtlamak için bir kalite kontrol testi olarak kullanılabilir. Ek olarak, bu analiz genotip veya tedavinin bir fonksiyonu olarak bağırsak bariyer bütünlüğünü test etmek için kullanılabilir.

  1. Şu gavaj çözeltilerini hazırlayın: %1 dekstran/1x PBS/%0,05 fenol kırmızısı ve %1 dekstran/20 mM EDTA/1x PBS/%0,05 fenol kırmızısı (pozitif kontrol). ddH2O içindeki %5 dekstran stok çözeltisi, donma-çözünme döngüsü sayısını azaltmak için -20 °C'de 50 μl'lik alikotlar halinde saklanır. Ayrıca, 1x PBS/%0,05 fenol kırmızısından oluşan bir yalancı (mock) gavaj çözeltisi hazırlayın.
    + kontrol (EDTA)EDTA yok
 stokfinalseyreltme faktörü10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dekstran5%1%522
PBS10x1x1011
Fenol Kırmızısı0.50%0.05%1011
   ara toplam:54
   ddH2O:56
   Toplam:1010
  1. Her bir deneysel koşul için 10-20 zebrafish larvasından oluşan gruplara gavage yapmak için bölüm 3'teki protokolü kullanın. Mümkünse bunu çift veya üçlü gruplarda tekrarlayın.
  2. Gavage işleminden sonra larvaları anesteziden uyandırın ve taze ortamda serbestçe yüzmelerine izin verin.
  3. Gavage sonrası 18-20. dakikada, larvaları adım 3.3'te olduğu gibi yeniden anesteziye alın. Larvaları, %3'lük agaroz blok üzerinde %3'lük metilselüloza yerleştirin (bu, görüntüleme sırasında arka plan parlamasını azaltır).
  4. Larvaları, bir floresan stereomikroskop (örneğin, Leica M205C) ve Texas Red filtre seti ile, larvaları burun ucundan kloakanın hemen arkasına kadar görüntüleyen bir büyütmede görüntüleyin.
  5. Tüm görüntüleri, daha sonra nicelleştirilebilmeleri ve karşılaştırılabilmeleri için aynı pozlama ayarlarında edinin. Dekstran enjekte edilen tüm larvaların bağırsak lümeninde floresan yoğun olacaktır, ancak bariyer fonksiyonu, bağırsak dışı dokularda (yani, gövde ve kan damarlarında) görünen dekstran seviyesi ile değerlendirilir (Şekil 5). Pozlamayı, lümen floresansı aşırı pozlandığında bile gövde floresansının görselleştirilmesine olanak tanıyan ayarlara getirin.
  6. Gavage zamanlarını, her grubun gavage sonrası yaklaşık aynı süre boyunca toparlanma aşamasında kalması ve gavage sonrası yaklaşık aynı zamanda görüntülenmesi için kademeli olarak ayarlayın. Bu deneyde, her grubun tek bir kişi tarafından tamamlanması yaklaşık 1 saat sürer. Balıklar gavage sonrası 18-20. dakikada anesteziye alınır ve görüntüleme balık başına ~1-2 dakika sürer.
  7. Gövdenin bağırsak hemen üzerindeki bir bölgesindeki göreceli ortalama floresan yoğunluğunu nicelleştirmek için ImageJ gibi bir görüntü analiz programı kullanın. Bu değerleri, görüntünün balık dışındaki bir bölgesinden alınan arka plan ölçümünü çıkararak normalize edin.
  8. Görüntü analizinden elde edilen verileri GraphPad Prism veya benzeri bir istatistiksel yazılım kullanarak grafikleştirin ve analiz edin.

5. Bağırsak Motilitesini Test Etmek İçin Floresan Mikrosfer Analizi

Gavage, bağırsaklara iletilen materyalin zamanlaması ve miktarı üzerinde gelişmiş bir kontrol sağlayarak, onu bağırsak motilitesi çalışmaları için ideal bir alternatif yöntem haline getirir. Zebrafish larvalarında bağırsak motilitesini ölçmek için daha önce yayınlanmış teknikler arasında, bağırsak kontraksiyonlarının ve dalgalarının mikroskopi ile doğrudan gözlemlenmesi1,21,36 veya larvaların sarı-yeşil floresan polistiren mikrokürelerle karıştırılmış yemle beslenmesi26 yer almaktadır. Bazı çalışmalarda, bağırsak motilitesi paternlerinin nicelleştirilmesi, larvaların gıda boyası içeren ortamlara37 daldırılmasıyla veya spatiotemporal mapping adı verilen özel bir video analiz tekniğiyle38,39 geliştirilmiştir. Burada, floresan mikrokürelerin bağırsak anterior bulbuna gavage yoluyla verilmesinin mümkün olduğunu ve mikroküre hareketlerinin takibinin bağırsak motilitesini değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermek amacıyla bir kavram kanıtlama çalışması sunuyoruz (Şekil 6). Bu yöntem ile Field ve meslektaşlarının26 yaklaşımı arasındaki temel fark, boncukların tek başına verilmesi ve gavage iğnesi çap sınırlamaları nedeniyle yeme dahil edilememeleridir.

  1. Zebrafish larvalarını, deney 7 dpf'de gerçekleştirilene kadar 35 ml medyum içeren 10 cm'lik plakalarda muhafaza edin. Larvaları, 5 dpf'den itibaren her sabah bir kez ~0,6 mg toz yem ile (daha önce tanımlandığı üzere larvalar diyeti40; steril, 1 mm'lik bir ekim özesi kullanılarak uygulanır) beslemeye başlayın.
  2. Süspansiyonu karıştırmak için Fluoresbrite YG 2,0 μm polistiren mikroküre şişesini (~%2,5 sulu süspansiyon) nazikçe çalkalayın. Pipetleme yoluyla belirli bir hacmin ölçülebilmesi için şişeden bir damlayı parafilme aktarın.
  3. Bir eppendorf tüpü içerisinde, boncukları masaüstü mikrofüjle düşük hızda santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve orijinal hacimde 1x PBS ile değiştirin. Mikroküreleri 2 kez yıkamak için bu işlemi tekrarlayın.
  4. %0,25 mikroküre (stok süspansiyonun 1:10 seyreltme oranı)/1x PBS/ %0,05 fenol kırmızısı içeren bir gavage süspansiyonu hazırlayın. Larva başına uygulanan 4,6 nl gavage hacminde ~2,6x103 mikroküre bulunmaktadır.
  5. İstenilen sayıdaki larvaya gavage yapmak için bölüm 3'teki protokolü kullanın. Mikroküreler bir miktar yüzer niteliktedir; bu nedenle, süspansiyonun tutarlılığını maksimize etmek için gavage işlemi mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir.
  6. Bu deneyde, bireylerdeki transiti takip edebilmek amacıyla 15 larva gavagedi ve anesteziden kurtulduktan sonra 12 kuyucuklu bir plakanın tekli kuyucuklarında muhafaza edildi. Ancak, daha büyük gruplara da gavage yapılabilir ve transit bireysel olarak değil, popülasyon olarak değerlendirilebilir. Standart uygulamalar için Field et al. kaynağına bakınız26.
  7. Canlı larvalarda floresan mikrokürelerin en rostral (veya anterior) konumunu, floresan stereomikroskop kullanarak farklı zamanlarda puanlayarak intestinal motiliteyi değerlendirin. Larvaları kısa süreliğine 1x (%0,017) trikain ile anesteziye alın ve mikroküre konum bölgelerini puanlayın veya daha sonra puanlamak için görüntüler yakalayın.
  8. Belirli bir intestinal bölgede mikroküreleri olan toplam larvaların yüzdesini zaman içinde grafikleyin ve karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Gavage işlemi uygun şekilde gerçekleştirildiğinde, iletilen materyalin tamamı ön bağırsağın içinde yer almalı ve özofagusta çok az veya hiç kalıntı materyal bulunmamalıdır (Şekil 3). Ön bulb tarafından karşılanabilecek ve kloaka veya özofagus yoluyla dışarı sızmayacak bir iletim hacmi seçilmelidir. Materyal hacmi veya iletim basıncı çok yüksek olursa, gavajın fiziksel kuvveti epitelde hasara veya sızıntıya yol açabilir. Ayrıca, lokal biyokimyasal ortamı değiştirerek sonuçları potansiyel olarak bozabilece...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, mikro-gavaj yoluyla zebra balığı larvaları bağırsaklarına materyallerin doğrudan iletimi için yeni bir protokol tanımlıyoruz. Prosedür boyunca göz önünde bulundurulması gereken birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, tedaviyle ilgisiz ölümleri önlemek için zebra balığı larvaları gavaj deneyinden önce sağlıklı durumda olmalıdır. Bir diğer önemli faktör ise gavaj iğnesinin kalitesidir. Protokolün en zor kısımlarından biri, keskin ve pürüzlü kenarlar oluşturmadan iğneyi uygun yerden kesmektir. Daha tutarlı bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

İçerikle ilgili faydalı önerileri için Rawls laboratuvarı üyelerine, sıkı bağlantı boyut geçirgenliği ve bozulma yöntemleri üzerine değerli tartışmaları için Dr. Alan Fanning'e teşekkür ederiz. Ayrıca, konfokal mikroskop desteği için Michael Hooker Mikroskopi Tesisi'nden Dr. Michael Chua ve Dr. Neal Kramarcy'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, National Institutes of Health grantleri T32 DK007737-15 (J.L.C. eğitim gören), F32 DK094592 (J.L.C.'ye) ve R01 DK081426 (J.F.R.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Finquel (Tricaine methanesulfonate)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Larva anestezisi
Fenol Kırmızısı ÇözeltisiSigma-AldrichP0290-100 mlDPBS içinde %0.5, hücre kültürü testli
Mineral yağı, hafif, beyaz (yüksek saflıkta)AmrescoJ217-500 mlİğne geri dolumu ve hacim testi için
TxRed-Dextran, 10,000 MW, lizine fikslenebilirInvitrogen/ Molecular ProbesD-18631x PBS/fenol kırmızısı içinde %1 süspansiyon
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653Su içinde 5 mM stok
MetilselülozMP Biochemicals0215549590
Borosilikat cam kılcal tüplerDrummond Scientific3-000-203-G/XOD 1.14 mm, ID 0.53 mm, 3.5 inç uzunluk
Kalıp yapımı için plastik formAdaptive Science ToolsTU-1
Nanoject II mikroenjeksiyon ünitesiDrummond Scientific3-000-204
Flaming Brown Mikropipet Çekici, 3.0 mm geniş oluklu filamentSutter Instrument Co.P-97, FT330Bİğne üretimi
Öğrenci tipi Dumont #5 pensFine Science Tools91150-200.1 x 0.06 mm, iğne kesimi
Oküler Retikülü, 5 mm - 100 bölmeLeica10394771İğne kesimi
MikroforjNarishigeMF-900İğne kesimi ve ateşle cilalama
Tüberkülin SlipTip şırınga iğnesiBecton Dickinson3096261 ml, 25G 5/8-iğne
Fluoresbrite YG Mikroküreler (2.0 μm)Polysciences, Inc.18338Bağırsak motilite analizi
Diseksiyon MikroskobuLeicaS6EGavage işlemi
Floresan StereomikroskopLeicaM205CDekstran bariyer testi
Konfokal mikroskopZeissLSM510Sirkülasyondaki dekstranın görüntülenmesi

Kaynaklar

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikrogavage Tekni iBa rsak L meniFloresan DekstranEmbriyo MikroenjeksiyonuStereomikroskop EkipmanMetilsel loz ile Pozisyonland rmane KalibrasyonuBariyer B t nl AnaliziBa rsak Motilitesi

İlgili makaleler