Yöntem makalesi

Bej / Brite Hücreler Stromal Vasküler Hücre İzolasyonu ve Farklılaşma

38.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50191

⸱

28 Mart 2013

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

Bu makalede

Özet

Farelerde beyaz adipoz dokulardan izole İlköğretim beyaz preadipositlerden bej / brite hücrelerine ayırt edilebilir. Burada sunulan beyaz yağ "esmerleşme" moleküler düzenlenmesi okumak için güvenilir hücresel modeli sistemidir.

Özet

Kahverengi adipositler mitokondrilerde solunum zinciri ayırınız ve ısı gibi kimyasal enerjiyi için yeteneği var. Beyaz adipoz doku (yani bej veya brite hücreler olarak adlandırılır) UCP1 pozitif kahverengi adipositlerin Kalkınma yüksek kronik soğuğa maruz kalma ya da PPARy agonistleri tarafından çevresel işaretlerin çeşitli neden, bu nedenle, bu hücre tipi için bir terapötik hedef olarak potansiyele sahip obezite tedavisinde. Çoğu ölümsüzleştirdi adiposit hatları kültüründe beyaz yağ "esmerleşme" süreci özetleyen edemesek de, birincil adipositler brite / bej hücre gelişiminin moleküler kontrolü çalışmak için güvenilir hücresel sistem sağlamak subkütan beyaz adipoz dokuda stromal vasküler fraksiyon (WAT) izole . Burada primer preadipositlerden etkin izolasyonu ve kültür bej / brite hücrelerine farklılaşma inducing için bir protokol açıklar. Esmerleşme efekti kahverengi yağ seçici işareti ifade tarafından tespit edilebilirBöyle UCP1 gibi ers.

Giriş

Obezite ölçüde dünya çapında artan ve şu anda halk sağlığı 1 için en ciddi kaygılarından biri olarak kabul edilir. Bu durum bir harcama enerji alımı göreli misbalance ve beyaz yağ dokusu (WAT) lipid olarak depolanan fazla enerji sonuçları ile ilgilidir. Kahverengi adipoz dokuda ısı üretmek için fazla enerjiyi dağıtmak için yeteneğine sahipken Büyümüş WAT, artan vücut kütlesi ve ağırlığı ile ilişkilidir. Bu nedenle BAT soğuk ve obezite 2,3 hem de karşı koruma olarak işlev görebilir. Bu protein 1 (UCP1) ile ayrılmasının mitokondri içinde elektron nakil bölgesinin ayrılmasının elde edilir. Bu protein, BAT 3 termojenez nonshivering için ayırt edici bir özelliği olarak kabul edilir. Son yıllarda çeşitli çalışmalar erişkin insanlarda fonksiyonel BAT 4-8 var ve dolayısıyla insanlarda BAT manipülasyon obezite ve ilgili hastalıklara karşı savaşta potansiyel bir terapötik girişim olabileceğini ortaya koymuştur.

jove_content "> Mevcut kanıtlar kahverengi adiposit iki tip kemirgenlerde bulunduğunu gösterir," klasik "ya da" önceden mevcut olan "kahverengi yağ doğum öncesi aşama sırasında ortaya çıkar ve interskapular ve diğer periferik dokularda adanmış kahverengi yağ deposu oluşturan diğer taraftan. , kahverengi yağ (yani brite veya bej hücreler denir) bir "indüklenebilir" şeklinde doğum sonrası aşamasında gelişir ve beyaz adipoz dokularında serpiştirilmiş görünür. kahverengi adipositlerin iki tip de farklı gelişimsel kökenleri ile ayrılır. önceden mevcut iken kahverengi adipositler Myf5 öncüleri myoblastsic gibi ortaya çıkar, WAT olarak serpiştirilmiş indüklenebilir bej / brite hücre dışı bir Myf5 soy 9,10 ortaya çıkar. Buna ek olarak, bu tip hücre düzenleyici yollar Myf5 türevi kahverengi farklı olması muhtemeldir adipositler 11. bej hücreleri (beyaz yağ yani "esmerleşme") gelişimi kronik soğuk maruziyeti ve yanıt olarak aktive edilebilirβ3-adrenoseptör agonistler veya yetişkin 12-14 yılında PPARy agonistleri. Bej / brite hücreler genel enerji dengesi manipülasyonu için umut verici bir terapötik hedef olması muhtemel ve potansiyel obezite tedavisinin bir parçası haline gelebilir, bu nedenle, çevresel ipuçları bej gelişimini kontrol hangi hassas moleküler mekanizmaları ve sinyal yolları anlamak önemlidir hücreler.

Beyaz yağ esmerleşme moleküler kontrolünü anlamak için, in vitro deneylerde iyi preadipositlerden oldukça uyumsuz gerçekleşir farklılaşması olarak uygun ve yerinde 15 hücreleri tespit etmek zordur. Adiposit geliştirme çalışmaları, şimdiye kadar bu tür 3T3-L1, 3T3-F442A veya HIB1 gibi hücre soyları üzerine esas olarak gösterilmiş olsa da, bu hücre hatları bej hücre moleküler imza eksikliği görülmektedir. Diğer taraftan, derialtı WAT izole birincil adipositler süreç yeniden özetlemek için büyük olasılıklaBir hücre özerk moda beyaz yağ esmerleşme s. Burada yağ dokularından stromal-vasküler fraksiyonun etkili izolasyonu için ve PPARy agonistleri yanıt olarak beyaz yağ kahverengileşme indüklenmesi için bir protokol sağlar. Rosiglitazon, bu hücrelerde esmerleşmenin özellikle etkili bir aracı olduğu gösterilmiştir. 16. Daha önce de belirtildiği gibi, bu hücresel sistem bej / brite hücrelerinin gelişimini incelemek için güvenilir bir hücresel sistem hizmet etmek için de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Sindirim Orta hazırlayın

Doku başına 5 fare (yaklaşık 1 ml / 1 g yağ dokusu) başına 5 ml olun.

  1. Sindirim enzimleri tartılır:
    - Collaginase D: 1.5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
    - Dispase II: 2.4 u / ml (04942078001, 0,980 mg / lyo, Roche, 11466200)
  2. 25 ml PBS ekleyin ve çözünmesi için iyice karıştırın
  3. 10 mM nihai bir konsantrasyonda doku sindirim hemen önce CaCI2 eklemek

2. Fare dan Yağ Dokusu teşrih

  1. Diseksiyon çok dikkatli yapılmalıdır, ve hemen fareler sonra (6-8 haftalık) kurban edilir. Açmadan önce fare kürk üzerine püskürtülür etanol ile steril çalışın. Temiz PBS, ayrı interskapular BAT ve subkutan kasık WAT doğrudan doku yerleştirin.
  2. Interskapular BAT için: kadar karşı karşıya arka yerleştirilen fare sırt ve boyun için tüm yol boyunca açık kesti. Kahverengiadipoz doku doğru omuzlar (interskapular) arasındaki deri altında bulunabilir. BAT iki lobu, şeklindeki kelebek olarak görülebilir. BAT kapsayan beyaz yağ ince bir tabaka dikkatlice çıkarılması gerekmektedir.
  3. Subkutan WAT (inguinal WAT) için: cilt kaldırmak. Kasık WAT içinde testis karşı uyluk ve aşağı, hemen hemen arkasında ve yanında başlangıç ​​olacak, her iki tarafta da deri altına direkt olarak bulunur.

3. Yağ Dokusu Kes ve Digest

  1. Çabuk saç, iskelet kası ve doku kesitlerinde gelen bağ dokusu gibi, tüm kontaminasyonu temizlemek.
  2. PBS ile diseksiyon orta sulandırmak ve kuru bir tabağa yerleştirin değil kağıt üzerinde hızla doku kurulayın.
  3. Sindirim orta (ön sindirime CaCI2 eklenir) ve küçük parçalar halinde doku kıyma ekleyin. 5 ml'lik pipet ve aşağı yukarı pipetleme tarafından çok iyi karıştırın. Sindirim m geri kalanı ile 50 ml tüp içinde kıyılmış doku aktarınedium, aşağı yukarı pipetleme ve daha da karıştırın.
  4. Digest 37 ° C 40-50 dakika için 150 rpm'de sabit ajitasyon. Sindirim iyi gidiyor ve aşırı-sindirim önlemek için emin olmak için her 10-15 dakika kontrol edin.

Not: Doğru sindirim, orta ve zaman önemlidir. Doku de sindirilmesi gerekir, ama aşırı sindirim hücrelerine zarar verebilir.

4. Filtre Hücre Süspansiyon

  1. 5 ml tam orta (DMEM/F12 içeren% 10 FPS ve P / S) ekleyerek sindirim durdurun. Hücreler hemen hemen tamamen homojen olması gerekir. Pipetleme ile iyice karıştırın.
  2. 10 dakika boyunca 700 xg'de santrifüjleyin.
  3. SVF şu anda, tüpün altına bir kahverengimsi bir pelet olarak görülebilir. Üst ve sıvı tabaka çoğu üzerinde yağlı olgun adiposit tabaka aspire - pelet tutmak ve 10 ml tam bir ortam içinde çözülür. İyice karıştırın.
  4. Yeni bir 50 üzerinde bir hücre süzgeç (50-70 mikron çaplı) yerleştirin ml tüp ve hücre süspansiyonu filtre.

5. Plaka Hücreler

  1. 10 dakika boyunca 700 xg'de 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın.
  2. 10 ml tam bir ortam içinde ortam aspire ve yeniden askıya pelet. Pipet ve iyi karıştırın.
  3. Ihtiyaç kaç tabak tahmin. Bu değişiklik ve topak boyutuna bağlı olarak değişebilir. Genel bir kural inguinal WAT için 5 fareler ve BAT için bir 10 cm plaka 10 cm tabak 2'dir.
  4. Tam orta kollajen kaplı yemekleri Tabak hücreleri (Ar-Ge)
  5. 1-2 saat hücreleri, aspirat orta kaplama sonra, iki kez PBS ile yıkayın ve taze orta ekleyin. Bu kırmızı kan hücreleri, bağışıklık hücreleri ve diğer kirleticiler kaldırmak bu adım önemlidir.

6. Hücreler farklılaştırın

  1. Bakım ve indüksiyon ortamlar olun.

Bakım orta

Eklenen orta tamamlayın:

ent "> İnsülin, nihai kons. 5 ug / ml (5 mg / ml stok, pH 2.5 asitlendirilmiş su hazırlamak için 10 ml H2O içindeki asetik asit *** 100 ul. asitlendirilmiş su içinde insülin çözülür. deposu stok itibariyle -20 ° C)

3,3 ',5 triiodo-L-thyronine (T3), son kons. 1 nM (10 uM stok, *** 1N NaOH T3 çözülür ve 10 uM stok yapmak için orta ekleyin. Sigma kedi # T-2877)

4 ° C arasında, bir hafta için iyi

İndüksiyon orta

Aşağıdaki bileşikler ihtiva eden bakım ortamı:

İndometazin, son kons. 125 uM (etanol 0.125 M stok, Sigma kedi # I-7378). Indometasin 60 ısıtılması gerekir ° C'de eritildi gerekir.

Deksametazon, son kons. 2 ug / ml (etanol içinde 2 mg / ml çorap, Sigma cat # D-1756)
3-izobütil-1-metilksantin (IBMX), nihai kons. 0.5 mM (DMSO 0.25 M stok, Sigma kedi # I-5879)
Rosiglitazon, son kons. 0.5 uM(DMSO içinde 10 mM stok, Sigma kedi # R-2408)

Not: Her zaman orta taze indüksiyon olun.

  1. Tam orta 95-97% izdiham (konfluent ama çok dolu değil) birincil adipositler büyümek
  2. Indüksiyon orta (gün 0) düzenli komple orta değiştirme
  3. 48 saat (2 gün) sonra, rosiglitazon (0.5 uM) ile bakım ve orta orta değiştirin
  4. Ek 48 saat (günde 4) sonra ek 2-3 gün rosiglitazon ile taze bakım ortamı (1 uM) değiştirebilirsiniz. 6-7 gün indüksiyon orta ekledikten sonra, hücreler tamamen yağ hücrelerinin olgunlaşması için farklılaştığı ve yağ damlacıkları ile dolu. Damlacıklar indüksiyon 3-4 gün sonra etrafında görünecektir.

Not: Değişim orta hücreleri tamamen farklılaşmış olan 2-3 gün kadar.

Hücreler artık hasat ve Ucp1 ve Othe mRNA edilebilirr kahverengi adiposit-özgü genler qRT-PCR yöntemi ile ölçülebilir. Western blot proteinleri tespit etmek için kullanılacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Birincil adipositlerin Browning mRNA Ucp1 ifade ve qRT-PCR ile diğer kahverengi yağ-spesifik veya seçici genler ölçerek erişilebilir. Şekil 1'de Sunan inguinal WAT-kökenli birincil adipositlerde gen ekspresyonu veridir. Hücreler, sırasıyla 50 nM ve 500 nM de rosiglitazon iki farklı dozda varlığında ayırt etmek için oluşturuldu. Hücrelerinin bir alt kümesi, hasattan önce 4 saat boyunca 10 uM forskolin ile de muamele edilmiştir. Bu hücrelerde siklik-AMP (cAMP) teşvik ve Ucp1 ekspresy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada farelerde primer kültürlerinde adipositlerde bej / brite hücrelerinin gelişimini incelemek için güvenilir bir hücresel sistem sunuyoruz. Gibi çeşitli mevcut ölümsüzleştirilmiş hücre soyları ile karşılaştırıldığında, bu sistem, in vivo beyaz yağ kahverengileşme ile geliştirilmiş İlgiye sunmak için olasıdır.

Bu birincil adipositlerin çalışmanın bazı avantajlar sunuyor olsa da, orada da düşünülmesi gereken önemli bazı sınırlamalar ve endişeleri var. İlk olarak, bu sistem, hücre ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Biz tartışma, teknik yardım ve el yazması üzerinde editoryal yardım için Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda ve Lauren Ruiz ederim. Bu çalışma Atılım Biyomedikal Araştırma ve Asubio Ecz Inc için Programı SKULA için NIH (DK087853), hibe Kopenhag ve AB 7.ÇP Proje Diabat (SAĞLIK-F2 Üniversitesi'nden HİSSE doktora bursları ile desteklenmiştir tarafından desteklenmiştir Lise Madsen ve Karsten Kristiansen için -2.011-278373). Biz de DERC merkezi hibe (NIH P30 DK063720) kabul etmektesiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif
Collaginase D Roche 11088874103
Dispase II Roche 04942078001
CaCl2
DMEM ortamı Balıkçı 10017-CV Sodyum piruvat olmadan 2,5 g / l glukoz ve L-glutamin ile
Ensülin
T3 (3,3 ',5-triiodo-L-thyronine) Sigma T-2877
İndometazin Sigma I-7378
Deksametazon Sigma D-1756
IBMX Sigma I-5879
Rosiglitazon Sigma R-2408
Ekipman
Kollajen kaplı yemekleri BD 354450 10 cm tabaklar
70 um bir filtreden BD Falcon 352350 Hücre süzgeç, 70 mikron naylon 1/ea

Kaynaklar

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stromal Vask ler FraksiyonAdiposit zolasyonuDoku SindirimiH cre EkimiDiferansiyasyon nd ksiyonuUCP1 EkspresyonuQ RT PCR AnaliziWestern BlotRO Glitazon Uygulamas

İlgili makaleler