Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm

10.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50201

⸱

19 Şubat 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, 2The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

Bu makalede

Özet

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Özet

Elektrojenik membran taşıyıcı Na+,K+-ATPaz ile katyon taşınması elektrofizyoloji ile ölçülebilirken, elektronötral olarak çalışan gastrik H+,K+-ATPaz'ın araştırılması daha zordur. Birçok taşıma tahlili, yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için radyoizotopları kullanır, ancak gerekli güvenlik önlemleri, insan maruziyeti veya tahlil tasarımı ile ilgili ciddi kısıtlamalar getirir. Ayrıca, hücre zarları boyunca iyon taşınması, hücre kültüründe veya proteolipozom preparatlarında doğrudan kontrol edilmeyen zar potansiyelinden kritik bir şekilde etkilenir. Burada, tek hücrelerde Na+,K+- veya gastrik H+,K+-ATPaz ile Rb+ veya Li+ taşınmasını ölçmek için atomik absorpsiyon spektrofotometrisinin (AAS) eser miktarda kimyasal elemente karşı olağanüstü hassasiyetinden yararlanıyoruz. Ekspresyon sistemi olarak Xenopus oositlerini kullanarak, bir otomatik örnekleyiciden yüklenen enine ısıtılmış bir grafit atomizer (THGA) fırını ile donatılmış bir AAS cihazında tek oosit homojenat örneklerini ölçerek hücrelere taşınan Rb+ (Li+) miktarını belirleriz. Kontrol oositlerine veya ATPaz'a özgü inhibitörlerin uygulanması sırasında spesifik olmayan Rb + alımının arka planı çok küçük olduğundan, aynı anda çok sayıda deneysel koşulu içeren karmaşık kinetik tahlil şemalarını uygulamak veya bölgeye özgü mutasyona uğramış taşıyıcıların taşıma kapasitesini ve kinetiğini yüksek hassasiyetle karşılaştırmak mümkündür. Ayrıca, katyon alımı tek hücrelerde belirlendiğinden, akı deneyleri, membran potansiyelinin ve akımının doğru kontrolünü sağlamak için iki elektrotlu voltaj kenetleme (TEVC) ile birlikte gerçekleştirilebilir. Bu, örneğin Na+,K+-ATPaz'ın 3Na+/2K+ taşıma stokiyometrisinin kantitatif olarak belirlenmesine izin verdi ve ilk kez elektronötral olarak çalışan gastrik H+,K+-ATPaz tarafından katyon taşınmasının voltaj bağımlılığının araştırılmasını sağladı. Prensip olarak, tahlil, K + taşıyan membran proteinleri ile sınırlı değildir, ancak ağır veya geçiş metali taşıyıcılarının aktivitesini veya endositotik süreçlerle kimyasal elementlerin alımını ele almak için eşit derecede iyi çalışabilir.

Giriş

İzotop laboratuvarlarına erişim, güvenlik gereksinimleri veya - lityum örneğinde olduğu gibi - son derece kısa bozunma süreleri nedeniyle bile kullanılamayabilecek pahalı radyoizotopların kullanımı ile ilgili kısıtlamaları aşmak için iyon yer değiştiren zar proteinlerinin spesifik taşıma aktivitesini araştırmak için radyoaktif izleyici deneylerine hassas, güvenli ve ucuz bir alternatif geliştirmek istedik. Elektronötr olarak çalışan gastrik H +, K + -ATPaz'ın aktivitesini belirlemekle özellikle ilgilendik, çünkü enzim akım üretmez ve bu nedenle aktivitesi elektrofizyolojik yöntemlerle ele alınamaz. Na+, K + - ve H +, K + - ATPaz, Rb + 'yı K + (ve aynı zamanda Li + ) kadar verimli taşıdığından, AAS tekniğinin rubidyum veya lityum için yüksek hassasiyeti, taşıma aktivitesinin hassas tespitini kolaylaştırmalıdır. Atomik absorpsiyon spektrofotometreleri, kimya laboratuvarlarında yaygın olarak dağıtılan ve çok sayıda ilgili bilim insanı tarafından erişilebilir olması gereken yaygın analitik cihazlardır. Ayrıca, tek bir parti içinde protein ekspresyon seviyesi ile ilgili olarak oldukça düşük bir hücreden hücreye değişkenlik elde etmeye izin veren büyük tek hücreleri (yaklaşık 1.0-1.5 mm çapında) kullanan Xenopus oosit ekspresyon sisteminden yararlanmak istedik. Basit bir hesaplama, AAS testinin fizibilitesini gösterir: THGA-AAS tekniği ile rubidyum için tespit limiti (karakteristik kütle) 10 pg veya 1.2·10-13 mol'dür (Rb: 85.47 g/mol), lityum için 5.5 pg veya 7.9·10-13 mol (Li: 6.94 g/mol). Xenopus oositlerinde Na+,K+-ATPaz'ın heterolog ekspresyonu üzerine, 100 nA'lık pompa akımları elde edilebilir (bu, saniyede yaklaşık 6.2·1011 temel yüke veya 1.03·10-12 mol s-1'e eşittir), böylece 1 dakika içinde 6·10-6 C'lik bir yük taşınmasına neden olur. Bir net yükün taşınması, iki Rb+ iyonunun alımına karşılık geldiğinden (3Na+/2K+ stokiyometrisi nedeniyle), 1 dakika boyunca 100 nA akım, 1.2·10-10 mol Rb+'lık bir alıma karşılık gelir. Bu nedenle, 1.000 kat seyreltme (1 ml su içinde yaklaşık 1 μl hacimli bir oositin homojenizasyonu) durumunda bile, tipik bir THGA-AAS numunesi (20 μl) 2.4·10-12 mol Rb + (veya 204 pg) içerir, bu da tespit eşiğinin çok üzerindedir. Bu nedenle, 100 kattan daha düşük taşıma aktivitesine veya plazma zarı ekspresyonuna sahip taşıyıcılar bile, deneyin akı süresini uygun şekilde ayarlayarak teknikle test edilebilir.

Pompalama hızı hassas bir şekilde sıcaklığa bağlı olduğundan (Na+,K+-ATPaz için tipik aktivasyon enerjileri 90 kJ/mol ila 130 kJ/mol1-3 aralığındadır, bu da 20 °C'den 22 °C'ye bir değişiklik üzerine devir hızında yaklaşık %30'luk bir artışa neden olur), akı ölçümlerinin hassas sıcaklık kontrolü (klima) altında iyi dengelenmiş tampon çözeltileri ile yapılması zorunludur. Ayrıca, bir iyon taşıyıcının ifadesi için oositler homojen büyüklüklere göre dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Bu önlemlerle, deney koşulu başına yaklaşık 10 hücre ile rutin olarak yüzde 10'dan daha az deneysel standart hatalar elde etmek mümkündür. Bu tekniği kullanarak, örneğin katyon transportu4-6'nın görünür Rb+ afinitelerini, hücre dışı ve hücre içi pH7'nin etkisini ve transport4,8 sırasında katyon koordinasyonunda yer alan kalıntıların mutasyonlarının etkisini belirleyebildik. Tekniğin bir avantajı, iyon akılarının, oositlerin iki elektrotlu voltaj kenetlenmesi ile kombinasyon halinde de belirlenebilmesidir, bu da bir yandan taşıma sırasında membran potansiyelinin doğru bir şekilde kontrol edilmesini sağlarken, diğer yandan iyon akısının membran akımı ile ilişkilendirilmesine izin verir. Böylece, Na+,K+-ATPaz'ın 3Na+/2K+ stokiyometrisini doğrulamak (aşağıdaki örnek sonuçlara bakınız) ve gastrik H+/K+-ATPaz7'nin katyon taşınmasının voltaj bağımlılığını belirlemek mümkün olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Xenopus Oositlerinde cDNA Konstrüktleri ve Protein Ekspresyonu

İlgilenilen membran proteininin cDNA'sı, pTLN9 veya pcDNA3.1X10 gibi Xenopus laevis oositlerinde ekspresyona uygun bir vektöre klonlanmalıdır. Bu tür optimize edilmiş vektörler, çoklu klonlama bölgesini (MCS) çevreleyen Xenopus laevis β-globin geninin 5'- ve 3'-çevirilmeyen bölgelerini (UTR), 5' UTR'den önce yer alan bir RNA polimeraz promotör dizisini (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7), hücrelerde cRNA stabilitesini sağlamak için MCS'nin 3' yönünde bir poli-A kuyruğunu ve daha aşağıda, plazmidin in vitro cRNA transkripsiyonu için kalıp görevi görmesini sağlamak amacıyla lineerleştirilmesi için tek kesimli restriksiyon endonükleaz bölgelerinden oluşan başka bir diziyi içerir.

Aşırı ifade edilen insan Na+/K+-ATPase (α2-alt birim+β1-alt birim) aktivitesini oositlerin endojen Na+/K+-ATPase aktivitesinden ayırt etmek için, milimolar aralıkta bir IC50 değerine sahip ouabain-dirençli bir protein elde etmek amacıyla Q116R ve N127D mutasyonları yapılmıştır11. H+/K+-ATPase durumunda, Rb+ akışları voltaj-clamp florometrisi (VCF) deneylerinden elde edilen kinetik verilerle korele olduğundan, akış ölçümleri H+/K+-ATPase α-alt birim mutant S806C kullanılarak gerçekleştirilmiştir. VCF tekniği (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)12, enzimin konformasyonel değişikliklerini bildiren, stratejik olarak yerleştirilmiş bir sistein kalıntısına floresan bir işaretleyicinin bölgeye özgü olarak bağlanmasına dayanmaktadır.

2. DNA Şablonunun Doğrusallaştırılması ve Saflaştırılması

  1. DNA şablonunun lineerizasyonu için, 50 μl reaksiyon hacmindeki 3 μg plazmid DNA'yı, restriksiyon enzimine uygun 5 μl 10x konsantre tampon ve 10 U restriksiyon enzimi ile 37 °C'de 1 saat boyunca sindirin.
  2. Lineerize edilmiş DNA'yı High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science) kullanarak saflaştırın. İlk olarak, sindirim tüpüne 350 μl bağlama tamponu (guanidiniumisothiocyanate içeren) ekleyin. Bu saflaştırma adımından sonra, lineerize DNA şablonu 'RNA grade' (RNA düzeyinde) olur; çünkü guanidiniumisothiocyanate etkili bir protein denatüranıdır ve özellikle moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın bir kontaminan olan RNAz'ı yok eder.
  3. Spin kolonları toplama tüplerine yerleştirin, kolona 2. adımdaki DNA çözeltisini yükleyin, 13,000 x g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
  4. Kolona 500 μl yıkama tamponu ekleyin. 13,000 x g'de 1 dakika santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
  5. Kolona 200 μl yıkama tamponu ekleyin. Kolonu tamamen kurutmak için 13,000 x g'de 1 dakika santrifüjleyin.
  6. Spin kolonunu temiz bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne yerleştirin ve kolona 50 μl nükleaz içermeyen su (Ambion Ürün # AM9937) ekleyin. Maksimum hızda 1 dakika santrifüjleyerek elüsyon yapın.
  7. Elüsyondan sonra, DNA içeren çözeltiyi yaklaşık 15 μl'ye kadar konsantre edin. Bu adım, çözeltinin 3 μl içinde 0.5 μg lineerize DNA içermesini sağlar ki bu, takip eden in vitro cRNA transkripsiyon reaksiyonu için önerilen konsantrasyondur.

3. In Vitro cRNA Sentezi

  1. Plazmid üzerindeki promotör dizisine (SP6, T7) göre uygun mMessage mMachine Kit'i (Ambion Ürün #1340, #1344) seçin. Toplam 10 μl reaksiyon hacmine; önceden porsiyonlanmış 5 μl NTP-cap mix örneğine, önceki adımdan elde edilen 3 μl lineerleştirilmiş DNA ve 1 μl transkripsiyon tamponu ekleyin. NTP-cap mix'in önceden porsiyonlanması, nükleozid trifosfatların bozunmasına yol açabilecek sık donma-çözünme döngülerinden kaçınmak için gereklidir. Son olarak, 1 μl uygun RNA polimeraz ekleyin, kısa süre karıştırın ve reaksiyon karışımını santrifüjle çöktürün.
  2. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 1 ila 2 saat inkübe edin. İnkübasyon süresi 2 saati geçmemelidir, çünkü bu durum cRNA veriminin veya kalitesinin düşmesine neden olabilir.
  3. Kit içerisinden 15 μl buz gibi soğuk 3 M LiCl çözeltisi ve 15 μl soğuk nükleazsız su ekleyin, kısa süre karıştırın (vorteks yapmayın), örneği 11,000 x g'de 10 saniye boyunca kısa süreli santrifüjleyin ve cRNA'nın çökelmesini sağlamak için en az 30 dakika -20 °C'de saklayın.
  4. Çöktürme sonrası santrifüj cihazını 4 °C'ye ön soğutma yapın ve en az 15 dakika 13,000 x g'de santrifüjleyin.
  5. Tüpün dibindeki açık kahverengi pelet üzerindeki süpernatantı dikkatlice ve tamamen uzaklaştırın ve -20 °C'ye soğutulmuş 150 μl %70 RNA dereceli etanol ekleyin. 4 °C'de 5 dakika 13,000 x g'de santrifüjleyin.
  6. Süpernatantı tamamen uzaklaştırın, kalan cRNA peletini oda sıcaklığında bir santrifüj evaporatöründe (örneğin Eppendorf Concentrator model 5301) kısa süre (1-2 dk) kurutun.
  7. Peleti 12 μl soğuk nükleazsız suda çözün. UYARI: Sonraki tüm adımlar, cRNA örneği buz üzerinde tutularak gerçekleştirilmelidir.
  8. Bir spektrofotometre (örneğin Eppendorf BioPhotometer) kullanarak cRNA konsantrasyonunu belirleyin.
  9. cRNA bütünlüğünü agroz jel elektroforezi ile kontrol edin. UYARI: Kısmen bozunmuş RNA bile sıfır olmayan UV absorbansı verdiği için bu çapraz kontrol gereklidir. cRNA elektroforezi için, TAE tamponu ile yeni doldurulmuş, tamamen temizlenmiş bir elektroforez haznesi ve taze hazırlanmış %1'lik agaroz jel kullanın. Elektroforez haznesinde veya tamponda RNAz kontaminasyonundan şüpheleniliyorsa, hazneyi temizlik için 1 saat boyunca 0.1 M HCl ile doldurun ve TAE tamponunu nükleazsız su ile hazırlayın.
  10. cRNA'yı kullanıma kadar -20 °C'de saklayın. cRNA, -20 °C'de en az bir yıl saklanabilir.

4. Parsiyel Ovaryektomi ile Xenopus laevis Dişilerinden Yumurtalık Materyali Elde Edilmesi

Bu protokol, sorumlu eyalet makamı (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, Berlin Senatosu, Almanya) tarafından onaylanmıştır.

  1. Kusmayı önlemek için cerrahi işlemden en az 12 saat önce kurbağayı beslemeyin.
  2. 2 g lokal anestezik trikainin (MS-222), 5 mM HEPES tamponu ile pH 7.0'ye ayarlanmış 1 L suda çözüldüğü bir çözelti hazırlayın. DİKKAT: MS-222 ile çalışırken her zaman nitril eldiven giyin ve çözeltiyi kimyasal güvenlik kabininde hazırlayın.
  3. Hayvan artık düzeltme refleksleri göstermeyene kadar kurbağayı trikain çözeltisine daldırın (maks. 10 dk). Tepkisizliği kontrol etmek için kurbağayı ellerinizle sırt üstü çevirmeye çalışın ve savunma hareketlerini gözlemleyin.
  4. Kurbağayı trikain çözeltisinden elinizle çıkarın ve anestezik maddeyi temizlemek için hayvanı soğuk musluk suyuyla durulayın.
  5. Kurbağanın cildinin buzla doğrudan temas ederek zarar görmesini önlemek için, kurbağayı sırtı üstte kalacak şekilde ıslak bir kağıt havluyla kaplanmış buz yatağına yerleştirin. Kurumanın önüne geçmek için operasyon boyunca hayvanın cildini her zaman ıslak tutun. Buza yerleştirme, anestezi süresini uzatır.
  6. Kurbağanın orta hattının sol veya sağ tarafında keskin makasla küçük bir abdominal insizyon (8-10 mm uzunluğunda) yapın. DİKKAT: Yanal hatta zarar vermemeye dikkat edin. Altındaki yumurtalık dokusunun iyi iyileşmesini sağlamak için sonraki cerrahi işlemler dönüşümlü taraflardan yapılmalıdır. Genellikle üç doku tabakasının (dış deri, ince bir beyaz bağ dokusu tabakası - fasya - ve bir kas tabakası) geçilmesi gerekir.
  7. Karın açıldıktan sonra, yumurtalık loblarının kısımlarını küt pensle tutun ve nazikçe dışarı çekin. Kılavuz olarak, insizyon yoluyla yumurtalıktan yaklaşık 3-5 cm yumurtalık materyali çıkarın. Küçük kan damarlarının zarar görmesi ve kanama durumunda, steril plastik bir çubukla baskı uygulayın veya kanama durana kadar yarayı buzla soğutun.
  8. İnsizyonu 4.0 Ethicon Vicryl sütür (Johnson & Johnson #V633H) kullanarak kesintili dikiş modeliyle cerrahi olarak kapatın. Dikiş için cerrahi aletler kullanın ve insizyon boyunca iki veya üç düğümü ayrı ayrı atın. DİKKAT: Her düğümün üç doku tabakasını tek adımda dikmesi önemlidir.
  9. Operasyondan sonra kurbağayı, nefes alabilmesi için burun delikleri su seviyesinin üzerinde kalacak şekilde, sadece tabanını örtecek kadar su içeren hafif eğimli bir su leğenine (30 L) yerleştirin. Hassas cildin kurumasını önlemek için uyanma süresince (yaklaşık 1-2 sa) hayvanı ıslak bir kağıt havluyla örtün.
  10. Hayvan tekrar aktif olduğunda su leğenini doldurun ve iyileşmeyi ve yara kapanmasını izlemek için kurbağayı 3-4 gün boyunca diğer hayvanlardan ayrı tutun.
  11. Ameliyattan sonra, hayvanın ve yumurtalık dokusunun tamamen iyileşmesi için kurbağayı en az 3 ay boyunca sonraki operasyonlardan muaf tutun. Kılavuz olarak, her kurbağa üzerinde maksimum 6-8 cerrahi işlem gerçekleştirilebilir.

5. Münferit Oositlerin Enzimatik İzolasyonu

  1. Over materyalini makasla daha küçük parçalara ayırın ve dokuyu şuraya aktarın ... içermeyen Oosit Ringer Solüsyonu Kalsiyum2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.4) kollajenaz (20 mg/ml, şuradan tip 1A) içeren Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) ve tripsin inhibitörü (10 mg/ml, tavuk yumurta akından elde edilmiş Tip III-O, Sigma #T2011).
  2. Sindir görev çözeltisini 2,5 saat boyunca hafifçe çalkalayın 18 °CArdından, oositlerin çoğu foliküler dokudan ayrılana kadar sindirim sürecini 15 dakikalık aralıklarla takip edin.
  3. Oositleri, 50 ml'lik bir Falcon tüpü içerisinde şu madde ile birkaç kez yıkayın: Ca içermeyen Oosit Ringer Solüsyonu2+ çözelti doku kalıntılarından yeterince arınana kadar.
  4. Oositleri şunlarda saklayın: Ca içeren Oosit Ringer Solüsyonu2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2)2, 2 mM CaCl22, 5 mM HEPES, pH 7,4) gentamisin içeren (50 μg/ml) at 18 °C.

6. cRNA Enjeksiyonu

  1. Na+,K+- veya H+,K+-ATPase ekspresyonu için, 3,5" hematokrit tüpleri (Drummond #3 000-203-G/X) kullanılarak, elektriksel tahrikli bir Nanoject II injeksiyon pompası (Drummond Scientific Inc.) ile oositlere 25 ng α-alt birim ve 5 ng β-alt birim cRNA içeren 50 nl cRNA solüsyonu enjekte edin. UYARI: mRNA miktarı hedef proteine göre değişiklik gösterebilir ve maksimum ekspresyon için Western blotting ile ayarlanması gerekebilir.
  2. Her akış koşulu için (örneğin belirli bir Rb+ konsantrasyonunda), 18-22 oosite enjeksiyon yapın. Bunların %50'si "+akış" koşulları altında (örneğin belirli bir Rb+ konsantrasyonu), %50'si ise "-akış" koşulları altında (örneğin seçilen Rb+ konsantrasyonu ve enzimin doyurucu konsantrasyonda spesifik bir inhibitörü ile; Na+,K+-ATPase için 10 mM ouabain veya H+,K+-ATPase için pH 5,5'te 10 μM SCH28080 gibi) analiz edilecektir.
  3. Enjeksiyondan sonra, oositleri 18 °C'de, Ca2+ ve 50 μg/ml gentamisin içeren Oosit Ringer Solüsyonu ile yarıya kadar doldurulmuş 96 kuyucuklu plakalara ayrı ayrı aktarın.
  4. Aşırı buharlaşmayı önlemek için 96 kuyucuklu plakayı Parafilm ile kapatın.
  5. Oositleri 18 °C'de 2-7 gün boyunca (ilgilenilen proteine bağlı olarak) inkübe edin. Oositlerin 3 günden fazla saklanması gerekiyorsa, mikrokuyucuklardaki inkübasyon tamponunun her 3 günde bir değiştirilmesi önerilir.
  6. Her bir akış veri seti için (örneğin bir [Rb+] titrasyon deneyi), yaklaşık 10 adet enjeksiyon yapılmamış (veya 50 nl nükleaz içermeyen su enjekte edilmiş) kontrol oositi "+akış" ve "-akış" koşulları altında analiz edilmelidir. Bu nedenle, akış analizinden önce yeterli sayıda kontrol hücresini, cRNA enjekte edilmiş oositlerle aynı şekilde inkübe edin.

Heterolog ATPase ekspresyonlu oositlerin ön işlemi

Na+ yükleme prosedürü

Na+/K+-ATPase'nin fonksiyonel ölçümleri için hücre içi Na+ konsantrasyonunu şu şekilde artırmak önemlidir13:

  1. Oositleri, buz üzerinde 45 dakika boyunca Na+ Yükleme Tamponuna (110 mM NaCl, 2.5 mM Na-sitrat, 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) aktarın.
  2. Sonraki geri kazanım işlemi için, oositleri buz üzerinde en az 30 dakika boyunca Yükleme Sonrası Tamponu "PLB" (100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2 ve 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) içinde inkübe edin.
  3. Oositleri kullanıma kadar buz üzerinde PLB içinde saklayın.

7. Endojen Na+,K+-ATPase'nin Ön Blokajı

DİKKAT: Xenopus oositleri endojen bir Na+,K+-ATPase eksprese ettiğinden, Rb+ akı deneylerinden önce bu endojen pompanın şu şekilde bloke edilmesi önemlidir:

  1. Şimdi, oositleri 100 μM ouabain içeren Yükleme Sonrası Tamponu içinde oda sıcaklığında 15 dk inkübe ederek endojen Na+,K+-ATPase'yi bloke edin.

8. Elektrofizyoloji

  1. İki aşamalı bir mikropipet çekici (Model PC-10, Narishige) kullanarak borosilikat kapillerleri (GB150F-8P, Science Products GmbH) çekerek mikroelektrotları hazırlayın.
  2. Cam elektrotları arkadan 3 M KCl ile doldurun. H ile yapılan TEVC deneyleri için+,K+-ATPase için bunun yerine 3M NaCl kullanmanızı öneririz; bu, daha stabil akım kayıtları sağlamıştır. Pipeti, iki elektrotlu voltaj klempi düzeneğinin mikroelektrot tutucularındaki Ag/AgCl telinin üzerine yerleştirin.
  3. Cam mikroelektrotları ve Ag/AgCl referans elektrotlarını banyo solüsyonuna bağlayan iki agar köprüsünü (bunlar yaygın olarak kullanılan KCl/agar yerine NaCl/agar ile hazırlanmalıdır), ölçüm tamponu ile önceden doldurulmuş kayıt odasına (Warner Instr., model RC-10) yerleştirin.ör. ile PLB 10 μM Na için ouabain+,K+-ATPase).
  4. Voltaj klempli amplifikatörü (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Almanya) "KAPALI" (OFF) moduna getirin.
  5. Her bir cam elektrodun direncini ayrı ayrı kontrol edin (her ikisi de 0,5-2 MΩ aralığında olmalıdır).
  6. Uygun TEVC amplifikatörü ekranında voltaj ve akım elektrotlarının ofset potansiyellerini kontrol edin. Sıfırdan sapma olması durumunda, amplifikatörün ilgili ofset regülatörleri ile ofseti ayarlayın.
  7. Bir oositi odacığın ortasına yerleştirin ve akım ile voltaj elektroduyla membranı nazikçe penetre edin.
  8. Amplifikatörün potansiyel okumasını kontrol edin. Voltaj elektrodunun potansiyel okuması artık hücrenin dinlenme potansiyeli değerini vermektedir.
  9. Amplifikatörü VC (voltaj-clamp) moduna getirin.
  10. pCLAMP yazılımını (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) kullanarak, hücreyi önceden tanımlanmış bir membran potansiyeline sabitleyin. Bu değer, daha önce ölçülen dinlenim potansiyeli değeri (sıfır membran akımı koşulları altında kayıt yapmak için) veya istenen herhangi bir test potansiyeli değeri olabilir. Sızıntı akımının genliğine ve stabilitesine dikkat edin (K yokluğunda+/Rb+/Li+), genel bir kılavuz olarak -30 mV'da -200 nA'yı aşmamalıdır.
  11. Oositi belirli bir süre boyunca perfüze edin (örn. Na için 3 dk+,K+-ATPase) ile Rb+-içeren çözelti (maksimal akıma ulaşmak için, klempleme yapılmayan koşullar altındaki akı ölçümlerinden elde edilen doyurucu konsantrasyonları kullanın) ve pCLAMP yazılımı ile sürekli kayıt modunda pompa akımını kaydedin. Rb'nin olduğundan emin olun+ Ardından, hücrenin Rb ile perfüze edilmesiyle alım tamamen durdurulur.+30 saniye boyunca çözeltiden arındırın.
    1. İki elektrotlu voltaj klempi deneyini durdurun, oositi kayıt haznesinden çıkarın ve "Rb" paragrafındaki 4. yıkama adımına geçin.+ Rb analiz etmek için "tutulum deneyleri"+ Atomik Absorpsiyon Spektrofotometrisi ile alım.
  12. pCLAMP paketinin Clampfit programını kullanarak offset akımı çıkarma işlemini gerçekleştirin ve pompa akımının zaman integralini değerlendirin.

9. Rb+ Alım Ölçümleri

  1. 200 μl'lik bir pipetteki sarı pipet ucunu keserek yaklaşık 2 mm çapında olacak şekilde eritin. Bu tür uçların kullanılması, oositler inkübasyon veya yıkama kapları arasında taşınırken solüsyon transferinin minimumda tutulmasını sağlar. Ucunu cep çakmağının aleviyle kısaca eritin. Bu parlatma işlemi oosit hasarını önler.
  2. Ölçülecek her oosit için 1 ml Millipore su ile doldurulmuş 1.5 ml'lik bir Eppendorf tüpü hazırlayın. Rb+-içermeyen yıkama tamponu (örneğin PLB) içeren üç Petri kabı ve Millipore su içeren bir Petri kabı düzenleyin.
  3. Ön inkübasyonu yapılmış beş oositi aynı anda Rb+ akı tamponu (0 ile 15 mM Rb+ arası konsantrasyonlar) ile doldurulmuş 3.5 cm'lik bir Petri kabına aktarın ve sıcaklık kontrolü altında (örneğin klimalı bir odada 21 °C'de veya bir ısıtma plakasında) 3 dakika (Na+,K+-ATPase) veya 15 dakika (H+,K+-ATPase) inkübe edin.
  4. Oositleri aynı anda Rb+-içermeyen yıkama tamponu içeren ilk kaba aktarın (Na+,K+-ATPase durumunda PLB kullanılabilir). İnkübasyon süreleri arasındaki sapmaların 5 saniyeden kısa tutulması zorunludur. Nazikçe durulayın.
  5. Oositleri Rb+-içermeyen yıkama tamponu içeren ikinci ve üçüncü kaba taşıyın, nazikçe durulayın.
  6. Oositleri Millipore su içeren kaba aktarın, nazikçe durulayın.
  7. Her bir oositi tek tek, 1 ml Millipore su ile doldurulmuş hazırlanan Eppendorf tüplerinden birine aktarın.
  8. Solüsyon homojen bir şekilde bulanıklaşana kadar 200 μl'lik bir pipet ucuyla yukarı-aşağı pipetleme yaparak oositi homojenize edin.

10. THGA Fırın Sistemini Kullanarak AAnalyst 800'in Hazırlanması

  1. Gerekli inert gazın (argon) vanasını açın ve uygun bir içi boş katot lambası (Li için tek elementli HCL'ler) yerleştirin+ veya Rb+; Photron, Melbourne, Avustralya) rastgele bir soket konumunda.
  2. WinLab32 kontrol yazılımını (Perkin Elmer) başlatın ve uygun boş katot lambasını açın. Perkin Elmer Lumina boş katot lambaları otomatik olarak tanınır ve seçim listesinde görünür. Uyumlu olmayan boş katot lambalarının manuel olarak girilmesi gerekir.
  3. Lambaların dengelenmesi için yaklaşık 10-15 dakikalık bir ısınma süresi tanıyın.
  4. THGA tüpünün (enine ısıtmalı grafit atomize edici tüp, Perkin Elmer, #B3000641) gözle kontrol edilerek iyi durumda olduğundan emin olun. THGA fırınları her 300 atışta bir (üretici tarafından belirtilen ortalama ömür) değiştirilmelidir, ancak daha fazla numune sayısına da dayanabilirler.
  5. WinLab32'de "THGA furnace" tekniğini seçin.
  6. Rb ile en az beş kalibrasyon örneği hazırlayın+/Li+ 10 ile ... arasındaki konsantrasyonlar 50 μg/L (ör. (1 M RbCl veya LiCl çözeltisinin uygun şekilde seyreltilmesiyle) ve sadece Millipore su içeren bir adet boş prob ile. Not: Tuzlar mevcut olan en yüksek saflıkta ("puriss." veya AAS amaçlı ticari olarak mevcut kalibrasyon standartlarından) olmalıdır.
  7. Uygun başlatma dosyasını (kalibrasyon parametrelerine referans sağlayan ve cihaz ayarlarını yükleyen "yöntem" dosyası olarak adlandırılır, ör. AAS deteksiyon dalga boyu, Rb için dalga boyları+ ve Li+ (sırasıyla 780 nm ve 670,8 nm'dir), ardından kalibrasyon numunelerinin konumlarını ve konsantrasyonlarını girin. Bu amaçla, uygun otomatik numune alıcıyı (AAnalyst 800 cihazı için 88 veya 148 numune alma konumlu numune tepsisi) seçin.
  8. Kalibrasyon eğrisini ölçün.
  9. Şimdi her bir oosit homojenatını ayrı 1,2 ml'lik polipropilen numune kaplarına (Perkin Elmer, #B0510397) aktarın ve bu test tüplerini otomatik örnekleyici tepsisine yerleştirin.
  10. Otomatik örnekleyici konumlarındaki probları tanımlamak için örnek bir bilgi dosyası oluşturun, ardından örnek hacmini şuna göre ayarlayın 20 μlve cihazı çalıştırın.
  11. Çalışma tamamlandıktan sonra (veya uzun örnek serileri için her saat başı yapılan görsel inceleme sırasında), ölçülen Rb miktarı... olan probları kontrol edin.+ kalibrasyon eğrisinin maksimum değerini aşıyorsa, ilgili örnekleri uygun şekilde seyreltin ve tekrar ölçün.

11. Büyük Örnek Sayılarının Ölçümü İçin Notlar (50'nin Üzeri)

  • Cihazın gece boyu çalıştırılması durumunda, test tüplerindeki homojenatların buharlaşmasını önlemek için otomatik örnekleyici rezervuarının Millipore su ile doldurulması önerilir.
  • Otomatik örnekleyicinin enjeksiyon kılcal tüpünün tıkanmasını önlemek için her 20 örnek arasına %2 HNO3 içeren bir test tüpü yerleştirilmesi önerilir.

Rubidyum için önerilen THGA-AAS sıcaklık protokolü

AdımSıcaklık (°C)Rampa Süresi (sn)Bekleme Süresi (sn)Argon Gaz Akışı (ml/min)
Kurutma 1110120250
Kurutma 2130530250
Piroliz300-6001020250
Atomizasyon1700-1800050
Temizleme240012250

Lityum için önerilen THGA-AAS sıcaklık protokolü

AdımSıcaklık (°C)Rampa Süresi (sn)Bekleme Süresi (sn)Argon Gaz Akışı (ml/min)
Kurutma 1110130250
Kurutma 21301530250
Piroliz9001020250
Atomizasyon2200050
Temizleme245013250

Veri analizi

  1. Her bir ölçüm koşulu için ortalama Rb+ alımını hesaplayın. AAS spektrofotometresi μg/L cinsinden değerler verir; bu değerlerin pmol/oosit/dk birimine dönüştürülmesi gerekir.
  2. Kinetik analizler (görünür KM değerleri) için, aynı partideki enjekte edilmemiş kontrol oositlerinden belirlenen arka plan Rb+ alımını, verilen RbCl konsantrasyonundaki değerden çıkarın.
  3. Origin yazılımı ile grafik çizin ve verilere bir Hill denklemi Hill denklem formülü; biyokimyasal kinetik diyagramı; bağlanma afinitesi analizi; enzim substratı. veya Michaelis-Menten fonksiyonu Enzim kinetiği denklemi; formül A = Amax[S]/(K0.5 + [S]); biyokimya kavramı. uydurması uygulayın. Bu denklemlerde, [S] substrat konsantrasyonunu, nH Hill katsayısını ve K0.5 yarı maksimum aktivasyon için gereken substrat konsantrasyonunu temsil eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Xenopus oosit ekspresyon sisteminde AAS tarafından K+- (veya Rb+)-karşı taşıma yapan P-tipi ATPazlar tarafından Rb+ alımının miktar tayini, enzim kinetik parametrelerinin güvenilir bir şekilde belirlenmesine olanak tanır.

Na+/K+-ATPase'nin taşıma stokiyometrisinin belirlenmesi

Elektrojenik Na+/K+-ATPase için Rb+ akıları, net yük taşınımı (pompa akımının zaman integrali) ile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Na +, K +- veya H +, K + -ATPaz eksprese eden bireysel Xenopus oositlerine alınan Rb + (veya Li + ) miktarını ölçmek için açıklanan yöntemin, katyona karşı taşınan P-tipi ATPazlar1,4,5,7,8 için taşımanın kinetik veya termodinamik parametrelerini belirlemek için çok yönlü, esnek ve doğru bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Radyoaktif izleyici akı analizlerine güvenli ve güvenilir bir alternatiftir ve oldukça kısa bir süre içinde çok çeşitl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, yöntem geliştirmenin ilk aşamasındaki cömert destekleri için Ernst Bamberg'e (Max-Planck-Biyofizik Enstitüsü, Frankfurt, Almanya), çok sayıda verimli tartışma için Kazuhiro Abe'ye (Kyoto Üniversitesi, Japonya) ve teknik destek için Dr. Michael Kohl'a (Analytik-Service, Woltersdorf, Almanya) teşekkür eder. Yazarlar, Perkin Elmer AAnalyst 800 cihazını (SFB 498) da finanse eden Alman Araştırma Vakfı DFG (Mükemmeliyet Kümesi "Katalizde Kavramları Birleştirici") tarafından sağlanan finansmanı minnetle kabul ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4.0 Ethicon Vicryl sütür malzemesiJohnson JohnsonV633H
Kollajenaz tip 1A, Clostridium hystolyticumSigma'danAldrichC9891
Yüksek Saflıkta PCR Ürün Saflaştırma KitiRoche Uygulamalı Bilim11732676001
Nükleaz içermeyen suAmbionAM9937
mMessage mMachine Kit SP6/ T7Ambion1340, 1344
Ouabain oktahidratSigma AldrichO3125
Trikain (etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu)Sigma AldrichA5040
Tavuk yumurtası akıSigma AldrichT2011
SCH28080Sigma AldrichS4443
AAnalyst 800Perkin Elmer0993-5256
WinLab32TMPerkin Elmer
BiyofotometreEppendorf6131 000.012
Borosilikat Kılcal DamarlarBilim ÜrünleriGB150F-8P
Hematokrit tüpleri 3.5 "Drummond Scientific3 000-203-G / X
İçi Boş Katot Lambası LityumFotronP929LL
İçi Boş Katot Lambası RubidyumPhotronP945
Mikropipet Çektirme NarishigeModeli PC-10
Oosit Kayıt Odası RC-10Warner Instr.W4 64-0306
Nanoject II Enjeksiyon PompasıDrummond Scientific3-000-204
pCLAMP yazılımıMoleküler Cihazlar
Polipropilen Numune Kabı (1,2 ml)Perkin ElmerB0510397
Speedvac - Yoğunlaştırıcı modeli 5301Eppendorf5301 000.210
THGA TüpPerkin ElmerB3000641
Turbo TEC-10CX AmplifikatörNPI ElektroniğiTEC-10CX

Kaynaklar

  1. Tavraz, N. N., et al. Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine. Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).
  2. Castillo, J. P., et al. Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).
  3. Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump. Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).
  4. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase. J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).
  5. Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions. J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).
  6. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes. Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).
  7. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes. PLoS One. 7, e33645(2012).
  8. Tavraz, N. N., et al. Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2. J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).
  9. Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).
  10. Koenderink, J. B., et al. Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation. Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).
  11. Price, E. M. J., Lingrel, B. Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme. Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).
  12. Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).
  13. Lafaire, A. V., Schwarz, W. Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis. J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).
  14. Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature. 450, 1043-1049 (2007).
  15. Toustrup-Jensen, M. S., et al. The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935. J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).
  16. Morth, J. P., et al. The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).
  17. Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).
  18. Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit. J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).
  19. Vedovato, N., Gadsby, D. C. The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions. J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).
  20. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J. Vis. Exp. (16), e758(2008).
  21. Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).
  22. Koenderink, J. B., et al. Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket. J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).
  23. Gottardi, C. J., Caplan, M. J. Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly. J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).
  24. Mathews, P. M., et al. Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase. Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).
  25. Horisberger, J. D., et al. The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps. J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).
  26. Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase. J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).
  27. Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase. Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İki Elektrotlu Voltaj KenetlemeRubidyum AlımıEnine Isıtmalı Grafit AtomizerMembran Potansiyeli KontrolüTaşıma Stokiyometrisi
Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.