Yöntem makalesi

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

DOI:

10.3791/50308

⸱

10 Nisan 2013

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR ve / veya tüm genom mikroarrayler kullanan sonraki gen ekspresyon analizi için yaralı sıçan beyinlerinin frozen adlı hipokampal nöronlar veya tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TBH sonrası uzun süreli zihinsel özürlü öğrenme, bellek ve yürütücü işlev için kritik olan medial temporal lobda hipokampus-bir bölgede yaralanma indüklenen nörodejenerasyon ile ilişkilidir. 1,2 Bu nedenle çalışmalarımızı spesifik nöronal gen ekspresyon analizi odaklanmak hipokampus farklı alt bölgelerinde nüfus. Emmert-Buck tarafından 1996 yılında gerçekleştirilen lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, et al., 3 tek hücrelerde gen ekspresyonunu analiz açısından önemli gelişmeler için izin verilen ve zenginleştirilmiş olan bu tür içeren bir memeli beyin gibi heterojen bir doku hücre popülasyonları fonksiyonel hücre tipleri binlerce. 4. Biz LCM ve TBH patogenezinde altında yatan moleküler mekanizmalarının araştırılması travmatik beyin hasarı iyi kurulmuş bir sıçan modeli (TBI) kullanın. Sıvı-perküsyon TBI'dan sonra, beyin, hemen kuru buz üstünde dondurulmuş, önceden belirlenmiş bir zaman travma sonrası da kaldırılırve kriyostat kesit için hazırlanmıştır. Sıçan beyinlerinde hemen OCT ve kesitli gömülü veya -80 birkaç ay saklanabilir ° C Lazer yakalama mikrodiseksiyon için kesit önce. Ayrıca, sirkadiyen ritimleri TBI etkilerini incelemek için LCM kullanın. Bunun için, biz memeli beynin ana saat içeren suprakiazmatik nukleus nöronları yakalamak. Burada, gerçek zamanlı PCR ve / tek tespit nöronlar (yaralı ve yozlaşan, Flor-Jade pozitif veya yaralanmamış, Flor-Jade-negatif) ve sonraki gen ekspresyon analizi için hipokampal nöronlar zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek LCM kullanımını göstermek veya tüm-genom mikroarrayler. Bu LCM-etkin çalışmalar sıçan hipokampus anatomik farklı bölgelerin seçici açığı bu farklı bölgelerden LCM elde nöronların farklı toplumlardaki farklı gen ekspresyon profilleri yansıtılır olduğunu ortaya koymuştur. Bizim tek hücre çalışmaları, nereden sonuçlarıBiz, boyama ve bitişik hipokampal nöronların hayatta transkripsiyonel profillerinin karşılaştırılması TBH sonrası hücre ölümü ve hayatta kalma düzenleyen bir hücre sağkalım reosta varlığını düşündürmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterojen dokuların gen ekspresyonu analiz her zaman sorunlu olmuştur;. Bu yaklaşık 5.000 farklı hücre tipleri vardır memeli beyninde, özellikle doğrudur önce lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, TBI etkileri genomik çalışmaların gelişmesine 4 in vivo olarak farklı nöronal hücre tipleri, aynı zamanda glial ve immünomodülatör hücreleri destekleyen sadece oluşan beyin hücrelerinin karışık bir nüfus gen ekspresyon analizi, esas alınmıştır. Sonuçlanan karmaşık gen ekspresyon profilleri, bu heterojen dokularından elde edilen ve yaralanma indüklenen hücresel sinyalleri, genellikle çelişkili desen TBI. 5 pre-klinik çalışmalarda etkili kanıtlanmış terapötik stratejilerin insan klinik çalışmalarda başarısızlık için bir açıklama olabilir

Sıçan kalça nöronların savunmasız nüfusları yaralanma indüklenen gen ifadesinin net bir anlayış elde etmek içinpocampus, biz ilk Emmert-Buck ve ark LCM tekniği. 3 Daha sonra, biz de kantitatif gerçek zamanlı PCR ve mikroarray analizi kullanılarak nöronlar ve mRNA profilleme için tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonlarının etkin yakalamak için bu mikrodiseksiyon tekniği modifiye ve optimize kabul . Genomik analiz için beyin dokusu frozenda mRNA bütünlüğünü korumak için, sabitleme, boyama ve donmuş sıçan beyin kesitleri nöronları hızlı yakalanması için mevcut protokoller güncellenmiştir. Tanımlama ve yaralı ve ölen hipokampal nöronların izolasyonu için, biz de LCM için Flor-Jade boyama tekniği optimize. Flor-Jade apoptotik ve nekrotik hücre ölümü arasında ayırım yapmaz. Böylece, dejenere olan nöronların bu tür tüm leke. 6,7 ile tespit edilebilir

Burada, tek ölen veya hayatta kalan nöronların havuzların yanı sıra zenginleştirilmiş populati bozkırlarında elde etmek için laboratuarda kullanılan protokol açıklarfarklı nöronal hücre tipleri (TBI sonrası gen ekspresyon analizi için yani CA1-CA3 nöronlar) arasında ons. Laboratuarda yapılan sıvı perküsyon beyin yaralanması için prosedür Shimamura ve ark. 8'de ayrıntılı olarak tarif edilen ve Alder ve arkadaşları tarafından yayımlanan Jüpiter fareler için lateral sıvı-perküsyon hasar protokol ile çok benzer. 9 LCM teknik sahip olduğu DNA bütünlüğü üzerinde çok az veya hiç etkisi olduğu gösterilmiştir, RNA ve dokularda protein, tanımlanmış olan bu hücre tiplerinin moleküler ve protein analizi için mükemmel bir araçtır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cerrahi Prosedürler ve TBI Akışkan Perküsyon

  1. Tüm hayvan deneyleri ilk Laboratuvar Hayvanlar (8th Edition, Ulusal Araştırma Konseyi) Bakım ve Kullanım Texas Medical Branch, Galveston, Teksas ve Sağlık Rehberi Ulusal Enstitüleri Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
  2. Sıçanlar (satıcı Charles Rivers, Portland elde yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçan, 400-500 gr, Maine) kafes başına iki ev ve bu sabit koşullar ile bir vivaryum yiyecek ve su ad libitum verilmiştir: ışık döngüsü (600 saat 1800 kullanmak için saat), sıcaklık 21 ° C (23 ° C) ve rutubet (% 40 ile% 50) bir hafta önce.
  3. % 4, izofluran entübe ve mekanik havalandırın ratlarda uyuştur (Nemi Bilimsel; New England Medical Instruments, Medway, MA) oksijen izofluran 1.5-2.0% ratlarda: hava (70:30) ve sıvı-perküsyon parasagital hazırlamak yaralanma önce açıklandığı gibi. 8, 10
  4. Deneysel tasarım bağlı yaralanma sonrası uygun zamanda noktada sıçan Kurban. Çabuk, beyinleri kaldırmak kuru buz üzerinde hemen dondurmak ve mağaza -80 50 ml'lik bir tüp içinde ° C veya dondurulmuş kesit için OCT gömmek için hemen devam.

2. Kesit ve Rat Beyin Boyanması

  1. Sabit bir sıcaklıkta muhafaza edilmesi durumunda derhal kullanılmaz Beyin dokusu bir ay kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir. -80 Donmuş Brain ardından ° ardından kesit için -20 ° C ile çözülmüş C, ve yeniden donmuş ikinci çözdürme sonrası kalite RNA verim yok. Beyin, OCT çözülmüş ve kesitli monte edildikten sonra, slaytlar 24 saat içinde boyandı ve boyanma bir saat için 30 dakika içinde LCM için kullanılmalıdır. Bu kaliteli RNA sağlayacaktır. LCM takiben, LCM kapaklar yakalanan hücrelere kadar bir hafta için -80 ° C'de lizis tamponu saklanabilir, ancak RNA yüksek kaliteyi sağlamak için zamanında izole edilmelidir.
  2. Önce beyin kesit için, RNaz-Zap kriyostat silin ve ETOH (her beyin arasındaki tek bıçak yerine) ile fırçaları temizleyin.
  3. -80 ° C dondurucu dan 50 ml tüp içinde beyin Al, -22 ° C ila yaklaşık olarak 10 dakika için tüp içinde çözülme bir sıcaklıkta kriyostat içine yerleştirin. Gazlı bez üzerine sahneye tüp ve yer kadar ventral tarafında beyin çıkarın.
  4. Bir jilet kullanarak, optik kiazma de serebellum ve ön kısmı sadece rostral beyin arka kısmını kaldırmak için beyin dilim. Ekim montaj orta (Tissue Tek) ile bir cryomold doldurun ve ön tarafı ile kalıp içine beyin aşağı yerleştirin. O (yaklaşık 10 dk) beyaza dönene kadar beyin dokusu montaj ortamında dondurmak için izin verin.
  5. OCT ile beyin üzerine numune disk (Tissue Tek) dondurun. Kalıptan beyin çıkarın. Numune kafa içine beyin takın ve vidaları sıkın.
  6. Bir tek kullanımlık eklemeble, düşük profilli bıçak tutucu içine bıçak (Fisher Scientific) ve kolu aşağı sıkın.
  7. OCT dış katmanı kaldırmak için 20 mikron de beyin dilimleme başlayın. Hipokampal bölgede ulaşıldığında, 10 mikron kadranını ayarlayın. Doku bölümünde (Fisher Scientific) üzerine bir cam slayt veya artı-cam slayt koyarak koronal seri bölümleri toplayın. Kesit tamamlanana kadar Slaytlar bir RNaz ücretsiz boyama rafa -20 ° C'de muhafaza edilmiştir.
  8. Doku kesitlerinde işlenir cam tüm RNaz kaldırmak için, tüm boyama kapları silin ve ELIMINase (Fisher Scientific) ile silindir mezun ve Milli Q su ile durulayın. RNaz içermeyen su ile tüm çözümleri hazırlayın ve cresyl menekşe (Sigma-Aldrich) ve Flor-Jade (Histo-kimya) kullanmadan önce filtre 0.2 mikron ile leke filtre.
  9. 30 sn için RT beyin kesitleri çözülme ve% 75 ETOH (1 dak) sabitleyin.
  10. Fiksasyon sonra tek yaralanan nöronların LCM için RNaz içermeyen su (1 dak) slaytlar durulama, 1% cresyl menekşe (15-20 sn) ile counterstain, RNaz içermeyen su (2 × 30 sn) durulama, Flor-Jade (4 dk) ile leke, RNaz içermeyen su (3 × 1 dk) durulayın RNase içermeyen su (30 sn),% 100 EtOH (30 sn) ve ksilen (2 x 3 dk) elde edilen% 95 EtOH ile kurutmak.
  11. Fiksasyon sonrası nöron bozkırlarında LCM için RNaz içermeyen su (1 dak) slaytlar durulama,% 1 cresyl menekşe (1 dk) ile leke, (3 × 1 dk) RNaz içermeyen su ile durulayın,% 95 ile kurutmak EtOH (2 x 30 sn),% 100 EtOH (2 x 30 sn) ve ksilen (2 x 3 dk).
  12. Hava LCM öncesinde 15 dakika bir davlumbaz tüm bölümleri kurutun. Onlar odadan odaya transfer gerekiyorsa Slaytlar, Dessicant ile kaplı bir slayt kutusunda, yukarı bölümünde iki saklanabilir. Bölümleri kuru sonra LCM hemen gerçekleştirilir Ancak, iyi sonuçlar elde edilir. LCM 30 dakika ile 1 saat ile sınırlı olmalıdır. Bir sonraki bölümde, biz ea olan hücrelerin sürekli bozkırlarında, yakalamak için nasıl ilk tarifsiest bu tekniği öğrenen kişiler için usta. Sonra tam tek nöronların yakalamak için nasıl açıklar. Bizim prosedürü, biz dejenere nöronların Floro-Jade-bir işaretleyici için onların yakınlığı tarafından ölüyor nöronların tanımlamak. Fluoro-Jade-negatif hücreleri nöronların hayatta kalan ettiği kabul edilmektedir.

3. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (LCM)

Hipokampal nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları bozkırlarında LCM

  1. LCM kızılötesi bir lazer diod (Life Technologies) ile bir PixCell mikroskop IIe kullanılarak gerçekleştirilir.
  2. Dikey konuma merkezine joystick'e ayarlayın. Döndür ve pozisyona 4X objektif kilitleyin.
  3. Mikroskop aşama merkezinde bir slayt yerleştirin ve hipokampus bölgesinde görünümde kadar elle ayarlamak. Odak haline görüntüyü getirmek için kaba ve hassas fokus ayar kullanın.
  4. Kumanda üzerindeki vakum düğmesine basarak vakum mandreni etkinleştirin. Pl içine 10X objektif döndürün ve kilitleyinace. Kaba ve ince ayarlar ile tekrar odaklanın.
  5. CapSure kaset modülü ve pozisyon yük hattı pozisyonunda bir kap içine CapSure Makro LCM kapaklar (Life Technologies) yerleştirin. Kapağı etrafında Cap Yerleştirme kolu ve pozisyon döndürün. Kaset modülü CapSure kapağını kaldırmak için Cap Yerleştirme kolunu kaldırın.
  6. Slayt üzerinde Cap Yerleştirme kolu döndürün ve slayt üzerindeki kolu aşağı düşürmek, bu slayt üzerine kapağı yerleştirecektir. Ince odak ayarlayın ve hücre kapağı üzerindeki siyah daire içinde olup olmadığını kontrol etmek için kumanda kolunu hareket ettirin. Tüm hücre yakalar bu siyah daire içinde olmalıdır.
  7. Lazer parametreleri ayarlayın. İlk olarak, denetleyici üzerindeki lazer etkinleştirmek düğmesine basın. Lazer hedef nokta bilgisayar monitörü üzerinde görüş alanında pembe bir nokta olarak görünür olacaktır.
  8. 75 mW, 1.0-2.0 msn için optimal hücre yakalama için gerektiği gibi - lazer odaklanmak ve 65 gücünü ve süresini ayarlamak için küçük lazer nokta boyutu (7.5 mikron) ayarlayın.
  9. Te içinLazer st almak için hiçbir hücre olduğu yerde bir alana lazer nokta hareket etmek için joystick'i kullanın. Başparmak anahtarı kullanarak lazer ateşleyin. Görünür bir karanlık halka lazer kovuldu açık alanı çevreleyen görmek için uzağa erimiş polimer nokta lazer nokta hareket ve kontrol etmek için joystick'i kullanın.
  10. Hücreleri yakalamak için yakalama hücrelerin alana lazer nokta hareket etmek için joystick'i kullanın. Başparmak anahtarı kullanarak lazer ateşleyin. Hücrelerin geniş bir alana yakalamak için lazer ateşleme sırasında kumanda kolu hareket ettirin. Lazer çalıştığı zaman, hedef hücrelerin yüzeyine kapak üzerinde termoplastik polimer filmi erir. Böylece polimer gelecek moleküler uygulamalar için örnek bütünlüğünü sağlamak RNA, DNA ya da protein değiştiren değil, lazer radyasyonu absorbe eder.
  11. Ilgi tüm hücreleri pişirme sonrası, Cap Yerleştirme kolunu kaldırın. Yakalanan hücreler doku bölümünden ayırmak ve CapSure kap uyacaktır. Kalan doku ve eksik hücrelerin vis olacakgörüş alanında yuvarlak cephelere. Kapak üzerinde hücreleri de sürgünün boş bir kısım üzerinde kapak yerleştirerek görülebilir.
  12. Cap Yerleştirme kolunu kaldırın ve Cap İstasyonu Unload döndürün. Istasyonu kapağını indirin ve önceki konumuna geri Cap Yerleştirme kolunu döndürün.
  13. Platformu boyunca ve kabını CapSure ekleme aracını kaydırın. Platformdan alet kaldırın. Kapağı takılı kalır. Hafifçe istenmeyen doku uzak temizlemek için CapSure temiz ped kap dokunun.
  14. RNAqueous Mikro-İzolasyon kiti elde edilen lizis tamponu 100 ul ile dolu bir 0.5 ml RNase içermeyen tüp içine kapak yerleştirin. Hücreler lyse 30 sn için hemen girdap kap. 42'de örnekleri inkübe -80 ° de 30 dakika ve dondurularak ° C'de RNA izolasyonu kadar.

Hipokampusta tek FJ + nöronların LCM

  1. Tek hücre yakalamak için, CapSure kaset modülü ve positi içine CapSure HS LCM kapaklar yükleyebilirsinizyük hattı konumunda kapağı. Cap Yerleştirme kolu çevirin ve kapağı etrafında konumlandırın. Kaset modülü CapSure kapağını kaldırmak için Cap Yerleştirme kolunu kaldırın.
  2. Lazer odak ve tek hücrelerin optimum hücre yakalama için 0,45-0,50 msn için 65 -75 mW lazer gücü ve süresini ayarlamak için küçük lazer nokta boyutu (7.5 mikron) ayarlayın.
  3. Slayt üzerinde Cap Yerleştirme kolu döndürün ve slayt doğru kolu aşağı indirin. Bu slayt üzerine kapak yerleştirir. Capsure HS kap yüzeyi LCM sırasında örnek bir yükseklikte duruyor.
  4. Tek FJ + hücreleri üzerinde lazer hareket etmek için joystick'i kullanın. Çekilen tüm hücreler kapağı üzerindeki küçük siyah bir halka içinde olmalıdır. Başparmak anahtarı kullanarak lazer ateşleyin.
  5. Siyah bir daire alanı içindeki tüm hücreler lazer ile ateş edildiğinde, Cap Yerleştirme kolunu kaldırın. Yakalanan hücreler doku bölümünden ayırmak ve CapSure HS kap uyacaktır.
  6. Micros başka bir slayt yerleştirinevre baş ve HS kap dolana kadar FJ + hücreleri toplamak. Lizis tamponu 40-50 ul ile dolu bir 0.5 ml RNase içermeyen tüp içine kapak yerleştirin. Hücreler lyse 30 sn için hemen girdap kap. 42'de örnekleri inkübe -80 ° de 30 dakika ve dondurularak ° C'de RNA izolasyonu kadar.

4. LCM Örnekleri kaynaktan Toplam RNA İzolasyonu (Bu bölüm sadece video sunumu olarak tarif edilecektir)

  1. Hücrelerinden toplam RNA, imalatçının protokolü takip RNAqueous-Micro Kit (Ambion) kullanılarak izole edilir. Tüm reaktifler ve yıkama çözümleri bu kitinde. Filtre lizis çözüm tampon 30 ul ekleyerek Pre-ıslak mikro filtre kartuşu tertibatını. 5 dakika sonra, 10,000 x g hızında 30 saniye için filtre santrifüjlenir.
  2. Örnek lizat için LCM katkı 3 ul ekleyin, pipet karıştırın ve santrifüj.
  3. Örnek lizat 100% ETOH (1/2 hacim) 52 ul ekleyin; pipet karıştırın ve filtreye lizat aktarmak içinsütun.
  4. Sütun RNA bağlamak için 1 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin filtre kolon. Bir örnek için birden kapaklar varsa, ayrı ayrı aynı sütun aracılığıyla her lizat dönerler.
  5. RNAqueous Micro kiti açıklandığı gibi RNA izolasyon prosedürü tamamlayın.
  6. DNaz tedavi ve gibi kit açıklandığı LCM RNA örneklerinin DNaz inaktivasyonu gerçekleştirin, -80 bir RNaz ücretsiz tüp ve mağaza ° C'ye RNA transferi

5. RNA niceliksel ve Mansap Uygulamaları

RNA kalitesi ve miktarının değerlendirilmesi bir Agilent Bioanalyzer üreticinin protokolü takip Pico Takımı (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) reaktifleri kullanılarak yapılır.

  1. Toplam RNA bir Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) analiz edilir. Yazılım, her bir numune arasında değişen f, bir RNA bütünlüğü sayısı (RIN) atayarak konsantrasyon ve RNA numunesinin bütünlüğü değerlendirirrom 1 ile 10. 1-5 bozulmuş RNA gösterir ve 7-10 kaliteli RNA gösterir.
  2. SYBR-yeşil kimya kullanarak bireysel Taqman deneyleri veya RT2 profiler dizileri; Sigara bozulmuş bozulmadan RNA Real-Time PCR için kullanılacaktır. RNA mRNA mikroarray ve microRNA mikroarray için de kullanılabilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim ilk LCM çalışmada TBI. 8 Şekil 1A-1C onların açığını yansıtan gen ekspresyon profilleri var sıçan hipokampus bu işlevsel farklı alt bölgeler (CA1 ve CA3) göstermek için başardık (hipokampal piramidal nöronları lazer yakalama gösterir CA1- CA3) önce, ve LCM sonra dentat girus nöronlar ve SCN nöron. Piramidal, granül veya sırasıyla SCN nöron, Temiz yakalar, makro kapaklar üzerinde gösterilmiştir. Şekil 2A-2B göstermektedir Flor-Jade pozitif piramidal nöronlar, ölüyor ve LCM önce ve sonra, Flor-Jade negatif piramidal nöronların hayatta. Ölen veya nöronların hayatta kalma temiz yakalama LCM kapaklar üzerinde yakalanan hücreleri inceleyen tarafından gösterilir.

LCM sonra, toplam RNA TaqMan veya SYBR yeşil kimyaları (Şekil 3A), küçük focu kullanılarak gen ekspresyonunun kantitatif gerçek-zamanlı PCR analizi de dahil olmak üzere klinik çalışmalar çeşitli bir dizi için de kullanılabilirSYBR yeşil sondalar (Şekil 3B) veya tüm genom mikroarray çalışmalar (Şekil 3C) ile PCR diziler sed.

figure-results-1
Şekil 1. Sıçan beyninden tanımlanmış hücre popülasyonlarının bozkırlarında Lazer yakalama mikrodiseksiyon. Sıçan beyinlerinin Dondurulmuş 10 mikron koronal kesitler, etanol sabit bir Nissl leke (cresyl mor) ile boyandı ve LCM için hazırlanmıştır. Gösterilen sıçan hipokampus ve suprakiazmatik nükleus resimlerini hipokampal dentat girus sıçan hipokampus CA1-CA3 altalanları gelen LCM ve makro kapaklar üzerindeki görselleştirildiği olarak yakalanan hücreleri. A. piramidal nöronlar önce ve sonra. B. Granül hücrelerdir. C. ikili suprakiazmatik nukleus üçüncü karıncığın her iki tarafında yer alanve optik kiazma üstünde yer. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-2
Şekil 2. Sıçan hipokampus tek nöronların Lazer yakalama mikrodiseksiyon. Gösterildi CA3 nöronlarının öncesi ve LCM sonra A. Dejenere, Flor-Jade-pozitif (lekeli) hipokampal CA3 nöronlar ve B. Yaşayan, Flor-Jade-negatif (boyanmamış) vardır. Yakalanan hücreleri görüntülenmiştir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-3 Şekil 3,. Toplam RNA gen ekspresyonu analizi lazer yakalanan nöronların izole. HSN'de sirkadiyen saat gen ekspresyonu A. kantitatif gerçek zamanlı PCR veriler. Odaklanmış PCR dizileri kullanarak apoptoz ile ilişkili genlerin ekspresyonu gösteren hipokampal nöronlar ölüyor ve hayatta gen ifadesinin B. İlgi haritası . C. Agilent TBI veya TBI sham yaralanma alınan fareler, artı beyin hasarı (nöronal nitrik oksit tarafından uyarılan genlerin knockdown ifadesi için tasarlanmış bir rekombinant adeno-ilişkili siRNA virüs hipokampal CA1-CA3 nöronlarında gen ifadesinin bütün-genom mikroarray analizi sentaz ve glutatyon peroksidaz-1). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu LCM tekniği TBI moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında önemli ilerlemeler yapmak için bize sağlamıştır. 8,10,11,12,13 Biz sıçan hipokampus farklı alt bölgeler gen ekspresyon profilleri var olduğunu göstermek için bu tekniği kullanan ilk araştırmacılar olduğunu yaralanma onların seçici açığı ile ilişkilidir. Çalışmalarımız biz 10 gibi az sayıda lazer yakalanan hücreleri, qPCR göre, gen ekspresyonu ölçmek ve biz 600 yakalanan hücreleri gibi birkaç itibaren genom mikroarray analizi gerçekleştirmek verebilecek olabileceğini gösterdi. LCM çeşitli nörolojik ve nöropsikiyatrik hastalıklardaki rolü olduğu bilinen diğer beyin bölgelerinin benzer çalışmalarda değerli bir araç olacaktır. Örneğin, LCM kullanıldığı çalışmalarda ler karışmış ödül devrelerini katılır akumbens genom-geniş profilleme çalışmaları, substantia nigra, 14 dopamin nöronlar Parkinson hastalığının patogenezinde içine ışık tutacak ve yardım etmişubstance kötüye kullanım bozuklukları. 15.

Nöronal heterojenite genom düzeyinde 16 yansiyan ve klinik çalışmalarda TBI için deneysel tedavilerin başarı eksikliğinin katkıda bulunabilir. Böylece, amacımız TBH sonrası nöronal sağkalımı etkileyen kritik unsurları araştırmak için bu tekniği kullanmaktır. Ölüyor ve bitişik TBH sonrası hipokampal nöronların hayatta Bizim son genom profilleme çalışmada hücre ölümüne genler hücre canlılığı ekspresyon düzeylerinin oranı yansıtmaktadır hücresel reosta TBH sonrası hücre kaderinin düzenler önerdi. Bu devam eden çalışmalar olumlu hücre sağkalım reosta etkileyebilir farmakoterapötik stratejilerinin tasarım ve gelişimine katkı sağlayacak. Ayrıca, şu anda TBH sonrası hipokampal nöronlarda potansiyel terapötik ilaç tedavilerinin etkilerini izlemek ve izlemek için LCM kullanın. Böylece, çalışmalar verilen dikkatli RNaz ücretsiz taşıma teknikleri ve bazı göstermekmevcut protokollerde değişiklik, bu doğru kantitatif gen ifadesi için analiz LCM yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek mümkün olur.

Bununla birlikte LCM teknikleri ile ilgili bir kaç zorluk vardır. Örneğin, herhangi bir mikroglia kontaminasyon olmaksızın sadece sinir hücreleri toplamak neredeyse imkansız olabilir. Hipokampus piramidal hücre tabakası yılında, hücrelerin% 95 glial ve diğer hücre tiplerinin küçük bir yüzdesi bırakarak, piramidal hücreler ve% 10 internöron olmak için bu nüfusun% 90 ile nöronlar. 8,17 olduğu tahmin edilmiştir Çalışmamızda 18 biz Fluoro yeşim özellikle beyin dokusunda yalnızca yaralandı nöronlar etiketler floresan boya kullanın. GFAP için bir belirteç olduğunu farklı bir leke mikroglia leke için gerekli olacaktır. Yalnızca Fluoro yeşim lekeli tek nöron gövdeleri Toplama 19 nöronların daha homojen bir nüfusa sağlar. Sorun giderme gerektirebilir Başka bir yaygın sorun bir daire hiçbir olmasıdırlazer ateşlendiğinde t tanımlanır. Bu durum ortaya çıkarsa, bu lazer ayarlarını kontrol edin ve gerekirse güç ve süresini ayarlamak için gereklidir. Ayrıca kapak dokusu düz yerleştirilir ve kol düzgün oturduğundan emin olmak için önemlidir. LCM teknik el kitabına atıfta bulunarak veya teknik desteği aramadan bazen gerekli olacaktır. LCM ve RNA izolasyonu sonra, RNA kalitesi her zaman önce herhangi bir gen ekspresyon analizi için bir Bioanalyzer ile değerlendirilmelidir.

Lazer kesim (Life Technologies, Leica Microsystems) ve (Zeiss) araçların catapulting lazer dahil olmak üzere şu anda piyasada lazer yakalama araçları çeşitli türleri vardır. Bizim LCM sistemi hücrelerinin az sayıda yakalamak için iyi çalışır. Diğer yüksek verimlilik ve daha fazla otomasyon sistemleri genomik ve özellikle proteomik analizi için hücrelerin büyük sayılar elde etmek için daha uygun olabilir. Nitekim, bu otomatik sistemler kullanılarak LCM pr analizi için büyük bir potansiyele sahiptespit hücrelerin veya hücre popülasyonlarında zenginleştirilmiş otein ifadesi. 20. Ayrıca, LCM bize, en heterojen dokularda karmaşıklık bağımsız olarak tanımlanmış hücre tiplerinde in gen ekspresyonunu araştırmak için izin immunolabeled hücreleri, 21, gen ekspresyonunu analiz kolaylaştırabilir. Böylece, LCM hücrelerin tek veya zenginleştirilmiş popülasyonlarının üstün moleküler çalışmalar için mükemmel bir araçtır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser R01 NS052532 (HLH için), Moody Vakfı ve Anesteziyoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir. Biz Laurie Kalınlaştırma, kendi editoryal yardım için Christine Courteau Butler ve Christy Perry ve düzeni ve tüm şekil, tablo ve sanat mükemmel üretim için Christy Perry ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PixCell IIe Lazer Yakalama MikroskobuYaşam Teknolojileri (Arcturus)
Agilent 2100 BiyoanalizörAgilent Technologies
RNAqueous Micro-KitLife Technologies (Ambion)AM1931
Agilent 6000 Pico KitiAgilent Technologies5067-1513
Capsure LCM kapaklarıUygulamalı BiyosistemlerLCM0211/LCM0214
Floro-YeşimHisto-chem Inc.
Cresil Menekşe AsetatSigma-aldrichC5042-10G
Ksilen (Histolojik sınıf)Fisher ScientificX3P-1GAL
Etanol 200 kanıt (Histolojik sınıf)UTMB eczane
RNase içermeyen bariyer pipet uçlarıFisher Scientific2123635, 212364, 212361, 21-236-2A
Arcturus Lazer Yakalama Mikrodiseksiyon sistemi (Yaşam Teknolojileri)
Zeiss Lazer Mikrodiseksiyon PALM ailesi
Leica Microsystems
#1FJ

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
  2. Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
  3. Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  4. Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
  5. Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
  6. Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
  7. Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
  8. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
  9. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063(2011).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).
  11. Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
  12. Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
  13. Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311(2011).
  14. Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
  15. Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98(2011).
  16. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  17. Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
  18. Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
  19. Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
  20. Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
  21. Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hipokampal N ronlarFluoro Jade BoyamasGer ek Zamanl PCRT m Genom MikroarrayKriyostat Kesit AlmaOCT G mme

İlgili makaleler