Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Summary

2-foton mikroskopi yüksek çözünürlüklü intavital kullanan bir teknik doğrudan görselleştirmek ve yüzey glomerüllerde gloemrular filtrasyon ölçmek için. Bu yöntem, normal ve hastalıklı hem Devletler makromoleküllerin geçirgenlik özelliklerinin doğrudan belirlenmesi için olanak sağlar.

Abstract

Bu albümin serum, uzun geçirgenliği podocytes oluşan bariyer, damar endotel hücreleri ve uyum içinde çalışan bir bazal membran değişiklikler neden olduğu düşünülmüştür gibi büyük temel makromoleküllerin idrar kaybı, ilgili Böbrek hastalıkları. Intravital 2-foton mikroskopi kullanılarak laboratuarda elde edilen veriler, proksimal tübül hücreleri (PTC), ^1,2 adlandırılan hücrelerin erken altkümedeki süzüldü albümin alma ile daha önce fizyolojik koşullar altında düşünce göre daha geçirgen glomerüler filtrasyon bariyer ^(GFB), ortaya ^3.

Önceki teknikler böbrek filtrasyon incelemek için kullanılır ve sıvı içerik ve analiz ⁴ örnekleme ile bu ilk boru bölümlerinin lümeninin micropuncture dahil Süzme bariyerinin karakteristik kurulması. İlgili yakından; Bu çalışmalar yok denecek kadar olması luminal sıvı albümin konsantrasyonu tespitnormalde idrarda tespit ne için. Ancak, bu teknik tarafından tanımlanan boyutlar ile dekstran polimerlerin karakterizasyonu serum albümin benzer bir büyüklükte, ortaya boru şekilli lümeni ve idrarda yüksek seviyelere sahipti; artan geçirgenliği ⁵ düşündürmektedir.

Burada doğrudan görselleştirmek ve in vivo olarak glomerüler floresan albümin geçirgenliği ölçmek için kullanılan tekniğin ayrıntılı bir taslak olduğunu. Bu yöntem, Bowman adlı kullanıcının alanı (idrar filtrasyon ilk odası) içine filtrasyon bariyeri genelinde filtre albumin tespiti için izin verir ve aynı zamanda proksimal tübüllerde ve sonraki albümin transcytosis ⁶ görselleştirme ile albümin reabsorbsiyonu ölçümü sağlar. Mesane yolda daha sonra boru segmentleri boyunca floresan albumin yokluğu önceki proksimal tübül segmentlerinde alma yolunun etkinliğini vurgulamaktadır. Ayrıca, bu teknik uygulandığında geçirgenliğini saptamak içinalbumin, hemen hemen aynı geçirgenlik değerlerine benzer bir boyutu olan dekstranlar ^2. bildirildi. Bu gözlemler doğrudan proksimal tübül hücre ıslahı dahil değişiklikler için birçok proteinürik böbrek hastalıklarının odak genişletmek için ihtiyaç destek.

Protocol

1. Sulfo-Rodamin 101 Sülfanil Klorür (Texas Kırmızı) için Albümin Rat Serum Çekimi

1. Nihai konsantrasyon 50 ml konik bir tüp içinde 15 mg / ml, 100 mM sodyum bikarbonat pH 9.0 arasında Rat (RSA) Serumu Albümini 6.667 ml, 100 mg çözülür.
2. Yeri buz / su kabı çözüm ve 0 ile 4 ° C arasında serin
3. 15 saniye boyunca ortam üzerinde girdap; Texas Kırmızı sülfonil klorit (TRSC) bir 10 mg flakon için yüksek kaliteli susuz dimetil formamid (DMF) içinde 200 ul ekleyin.
4. Vortex RSA ortamda çözüm ve çözünmüş TRSC ekleyin.
5. Folyo ile sarın 50 ml konik (oluşan Parafilm sıkı bir mühür sağlamak için kullanılabilir), yatay w / buz sadece ve ....

Results

Şekil 3 Münih Wistar Frömter sıçan ve floresan albumin geçirgenliğini belirlemek için atılan adımların bir yüzey glomerulus alınan bir görüntü bir örneğini göstermektedir. 0.0111 albumin için GSC değeri Münih Wistar rat zaman beslenen durumu ³ bu gerginlik görülen aralığında bu bireysel glomerulus sonbaharda elde. Bu görüntüler görülen kararlılık dikkatli planlama ve Şekiller 1 ve 2 de gösterilen, talimatların yürütülmesi kaynaklanmaktadır. Daha önce belirtil.......

Discussion

Burada vurgulanan adımları biz aşağıdaki tuzaklar aşmak için tutarlı ve doğru geçirgenlik değerleri üretecek olanlar için ne hissediyorum temsil:

1. Saçılma: uzun dalga boyu fotonlar dağılım daha az eğilimli olduğundan kırmızı yayan fluorophores kullanımı ışık daha verimli toplama için izin verir. Ya yeşil ya da mavi yayan fluorophores kullanarak çünkü kılcal döngüler ve Bowman adlı kullanıcının alanı ³ yoğunluk değerleri artan değişkenlik GSC yıllarda büyük değişim tanıtacak.
2. Resim derinl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 konfokal/Çoklu foton mikroskobu	Olympus America		Dedektörler için filtreler: Mavi 430/100, Yeşil 525/50, Kırmızı 605/90
Mod Kilitli Ti: Safir Mai Tai Lazer	Spektrumları-Fizik Ayarlanabilir		uyarma dalga boyları: ~750-1150 nm
Galyum arsenit fosfit fotodedektörleri	Hamamatsu Corp		Not: Öne veya Yana monte konfigürasyonlar mevcuttur.
Metamorf Görüntü İşleme Yazılımı	Moleküler Dinamik		Not: Sürüm 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 sürümü
Forseps Elektron	Mikroskobu Bilimleri	Kedi # 78266-04
Mayo Diseksiyon Makası Elektron	Mikroskobu Bilimleri	Kedi # 72962
CA Mikro makas Model 1C300	Elektron Mikroskobu Bilimleri	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatik Forseps (düz)	Elektron Mikroskobu Bilimleri	Cat# 72930
Su Ceketi Battaniyesi + Isıtma Yastığı	Gaymar		T/Pompa PN 11184-000 Battaniye-66N111CC
Repti-Therm Tank Altı	Isıtıcı ZooMed		RH-4
Texas Kırmızı Sülfonil Klorür	İnvitrojen/Moleküler Problar	Kedi # T-353
Sıçan Serumu Albümin	Sigma Aldrich	Kedi # A-6272
Yüksek Kaliteli Susuz DMF	Sigma Aldrich	Kedi # 270547
Strate-Line Otoklav Bandı	Fisher Scientific	Cat # 11-889-1
Willco-dish Lamel Alt Tabaklar (50 mm / 40 mm lamel )	Elektron Mikroskobu Bilimleri	Kedi # 70665-07