Method Article

C. elegans Kemotaksis Deneyi

DOI:

10.3791/50069

⸱

April 27th, 2013

 ,  , 
1Life Sciences, Queen's University , 2Department of Chemical Engineering, Queen's University , 3Department of Biology, Queen's University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir yöntem Caenorhabditis elegans Tarif edilmektedir. Bir kemotaktik indeksi (CI) tam olarak belli hedeflere solucanlar yanıtı değerlendirmek ve suşları ve ilgi bileşikler arasında karşılaştırma bir platform olarak hizmet için bir yol olarak kullanılmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok organizma kemotaksis, gıda kaynakları bulmak zararlı maddeler önlemek ve arkadaşları bulmak için kullanın. Caenorhabditis elegans etkileyici kemotaksis davranış vardır.

Bir odorant için solucanlar yanıtı test arkasında öncül bir alanda koyun ve bir odorant yanıt olarak uyarılmış hareketi gözlemlemektir. Hatta mevcut olan birçok deneyleri ile, önemli örnek boyutu korunarak birbirleriyle solucanlar etkileşimi en aza indirirken, kontrol ve test alanları hem de göreli konumu başlangıç ​​solucan optimize ilerleme 1-10 bir çalışma devam etmektedir. Burada anlatılan yöntemi Bargmann ve ark. 1. tarafından geliştirilen test değiştirerek bu konuları ele amaçlamaktadır. Bir Petri kabı dört parçaya bölünür, "Test" ve iki işaretli iki zıt kadran "Kontrol" belirlenir. Anestezik tüm test ve kontrol sitelerinin yerleştirilir. Solucanlar bir Circl ile plaka ortasına yerleştirilire non-motil solucanlar yok sayılır sağlamak için kökenli etrafında oldu. Dört kadran sistemi kullanılarak yerine bir 2 ya da iki 1 bakılmaksızın başladı kökeni hangi tarafında, onlar test ve kontrol örnekleri eşit uzaklıkta olduğu gibi, solucanlar hareketi önyargı ortadan kaldırır. Bu solucan gecikme ya da amaçlanan yolun yanlış yorumlanması verimli, daha dolambaçlı yol almaya zorlayabilir bir odorant, cevap diğer solucanlar bir küme ile seyahat etmek zorunda olan solucanlar sorunu circumvents. Bu yöntem aynı zamanda daha büyük bir örneklem büyüklüğü olan ve araştırmacı katılımsız tahlil çalıştırın ve ayrılan zaman süresi bitiminde solucanlar puan için izin vererek pratik avantajlar gösterir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ward, 1973 5 kemotaksis testi geliştirdi, ve o zamandan beri geniş kapsamlı uygulamalar olmuştur. Nörobiyoloji kemotaksi testleri kullanarak çeşitli yararlanmıştır olan bir alandır. Koku uyum, öğrenme ve bellek basit bir formu, C. gösterilmiştir kemotaksi testleri 6 kullanarak elegans. Ayrıca göstermek için kullanılmış olduğunu ° C. elegans etanol solucanlar davranışsal plastisite gösterir sadece hoşgörü-bir sonucu gelişebilir, ama bu da solucanlar insanlarda 3 alkol bağımlılığının çalışmada çok yararlı olabilir göstermektedir. Tahliller da C yeteneğini göstermek için geliştirilmiştir elegans dernekler chemoattractants ve gıda (OP50) 7 arasındaki solucanlar tarafından yapılmış olduğunu göstererek kısa ve uzun süreli hafıza depolamak için. Ayrıca C, ilgili mevcut geniş bilgi verilir elegans genomunun, KemotaksiC. s davranış elegans mutasyonlar 1,8 uyararak defalarca değiştirilmiş. Bu, C. geliştirilmesi gibi birçok heyecan verici mühendislik olanakları, sağlar bir biyoremidasyon aracı olarak elegans. Böylece, 1973 yılında kemotaksis testin ilk geliştirme yana, sık sık değişmiş ve disiplinlerden çeşitli gizemleri aydınlatmak için kullanılmıştır.

Bazı testler bir hedefe doğru solucanlar tarafından alınan belirli bir rota keşfetmek amaçladık. Bu tür prototip testi Ward 5 tarafından geliştirilmiştir. Üç solucanlar 15 dakika boyunca erimiş agar üzerine yerleştirilmiştir. Onların hareketleri onlar plakasının merkezinde bir çekici bir degrade kadar plaka çevre gitti onlar sol baskı tarafından takip edildi. Plaka üzerinde tüm solucanlar her deneme sonunda kloroform kullanılarak gözaltına alındı. Bu yöntemin bir alt çekici ve kontrol ile bir levhanın ortasında bir tek solucan yerleştirilmiştirkökeni 2 t eşit ve zıt mesafelerde.

Pierce-Shimomura'nın ve ark. Kemotaksis 9 dahil hareketinin tam doğası gözlemlemek için bir analiz geliştirdik. Bağımsız solucanlar çekici madde kaynağı ile sonuçlanan, 9 cm Petri tabakları çekici veya radyal şekilli degrade bir konsantrasyonunu ihtiva eden ya da yerleştirilmiştir. Solucan tanınan bir bilgisayar yazılım programı gözlenen davranışı kaydetmek için kullanıldı. Mikroskop bağlı bir video kamera tahlil solucan görüş alanında kaldı sağlamak için koştu otomatik olarak Petri kabı ayarlamak için sahne ile birlikte çalıştı. Buradan, daha ayrıntılı bilgi C. tarafından görüntülenen pirouettes nedeni ile ilgili keşfedildi elegans.

Burada açıklanan daha yakın bir şekilde diğer analizler, test bileşikleri için solucanlar büyük bir nüfusun yanıt olarak test edilmiştir. İki çeyrek kemotaksi deneyleri olmuşturÇeşitli nöronlar, reseptörler, ve sinyal iletim molekülleri, C 'oynadığı roller keşfetmek için kullanılan elegans çeşitli bileşikler 1 maruz kalmıştır. 20-50 arasında yıkanır solucanlar, anestetik, sodyum azit (NaN3) birlikte polar ucunda bir çekici ve bir kontrol plakasının merkezine yakın yerleştirilmiştir. 60 dakika sonra, -1.0 den +1.0 değerleri ile bir kemotaktik indeksi cezbedici veya kontrol yapıştırılmış kaç solucan arasındaki fark esas alınarak oluşturulmuştur. Daha önce tahlil katı non-motil solucanlar değerlendirmek için başarısız olsa da benzer bir kemotaktik indeksi, bu makalede rapor tahlilinde kullanılmıştır. Bu deney, daha sonra daha fazla kemotaksisidir nöronal ablasyon etkilerini test uygulandı.

100-200 solucanlar dört kadran 3 içeren bir tabak ortasına yerleştirildi nerede söz konusu testin başka bir varyasyonu yapıldı. Bitişik çeyrek daireler ya ya da test yermadde kontrol. Önceki deneylerde olduğu gibi, solucanlar atılan önce sodyum azid hareketi ile hareketsizleştirildi. Benzer bir yöntem, C cevabı değerlendirmek için bir yol olarak burada açıklanan çeşitli bileşikler için elegans. Ancak, aşağıdaki yöntemi yalnızca hareketsiz solucanlardan mobil ayıran bir eşik mesafe geçti solucanlar değerlendirilmesi yararı vardır.

Diğer testler hareketsiz solucanlar görmezden için benzer yönergeleri dahil etmişlerdir. Frøkjær-Jensen ve diğerleri. Uçucu ve su hem de çözünebilir bileşikler 10 test etmek için kullanılabilecek bir analiz geliştirdik yönlü. Bir Petri kabı dört parçaya bölündü. Üst ve alt çeyrek solvent içermemektedir. Sol kadran su içerdiği ve doğru cezbedici içeriyordu. Suda çözünen bileşikler aga doğrudan yerleştirildi ise uçucu koku test ederken, analit, uygun kadran üzerinde, çanak kapağı yerleştirildir.

C. kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için şu anda var olan yöntemler elegans sürekli kullanımı, verimlilik ve doğruluk kolaylığı optimize etmek için rafine edilmektedir. Burada açıklanan tahlil solucanlar en fazla (. Maksimum verim: 250 solucanlar / plaka başına saat, Lee ve ark 3 gösterdiği verim biraz daha fazla) değerlendirmek yeteneğine sahipken Yani,, bu yöntemin gerçek gücü olan Daha önce testleri (Tablo 1) özelliklerini birçok kısa doruk noktası.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Worms hazırlanması / yıkama

  1. Genç erişkin 11 solucanlar senkronize.
  2. Bir 5 cm Kemotaksis plaka üzerine S Bazal Pipet 2 ml sadece OP50 E. çim temizlendiğini solucanlar düzenledi coli. Solucanlar tampona plaka yüzeyinden yıkanır sağlamak için gerektiği gibi plaka yatırın.
  3. Bir mikrosantrifüj tüp içine solucan-S Bazal çözüm pipet 1 ml.
  4. 10 sn 6.600 rpm bir picofuge kullanmak için santrifüj.
  5. Rahatsız solucanlar pelet bırakarak, S Bazal aspire.
  6. Solucanlar yıkamak için birkaç kez ters, mikrosantrifüj tüpüne 1 ml S Bazal çözüm ekleyin.
  7. Adımları 1,4-1,6 başka üç kez tekrarlayın.
  8. 10 saniye, beşinci kez, yaklaşık bir nihai hacme süpernatan aspire bu süre santrifüjleyin. 100 ul.
  9. Her 2 ul örnek 50 ila 250 solucanlar olmadığından emin olmak için bir NGM plaka üzerine solucanlar Pipet 2 ul. AyarlamakG Bazal daha küçük ya da daha büyük hacimde solucanlar yeniden süspansiyona tabi olarak, S Bazal solucanlar konsantrasyonu.
  10. Hemen 1 saat için solucan yıkandıktan sonra tahlilinde solucanlar kullanın.

2. Test Tabaklar hazırlanması

  1. 5 cm plakanın alt işaretleme, 4 eşit parçaya bölünür çanak bölmek. Kemotaksis NGM agar veya kullanılabilir. 3 çalışmaların en az test edilen genetik gerginlik başına gerekmektedir.
  2. Kökeni etrafında yarıçapı 0.5 cm (Şekil 1) bir daire işaretleyin.
  3. "Test" veya siteleri kökeni ve birbirinden eşit uzaklıkta olmasını sağlamak için bir "C" "Kontrol," için ya bir "T" ile her kadranda bir nokta işaretleyin. Noktaları en az 2 cm uzakta kökenli olmalıdır. Testi kadran ve sağ üst ve kontrol grubu olarak sol alt kadran (Şekil 1) olarak sol üst ve sağ alt kadran işaretleyin.

3. Testi Koşu

  1. Test bileşiği ve 0.5 M azit (bir anestezik bir kadran erişme üzerine solucanlar tutmak için kullanılan), eşit hacimlerde birleştirerek test çözeltisi karıştırın. 0.5 M azid ile, test bileşiğinin seyreltmek için kullanılan çözücü ile birleştirilmesi ile kontrol solüsyonu karıştırın.
  2. Kalkış üzerine pelet solucan çözeltisi (1.8 'de hazırlanan) (iki satır kesiştiği) Pipet 2 ul.
  3. Iki "T" siteleri üzerine test çözeltisinin hemen sonra, pipet 2 ul. Benzer şekilde, iki "C" siteleri üzerine kontrol solüsyonu ile aynı miktarda pipetle.
  4. Solucan ve odorant damla agar emilir edildikten sonra, kapakları yerine ve plakalar ters.
  5. 60 dakika sonra, 4 ° C inkübatör solucanlar yerleştirin. Bu sayılabilir yalnızca inkübatör bir tabak çıkarın. Oda sıcaklığında solucanlar bırakarak onları tekrar harekete izin verebilir.
  6. Tamamen iç Ortam geçti her kadranda solucan sayısını kaydedinle.
  7. Test ve kontrol kadran hem de kontrol çözeltisi kullanılarak adımları 3,2-3,6 tekrarlayın. Bu kontrol plaka olarak görev yapacak. Üç tür plakalar yapılmış ve uygun bir kontrol olarak hizmet çalıştırılmalıdır.

4. Skorlar Sözlü / Kemotaksis Endeks belirlenmesi

  1. Denklem 1 kullanarak kemotaksis indeksi hesaplayın. Bu -1.0 ve +1.0 arasında bir kemotaktik indeksi verecektir.

(1)

Kemotaksis İndeksi = (Test bölgeleri Her iki içerisinde Worms - Her iki kontrol bölgeleri içerisinde Worms) / (Attı Worms # Toplam)

Bir +1.0 puan hedefe doğru maksimum çekim gösterir ve kimyasal hedef içeren kadran gelen solucanlar% 100 temsil eder. -1.0 Bir dizin maksimum itme kanıtıdır. Benzer test yöntemleri zaten 3 (Tablo 1) istihdam edilmiştir.

  1. Ortalama Kemotaksi rapors Endeksi (CI) ve standart hata (SEM) anlamına gelir. Öğrenci T-testi test ve kontrol plakaları verileri karşılaştırarak yapın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yabani tip (N2) C Karşılaştırılması ODR-10 (KY10) mutant için elegans.

Biz, bilinen bir C diasetil el elegans kemoatraktan, diasetil 1,12 için reseptör olmayan bir mutantı olduğu için vahşi tip solucanlar karşılaştırma. Doğal tipte (N2) solucanlar için kemotaktik indeksi etanol ve 0,839-0,100 ± 0.066 idi ± 0,031-0,5% diasetil. Beklendiği gibi, diasetil yabani tip solucanlar (p <0.003) anlamlı bir chemoattractive tepkisi açığa ç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemotaksis, nöronal ve hücresel mekanizmalar karmaşık bir dizi tarafından kontrol edilen, ancak kolay ve objektif kemotaksi deneyleri kullanılarak belirlenebilir. Testleri en iyi sonuçları elde etmek için, bazı kritik adımlar alınmalıdır. İlk olarak, solucanlar evreleme tutarlı deneysel sonuçlar veren esastır. Farklı yaşam aşamalarında Worms farklı 13 davranırlar, bu yüzden karışık aşamada solucanlar olabilir çarpık deneysel sonuçlar. İkinci olarak, tüm E. sağlanması artık bakteri tetkiki ile etkileş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Yaşam Bilimleri ve bu iş için fon Kraliçe'nin Üniversitesi Sanat ve Bilim Fakültesi teşekkür ederim. Yanı sıra, biz gerekli çözeltiler, ekipman ve teknik destek sağlamak için Chin-Sang laboratuvar teşekkür ederim. Ayrıca tartışmaya katkılarından dolayı O, özellikle Tony, QGEM 2.011 teşekkür ederim.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
S Bazal (- kolestrol) [5.8 g NaCl; 1 M K fosfat tamponu, pH 6.0; dH2O 1 litre kadar.] Otoklav
PicoFugeStratagene400552
MikroskoplarLeica
DiseksiyonLeica
P1000 PipetGilson
P10 PipetGilson
0.5 M Sodyum Azit
Kemotaksis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) veya 2% Difco-agar. Otoklav. 5 mM potasyum fosfat, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 ekleyin.]
Etanol/Damıtılmış Su
Test Bileşikleri (örn. 0.5% diasetil)
AgarBio-Rad166-0600
NH4ClAmrescoCA97062-046
MOPSVWRCA12001-120
NH4OHBDHCABDH8641-2
0.25% Tween 20Bio-Rad170-6531

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
  2. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
  3. Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
  4. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
  5. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
  6. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
  7. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).
  8. Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
  9. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
  10. Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467(2008).
  11. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
  12. Sengupta, P., Bargmann, C. I. Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans. Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).
  13. Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (1895).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans ChemotaxisChemotaxis AssayWorm IsolationFour Quadrant SystemTest Control SitesWorm SynchronizationChemotaxis IndexOdorant ResponseNGM PlatesSodium Azide

Related Articles