Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

8.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50305

⸱

18 Mart 2013

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

Bu makalede

Özet

Burada sinir ve arka beyin işitsel akson liflerinin izleme seçici için erken civciv embriyo akustik ganglion içine floresan boya enjeksiyonu takiben mikrodiseksiyon tekniği tarif.

Özet

Embriyonik civciv periferik ve santral gangliyon hücre projeksiyonlar çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Işitsel sisteminde, sekizinci kranial sinir olan işitsel akson seçici etiketleme merkezi işitme devre geliştirme çalışması artıracaktır. Iç kulakta birden duyu organları VIII.yy. sinirin ^1. katkıda çünkü bu yaklaşım zordur. Ayrıca, güvenilir bir kuş VIII.yy. sinir içinde akson vestibüler gruplar karşısında işitsel ayırt işaretleyicileri tespit edilmesi henüz. Devreler oluşur önce duyu-uyarılmış yanıtlar mevcut değil gibi işitsel ve vestibüler yolları, erken embriyo işlevsel olarak ayırt edilemez. Merkezi projelendirme VIII.yy. sinir aksonlar bazı çalışmalar takip edilmiştir, ama işitsel akson etiketleme diğer VIII.yy. sinir bileşenler ^2,3 dan etiketleme eşlik etti. Burada, seçici labe için akustik gangliyondan anterograd izleme için bir yöntem açıklanmaktadırGelişmekte VIII.yy. sinir içinde l işitsel aksonlar. İlk olarak, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısına batırılmış bir 8 günlük civciv embriyo ön sefalik bölgede kısmi diseksiyon sonrası, koklear kanal anatomik işaretlemeler ile tanımlanır. Daha sonra, bir ince çekilmiş cam mikropipet akustik ganglion hücreleri bulunan kanal ve komşu bölge içine derin rodamin dekstran amin küçük bir miktar enjekte etmek için konumlandırılmıştır. Enjeksiyonu takiben otuz dakika içinde, işitsel aksonlar arka beyin içine merkezi izlenir ve daha sonra histolojik hazırlanmasını takiben canlandırılabilir. Bu yöntem, merkezi işitsel devre oluşumu periferik gelişimsel çalışmalar için kullanışlı bir araç sağlar.

Protokol

1. Aşağıdaki Diseksiyon araçları ve Reaktifler hazırlayın

Yapay serebrospinal akışkan (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCI, 1.2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCO _{3, 3} mM HEPES, 10 mM glikoz, ₂ mM CaCl2, 1.3 mM _MgSO4) sürekli olarak% 95 O ile aşılanmış Oda sıcaklığında ₂ /% 5 _CO2. Infüzyon için 2/3 kapağı açılmış bir delik olan bir 500 ml geniş ağızlı Nalgene kavanoza doldurun. Tank kavanoz kapağı delikten aCSF nüfuz bir bardak kök bubbler için tüp tarafından eklenecektir. Sıvının yaklaşık 1/3 ulaşmak ancak jant üzerine sıçramasına neden olacak kadar güçlü değildir kabarcıklar sabit bir akım elde etmek için baskı ayarlayın. Birbirlerinden ve gaz akışı türbülans tek tek örnekleri ayırmak için Nalgene kavanozun içine daldırın 5 ml cam şişe (6'ya kadar). ACSF herhangi bir doku inkübasyondan önce en azından 20 dakika için oksijenli olmalıdır.
Küçük silikon diseksiyon çanak (35 mm x 10 mmküçük altıgen polistiren içine yerleştirilen iki diseksiyon işaretçilerine (47 mm alt)) Sylgard Elastomere Kit kullanarak mm Petri kaplı tekne tartın.
İki ince uçlu forseps, bir eğri uçlu forseps, 50 ml beher, ve doku atıklar için bir kap.
Cam mikropipet (1.2 OD / 0.9 ID) ucunda açılış yaklaşık 20-50 mikron kadar kırılmış ve bir 6.25% çözüm rodamin dekstran amin (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) ile dolu Pulled% 0.4 Triton PBS X-100 . Mikromanipülatör picospritzer ve stabilize etmek için ince tüp ile takın.

2. Mikro-disseksiyon E8 ^4,5 az Baziler Papilla Ortaya Çıkardı

Kavisli bir forseps ile tekne tartmak içinde silikon kaplı diseksiyon çanak üzerine doğrudan başkanı yerleştirerek, sadece beyin sapı aşağıya E8 embriyo kesti.
Ilgi tarafındaki kulağınızı hafifçe görünür şekilde diseksiyon işaretçilerine kullanarak, bir ventral görünümü ile baş konumlandırmak, başını hafifçe dorsal eğik ve 10-30 derece uzaklıkta ce gelen işaretnter (Şekil 2A). Hemen işaretçilerine ile kafa sabitleyin. Iki taraflı izleme istenirse, merkez 0 derece kafası, ya da bir tam alttan görünüşü her iki taraftan erişilebilir. Sol tarafta ulaşılabilir, böylece Benzer bir şekilde, sol taraflı enjeksiyon için, merkezi -10 ila -30 dereceye kadar kafa sabitleyin.
50 ml'lik beher kullanarak, tam doku daldırarak, çanak içine oksijenli aCSF, 30 ml aktarın.
Hafifçe kavrayın ve ince ucu forseps kullanılarak alt çene aşağı soyma, ardından faiz tarafındaki alt gözkapağı çıkarın.
Kalan damak ve gırtlak gibi, üstteki damar dokusu çıkarın. Bu yumuşak dokular sıyırın yüzeyinin de farklı vertebral arterler ile chondrocranium geliştirme pürüzsüz bir yüzey ifşa edilmelidir. Bu noktada, karakteristik beyaz otoconial kitle görünür olmalıdır.
Içinde bırakarak dış meatus, çene eklem kıkırdağı ve orta kulak çevresindeki deri dikkatlice teşrihner kulak sağlam. Yavaşça bu kıkırdak yapıları kesip almak için forseps kullanın.
Ince forseps ipuçları nazik bir süpürme hareketi ile vertebral arterler ve kan göllenmesi çıkarın. Kan görünüm belirsiz olabilir ve koagülasyon enjeksiyon pipeti açılış fişi olabilir.
Bitişik duyusal epitel (baziler papilla) ve akustik gangliyon ile koklear kanal chondrocranium ⁶ altında yer alır ve anterior yakın distal-en uç (apeks) ile, ventral iç kulak uzanan uzunlamasına bir parmak şeklinde projeksiyon olarak görüntülenebilmektedir midline ^5. Görselleştirme yardımcı olabilir koklear kanal (Şekil 2B) apekste disseksiyon ve / veya otolithic kireçlenmeler (beyaz) küçük bir kan havuzu (kırmızı) olabilir. Apekste lagenar makula, bir duyu yama vestibüler fonksiyonun ^7,8 olduğu düşünülmektedir.

3. CN VIII İşitsel Elyaf seçici Etiketleme

Koklear kanal ve baziler papilla bölgede embriyonun yüzeyine yakın enjeksiyon pipeti yerleştirin.
Yavaş yavaş ilk ponksiyon kafatasına mikropipet indirin. Bu kranial bölgenin çevresindeki alanlarda daha ince ve daha az güç nüfuz gerektirir. Mikropipet şimdi koklea kanal içinde olmalıdır. Opsiyonel: izleme boya küçük bir enjeksiyon baziler papilla görüntülenmesine yardım için burada yapılabilir.
Mikropipet konumlandırarak olmadan, sadece ihlal koklear kanalın derin sınırına (Şekil 1) kadar düşürerek devam edin. Burada bir enjeksiyon yapın ve vestibüler lagena bulunduğu en proksimal bahşiş hariç, baziler papilla (Şekil 2C, 2D) uzunluğu boyunca birden çok bölgede tekrarlayın. 10-30 psi arasında yer alan picospritzer ile, birden çok enjeksiyon yapılır. Enjekte boya sıvı hacmi değişir ve istenilen etiketlenme ölçüde bağlıdır. Her enjeksiyon floresan boya-la yol açmalıdıryaklaşık 200 Beled nokta - 400 mikron çapında (Şekil 2B).
Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, beyin sapı Yukarıdaki örnek transeksiyonu ve sürekli% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile perfüze olan aCSF kapsayıcı içinde küçük bir kavanoza kaudal bölümünü yerleştirmek için bir transfer pipet kullanmak için forseps kullanabilir.
Her bir embriyo için istenen merkezi izleme ve mesafeye bağlı olarak, boya transferi için 20-30 dk bekleyin.
Dokular temizlenir ve histolojik kesit için hazırlamak. Burada gösterilen örnekte, doku% 4 paraformaldehit (1X PBS içerisinde) bir karışımı, gece boyunca,% 30 sakaroz (1X PBS içinde) batırılır.

4. Counterstaining ve Analiz

Counterstaining orient sıra ilgi belirli bölgelerini belirlemek gibi anatomik konuma gözlemci yardım etmek yararlıdır. Bu preparat içinde etkili bir counterstain kuvvetle l nörofilaman immün (Şekiller 1, 3B, 3E), birAbels akson ve MSS aksonal yollarının çizilmesi için izin verir.
Çıkıntılar rostro eksen boyunca birkaç yüz mikron ya da daha fazla uzatmak gibi analizi, etiketli bölge boyunca yapılmalıdır. Temel analiz bazı örnekler şunlardır: hedef hata oranları, zamanlama ve / veya projeksiyon modellerinin sapma değişiklikleri. RDA-etiketli aksonlar yüksek çözünürlüklü (Şekil 3A, 3B) ile periferik ve santral sinir sisteminde görüntülenmiştir.