Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

Özet

Erişkin farelerin spermatogoniumların ve progenitör hücre hatları türetmek ve korumak için basit bir yöntem sunulmuştur. Yöntemi yetişkin fare testis somatik hücre bölmesi kaynaklanan besleyici hücreler kullanır. Bu teknik transgenik, knock-out dahil, ortak fare suşları, uygulanabilir ve knock-fareler.

Özet

Spermatogonial sapı ve testis progenitör hücreler (DGM'ler) yetişkin memeli kök hücreler klasik bir örneği temsil ve hayvanın neredeyse ömür boyu fertilite. In vivo kendini yenileme ve farklılaşma yöneten kesin mekanizmalar çalışmaya zor olsa da, çeşitli sistemler özel kültür ortamı ve ^1-3 besleyici hücreler bir arada kullanarak in vitro fare DGM'ler yaymak için önce geliştirilmiştir.

DGM'lerin biyoloji içine vitro baskınlarınızda Çoğu yetişkin hücre hatları ⁴ temininde zorluk nedeniyle muhtemelen yenidoğanlarda, hücre hatları elde var. Ancak testis Birçok fare suşları yaş ~ 5 haftaya kadar olgun devam. Erken post-natal dönemde, dramatik değişiklikler testisin mimarisi ve somatik ve çok sayıda kök hücre ile ilgili ifade düzeylerinde değişikliklere dahil spermatojenik hücrelerde, hem de biyoloji meydanagenler. Bu nedenle, neonatally-türetilmiş SSC hatları tamamen erişkin testis kararlı bir duruma ulaşmıştır sonrasında da devam eden yetişkin DGM'lerin biyoloji recapitulate olmayabilir.

Çeşitli faktörler tarihsel yetişkin SSC hatlarının üretim engellemiştir. Birincisi, fonksiyonel kök hücrelerinin oranını intrinsik veya ekstrinsik faktörler ^5,6 nedeniyle ya, yetişkinlik döneminde azalabilir. Ayrıca, diğer yetişkin kök hücreler gibi, bu immunoselection veya diğer sıralama stratejileri ⁷ bir arada kullanarak olmadan toplam erişkin testis hücreleri yeterince DGM'ler zenginleştirmek için zor olmuştur. Yaygın olarak kullanılan stratejilere diğer hücre tipleri ⁸ için kök hücreleri, daha yüksek bir oranı nedeniyle donör hücrelerinin kaynağı olarak krip farelerin kullanımını içerir. İlk kültürden somatik hücre çıkarılması SSC hayatta kalmak için gerekli olan kök hücre niş ile etkileşimleri bozan hipotezini dayanarak, daha önce yetişkin l türetmek için yöntemler geliştirdiimmunoselection veya inmemiş bağış gerektiren ziyade kültür DGM'lerin seri zenginleştirme istihdam yok ines, SESC ^2,3 olarak bundan anılacaktır.

Aşağıda açıklanan yöntem testiküler stromal hücre hattı (JK1) ³ oluşan besleyiciler üzerinde hücrelerin kaplama ardından yetişkin donör seminifer tübüller, dissociating erişkin SSC hatları türetmek için basit bir prosedür gerektirir. Seri Through olmayan germ hücreleri kirlenmesine, güçlü savunucusu pasajlanmasını DGM'lerin beraberinde zenginleştirme ile kültürden tüketilmiştir. Bu şekilde üretilen Kültürler uzun süreli kendini yenileme kabiliyeti esas DGM'lerden ihtiva eden çeşitli evrelerinde de spermatogonia bir karışımını içerir. SESC yöntemin en önemli noktası, bir kökten farklı mikroçevresindeki vitro uzun vadeli kendini yenileme in vivo kendini yenileme gelen zor geçiş yapmak için DGM'ler sağlıyor olması, kirletici ücretsiz, uzun vadeli SSC çizgiler üretirsomatik hücre, ve böylece DGM'lerin sonraki deneysel işleme sağlar.

Protokol

1. Besleyici Hücrelerinin Hazırlanması

Aşağıda açıklanan tüm reaktifler (Tablo 1 ve 2) steril bir şekilde hazırlanması gerektiğini unutmayın. Bu protokol, erişkin fare somatik hücre testis dönüştürülmüş bir türevidir ve başka bir yerde ³ tarif edilmiştir besleyiciler JK1 hücre hattı (Hücre Biolabs, Inc, katalog # CBA-315) kullanılır. Bütün hayvan prosedürleri kurumsal kurallar ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmesi gerektiğini de unutmayın.

1. JK1 hücreler kültür korunur ve geçit 39 başarıyla besleyiciler kadar kullanılabilir. Filtre ile sterilize edilmiş besleyici büyüme ortamı 10 ml ile 100 mm'lik bir hücre kültürü çanağı (BD Falcon, katalog # 353003) kültür içinde hücreleri JK1 (DMEM ile desteklenmiş% 10 fetal bovin serumu [FBS], 2 mM L-glutamin ve antibiyotikler). Kültür% 95 izdiham ulaştığı zaman, hücrelerin oranı 01:06 -1:10 ayrıldı.
2. Konfluent JK1 besleyici hücre mono ortamı çıkarınkatmanı.
3. Kalsiyum ve magnezyum olmadan bir kez PBS ile hücre tabakası yıkayın.
4. Önceden ısıtılmış tripsin / EDTA, 1x (% 0.05 trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, katalog # 25-051-CI) ekleyin ve 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edilir.
5. Besleyici büyüme ortamında eşit hacmi ile tripsin inaktive eder. Hücreleri toplamak ve 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj. Besleyici büyüme ortamında hücreleri yeniden askıya.
6. Kuyu kapağı ve oda sıcaklığında 5 dakika sonra kaldırmak için yeterli% 0.4 jelatin solüsyonu ilave edilerek ön-kaplama, çok iyi hücre kültür plakaları.
7. Levha ~ jelatin kaplı hücre kültürü plaka mm ² başına 250 hücre (örneğin 48-iyi ya da 6-biçimi). 16 ila 24 saat süre ile 37 ° C 'de kültür inkübe edin.
8. Kuyulardan kültür ortamı çıkarın. DİKKAT: hücre büyümesi inaktive etmek için DMEM içinde seyreltilmiş 10 ug / ml 'de mitomisin-C taze bir çözelti eklemek için, her bir kuyucuğa (örneğin, 200 ul / çukur bir 48 kuyulu plakanın için). Mitomisin-C toksiktir. Dikkatlice taşıyınız ve atın. Inkübe37 ° C'de 4 saat için.
9. Hücrelerinden mitomisin-C çözüm çıkarın. Kaplama kök hücreler önce DMEM ile 3 kere yıkayın.
10. Besleyici hücreler kuyulardan DMEM çıkarın ve yeterince kök hücre, orta (100 ul / iyi bir 48 kuyulu plakanın; bkz. Tablo 3) ekleyin pasajı sırasında besleyiciler kuruma önlemek için. Besleyiciler içeren kuyuların belirtilen boyutlarda kullanarak, bölümler 3.1 veya 3.4 'de aşağıda açıklandığı gibi, aynı gün DGM'lerin ekleyin.

2. Fare Testis Doku Ayrılma Donör Germ Hücreleri Edinme

1. Hasat yetişkin fare steril moda testis ve geçici bir kapalı Petri (herhangi bir sıvı olmadan eklenen) testislerde saklayın. Desikasyona önlemek ve hücre canlılığı korumak için çanak buz üzerinde hemen yerleştirilir gerekir.
2. ¾ mesafesi thr - steril ince forseps ve hücre kültürü kaputu ince bir makas kullanarak, tamamen testis (yani, kesme ~ ½ transecting olmadan tunika albuginea bir transvers kesi yapmakough) ve plaka bir köşeye seminifer tübüller sıkmak için forseps kullanın; ıskarta tunika ve ekli doku. Böylece onun bütünlüğünü korumak ve buharlaşmasını önleyen, doku soğutulmuş tutmak boyunca buz üzerinde plaka tutun.
3. Buz üzerinde plaka tutarak hızla, ince makas makas testis başına en az 3 dk tübüller kıyma.
4. 50 ml konik tüp tübül parçalarını toplamak ve albümin soğutulmuş PBS /% 1 sığır serum ~ 40 ml yıkayın.
5. Spermatozoa ve enkaz tübül parçalarını ayırmak için 10 dakika boyunca 60 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
6. Bir 15 ml'lik konik bir tüp içinde, önceden ısıtılmış ayrışma tampon testis başına 3 ml (DMEM,% 0.05 tripsin,% 0.03 collagenase tip I, 80 U / ml DNAz I ve% 0.5 sığır serum albümini olarak pelet tekrar süspansiyon; bak Tablo ayrışma tampon daha özel ayrıntıları için 2).
7. Bir üst düzeye çıkarmak için 15 dakika için 37 ° C 'de 150 rpm bir çalkalama kümesindeki bir raf yatay olarak konik boru yerleştiringitation.
8. Ayrışmamış parçalarını ayrı tek hücreler için 10 dakika boyunca 60 xg'de aşağı spin.
9. Sonraki adıma kadar pelet içeren parçaları kaydedin. Adım 2,8 süpernatant toplayın ve disosiyasyon tamponu nötralize etmek için 3 ml DMEM/10% fetal sığır serumu ekleyin. Geçici buz üzerinde tüp yerleştirin.
10. Adım 2.9 'dan kaydedilen pelet ile 2,6-2,7 adım adım 2.8 sonra kalan re-digest parçalar için tekrarlayın.
11. Disosiyasyon tampon nötralize etmek DMEM/10% FBS eşit hacimde ekleyin.
12. Adım 2.9 kaydedilen hücre süspansiyonu ile adım 2.11 dan recombine süspansiyon. 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
13. Testisler çifti başına 16 ml'lik bir hacme kök hücre ortam içinde yeniden süspanse pelet (bkz. Tablo 3).

3. Testis Hücre Süspansiyon Kaplama

1. Hücre süspansiyonu Plaka 2 ml başına iyi bir 6-plaka içeren besleyici hücreler 37 & bir hücre kültürü inkübatör mitomisin-C ve yer ile mitotik-inaktivedeg; C% 5 CO _2.
2. 48 saat, aspirat orta sonra 2 ml taze orta ekleyin ve inkübatör dönmek.
3. 48 saat sonra, her bir kuyunun 0.5 ml taze kök hücre orta ekleyebilir ve inkübatör dönmek.
4. 48 saat sonra, daha sonra hücrelerin haftada üç kez daha sonra gibi büyük, gizli koloniler (> 50 hücreleri) (7 ile 21 gün içinde) görününceye kadar takip besleyebilir. Her hafta beslenme birinci ve ikinci (örneğin Pazartesi ve Çarşamba) için orta ~ 50% kaldırmak ve taze orta hacimce geri% 50 ekleyin. Üçüncü besleme için (örneğin Cuma), tüm orta aspirat ve 2 ml taze ortam ile değiştirin. Bu yaklaşım, tam bir ortam değişikliği kaçınma kültür ortamı içine salgılanan ⁹ parakrin sinyallerin konsantrasyonlarda dalgalanmaları en aza indirir mantık dayanmaktadır.

4. İlk Passage Colony Picking

1. Geçişli olması kuyulardan içeren kolonilerden orta çıkarın ve taze kök hücre ortamı ekleyin.
2. 10x objektif kullanarak kolonileri tanımlayın. Mikroskop hafifçe de-odaklı ile iyice kenarında SSC koloniler hücreler bu yana, zor ya da tek bir hücre sınırlarının ayırt etmek mümkün olan pek çok 11-12 mikron çaplı hücreler, oluşan homojen parlak kümeleri gibi görünür (Şekil 1A) kaynaşarak görünür. Sigara SSC kolonileri gözle görülür sınırları (Şekil 1A, inset) ile, daha karanlık, daha taneli, az ya da çok homojen görünebilir.
3. 50 ul pipetteman seti ile, bir 200 ul pipet kullanarak, ilk kuyudan orta sürebilir ve ucu ıslatmaya sınırdışı. Sonra, yavaşça hızla ucu (Şekil 1B) içine emiş tarafından koloni çıkarmak için orta 50 ul çekmeden ucuyla koloni dürtmek.
4. Stem hücre ortamı (Şekil 1C) 100 ul ile inaktive edilmiş besleyici hücreleri ihtiva eden bir 48-kuyulu plakanın içine de bir koloni içeren ortam Expel.
5. Adımı tekrarlayınKuyu başına 500 ul aşmadan aynı zamanda 8 koloniler 4.3 ve ekleyebilirsiniz.
6. Geçit tek SSC kolonileri ile 48 plaka ek kuyuları hazırlamak için 4,3-4,5 adımları tekrarlayın.
7. Wells 7-14 gün veya 500 hücre (Şekil 1D) ortaya çıkmış büyük kümeleri sonra bölmek için hazır olacak.

5. Ufalama tarafından DGM'lerin sonraki Genişleme ve Pasajlanması

1. Geçit birinde Hücreleri 01:06 (her 7 gün) sonra aşağıdaki gibi ilk 3 pasajlar için 1:2 bölünmüş oranı ve ardından 01:04 14 gün sonra taze besleyiciler üzerine kadar pasajlandı edilmelidir. Yavaşça hücreler boyunca orta yıkama tarafından 1 ml pipet ile bir yarı-birleşik de kapalı koloniler (örn. ~ 300.000 DGM'ler / iyi 6-plaka) çiğnemek. Koloniler ayırma görülebilir. Sıvı akışı ile çok fazla kuvvet istenmeyen besleyici hücreler çok çıkmasına sebep olacaktır.
2. Için 300 xg'de konik bir tüp ve santrifüj tritüre hücreleri toplayın5 dk. Not: araştırmacı tarafından arzu edildiği takdirde, tripsinizasyonla adım burada güvenli bir şekilde ilave edilebilir.
3. Süpernatant aspire ve iyice koloniler bozmaya yukarı ve aşağı pipetleme taze kök hücre ortamda yeniden askıya.
4. Mitomisin-C ile inaktive taze hazırlanmış besleyici hücreler levhalar DGM'ler gibi 1. bölümde anlatılan.
5. Hücreler haftada aşağıda üç kez besleyin. Birinci ve ikinci besleme için (örneğin, Pazartesi ve Çarşamba) taze orta hacimce% 50 ekleyin. Üçüncü besleme için (örneğin Cuma), tüm orta aspirat ve 2 ml taze ortam ile değiştirin. Tabaklar 7-10 gün içinde confluent olacak. Kültürler somatik hücreleri ¹⁰ germ hücreleri ayırt etmek için (örneğin fare germ hücre belirteci GCNA kullanarak) immünboyama esas 5-7 pasajlar sonra>% 98 germ hücrelerinin (yani, <% 1 kirlenmesine somatik hücre) oluşmalıdır. Not: Bu yöntemler Kurum tarafından belirlenen düzenlemeler ve gereksinimler ile uyum içinde geliştirilmiştirWeill Cornell Medical College arkadaşları Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi.

Sonuçlar

Geçit sıfır vahşi tip görünümü, 7 gün sonra yetişkin SSC koloniler Şekil 1 'de gösterilmiştir. Üç-boyutlu koloniler üzerine artan DGM'lerin çoklu katmanlar ile besleyiciler tarafından tevdi besleyiciler veya ast ekstraselüler matriks bağlanmış düz bir hücre tabakası oluşmaktadır. Sağlıklı DGM'ler parlak refraktil ve tekdüze 11-12 mikron çaplı olmasına karşın, hücre kenarlıkları ayırt etmek zordur ve sömürgelerin büyüklüğü de içinde ve farklı fareden hazırlanan kuyuları arasındaki, hem son de...

Tartışma

Erişkin testis kaynaklı besleyici hücreler kullanılarak erişkin DGM'ler türetmek için bu yöntem sağlam ve ortak genetik kökenden (örneğin FVB, C57Bl6 ve karma 129SV/C57Bl/6) ve farklı mutant suşlar ^2,3,7,14 istihdam edildiğinde başarmıştır. ⁷ Aslında, kültür sistemi tarafından oluşturulan in vivo mikroçevrede yetişkin DGM'ler ^{- (- /} hayvan plzf durumunda olduğu gibi) sürdürülmesi için genetik duvarlar bazılarının üstesinden gelmek için yeterlidir. Bu be...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
DMEM	Corning	10-013	Dissosiyasyon arabelleği için Seyreltici
Tripsin / EDTA	Mediatech	25-051-CI
Kök hücre baz ortamı (StemPro-34)	Yaşam Teknolojileri	10639-011	Shinohara ark başına takviyesi gerektirir. (2003) *
Hücre orta takviyeleri Kök	çeşitli	Tablo 3'e bakınız	Shinohara ark başına takviyesi gerektirir. (2003) *
JK1 hücrelerin	Hücre Biolabs, Inc	CBA-315	Başına Seandel ark erişkin testis stromal hücreleri ile ikame edebilir. (2007)
mitomisin-C (DİKKAT)	Sigma-Aldrich	M4287	Toksik; dikkatli olun.
Jelâtin	Sigma-Aldrich	G1890	Su içinde% 0.4 çözümü
EVOS xl dijital inverted mikroskop	Gelişmiş Mikroskopi Grubu	-
			Tablo 1. Özel reaktifleri ve ekipmanları. * Çizelge 3'e bakınız
DMEM	Corning	10-013	Dissosiyasyon arabelleği için Seyreltici
tripsin (1:250)	Yaşam Teknolojileri	27250-018	Ayrılma tamponu: 0.05 Final% ağırlık / hacim
kollajenaz, 235 U / ml tip I	Worthington	CLS1 235	Ayrılma tampon: Final% 0.03 ağırlık / hacim
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Ayrılma tampon: Final 80 U / ml
sığır serum albümin	ICP Bio	ABRE-100g	Ayrılma tampon: 0.5 Final% ağırlık / hacim
			Tablo 2. Ayrışma tampon
StemPro-34 SFM	Yaşam Teknolojileri	10639-011
StemPro-34 Besin takviyesi	Yaşam Teknolojileri	10639-011
Ek takviyeleri **
Non-esansiyel amino asitler	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM vitamini çözüm	Yaşam Teknolojileri	11120-052	1X
L-glutamin	Mediatech	25-005	2 mM
sığır serum albümin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiyotik-Antimikotik Çözümü	Mediatech	30-004-CI	1X
D (+) glikoz	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg / ml '
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng / ml
progesteron	Calbiochem	5341	60 ng / ml '
fetal bovin serumu	değişken	n / a	% 1
Sığır sanal-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 ug / ml
ensülin	İkizler Bio-Ürünler	700-112P	25 ug / ml
İnsan GDNF	Yaşam Technologies	PHC7041	10 ng / ml '
insan bFGF	Yaşam Teknolojileri	PHG0023	10 ng / ml '
fare EGF	Yaşam Teknolojileri	PHG0313	20 ng / ml
putressin	Araştırma Organics	0778P	60 uM
sodyum selenit	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
piruvik asit	Alfa Aesar	A13875	30 ug / ml
DL-laktik asit	JT Baker	0196-04	1 ug / ml
β-merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985-023	50 uM
askorbik asit	Sigma-Aldrich	A4544	100 uM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ug / ml
			Tablo 3. Hücre orta Kök
			* Not: orta kullanmadan önce aşağıdaki takviyeleri ekleyin. Filter 4 ° C'de sterilize etmek ve tutmak Ortam, en az 2 hafta boyunca stabildir.
			** Biz görünürde herhangi bir zararlı etki olmaksızın farklı üreticilerin, formülasyonları ve / veya bu reaktiflerin lot numaraları istihdam var. Genel olarak, hücre kültürü sınıf reaktifler kullanılmalıdır.