Açıklanan kolay ve yoğunluk bağımsız zenginleştirme için bir biyotin bağlayıcının aktarmak tıkırtı kimya ve ardından, 5-HMC için bir azit-glikoz aktarmak için β-glukoziltransferaz (β-GT) ile iki aşamalı bir etiketleme bir işlemdir. Bu etkili ve spesifik bir etiketleme yöntemi nesil dizileme ile son derece düşük arka plan ve yüksek verimlilik epigenomic haritalama ile 5-HMC zenginleşmesine olanak sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama
Bu makalede
Özet
Özet
5-metilsitozin (5-mC) insan genomik DNA'daki toplam sitozinler arasında ~% 2-8 oluşturan ve gen ekspresyonu, genom bütünlüğünün korunması, ebeveyn baskılama, X kromozomu inaktivasyonu, düzenlenmesi de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, geniş bir yelpazede etkiler gelişme, yaşlanma ve kanser 1. Son zamanlarda, bir okside 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), varlığında embriyonik sap (ES) hücreleri ve nöronal hücreler 2-4, özellikle de memeli hücrelerinde tespit edilmiştir. 5-HMC TET aile demir (II) / α-ketoglutarat-bağımlı dioxygenases 2, 3 ile 5-mC katalizli oksitlenmesi ile elde edilir. 5-HMC embriyonik kök (MES) hücre normal hemopoeziste ve maligniteler ve zigot gelişimi 2, 5-10 bakımı dahil olmak üzere önerilmiştir. Iyi 5-HMC fonksiyonunu anlamak için, güvenilir ve kolay sıralama sistemi esastır. Geleneksel bisülfit dizileme 5-mC 11 5-HMC ayırt edemez 12 glikoz parçası ekler bir bakteriyofaj enzim yararlanarak, etiketlemek ve 5-HMC yakalamak için oldukça etkili ve seçici kimyasal bir yaklaşım geliştirdik.
Burada 5-HMC seçici kimyasal etiketleme için basit bir iki aşamalı bir prosedür açıklanmaktadır. Birinci adımda etiketleme, genomik DNA 5-HMC 5-HMC için 6-azit-glikoz aktaran bir şekilde, β-GT, T4 bakteriyofaj bir glukoziltransferaz ile bir 6-azit-glikoz katalize ile etiketlenir Modifiye kofaktör, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). İkinci adımda, biyotinilasyon, bir disülfid biyotin linker klik kimyası ile azid grubu eklenir. Iki adım genomik bölgelerde 5-HMC bolluğu bakılmaksızın etiketlenmesi ve son derece düşük arka plan vererek tamamlamak için lider, son derece spesifik ve etkili. 5-HMC takibi biyotinilasyon, 5-HMC içeren DNA parçaları daha sonra seçici yakalanırbir yoğunluk-bağımsız bir şekilde streptavidin boncuklar kullanarak. Sonuçta ortaya çıkan 5-HMC-zenginleştirilmiş DNA fragmanları, yeni nesil dizi analizi de dahil olmak üzere aşağı akım analizleri için kullanılabilir.
Bizim seçici etiketleme ve yakalama protokol çeşitli / değişken 5-HMC bolluğu ile genomik DNA herhangi bir kaynak için geçerli yüksek hassasiyet, bahşeder. Bu protokolün amacı ve mansabındaki uygulaması (yani., Yeni nesil dizileme genomunda 5-HMC dağıtım haritaya) olsa da, tek-molekül, bir gerçek zamanlı SMRT (DNA) dizi ile uyumlu 5-HMC tek-baz çözünürlük sıralama sunma yeteneğine.
Protokol
1. Genomik DNA Parçalanma
İstediğiniz bir boyut aralığına sonication kullanarak Fragment genomik DNA genom dizileme platformu için uygundur. (Genellikle ~ 300 bp ile sonikasyon.)% 1 agaroz jel (Şekil 1) üzerinde dağınık genomik DNA'nın boyutu dağılımı kontrol edin.
2. DNA Preparation
Genomik DNA 5-HMC bolluğu dayalı başlayarak DNA miktarları belirleyin. 5-HMC düzeyleri farklı doku tiplerinin anlamlı farklılık olduğu, başlangıç DNA miktarları numunelerin 5-HMC seviyeleri bağlıdır. Örnekler için Tablo 1'e bakınız.
3. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hydroxymethylcytosine 5-(5-HMC) belirli memeli hücre türleri içinde önemli miktarda yeni tanımlanmış bir epigenetik modifikasyon mevcuttur. Burada sunulan yöntem, 5-HMC arasında genom dağılımı belirlemek içindir. Biz 5-HMC bir hidroksil grubu üzerine bir azid grubu ihtiva eden bir mühendislik glikoz yarımı aktarmak için β-glukoziltransferaz T4 bakteriyofaj kullanır. Azid grubu kimyasal memeli genomları 5-HMC içeren DNA parçalarının tespiti, afinite zenginleştirme ve sıralama için biotin ile değiştirilebilir. Bu protokol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (CH ve NS051630/MH076090/MH078972 için PJ için GM071440) tarafından kısmen desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Isim | Şirket | # Katalog | Yorumlamak |
| Reaktifler | |||
| 5M Sodyum klorür (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5 M pH 8.0 Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma tabanı (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnezyum klorür (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530g | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-SS-PEG3-Biotin konjugat | Kimya Araçlar'ı tıklayın | A112P3 | |
| 1,4-ditiyotretol, son derece saf (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nükleotid Kazıma Seti | Qiagen | 28304 | |
| Mikro Bio-Spin 6 Sütun | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Arıtma Kiti | Qiagen | 28004 | |
| Ultrapure Agaroz | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N 3-glikoz | Aktif Motif | 55013 | |
| Enzim | |||
| β-glukoziltransferaz (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Ekipman | |||
| Sonikasyon cihazı | Covaris | ||
| Masaüstü santrifüj | |||
| Su banyosu | Fisher Scientific | ||
| Jel çalışan cihazlar | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tüp Çalkalayıcı | Barnstead | ||
| Labquake Tüp Çalkalayıcı | Thermolyne | ||
| Manyetik Ayırma Standı | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometre | Invitrogen | ||
| Reaktif kurulum 10 X β-GT Reaksiyon Tamponu (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X bağlayarak ve (10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl,% 0.02 Tween 20) (B) tampon yıkama . |
Kaynaklar
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell s....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
