Yöntem makalesi

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

DOI:

10.3791/50312

⸱

30 Nisan 2013

 , 
1Department of Physiology, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video, karmaşık nöral devreleri koruyan bir bütün beyin hazırlık, belirlenen tek nöronlardan elektriksel aktivite kayıt nasıl gösterecektir. Biz gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) nöronlar genetik sağlam beyin hazırlanmasında tanımlama için bir floresan protein ile etiketlenmiş edildiği transgenik balık kullanabilirsiniz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık davranışlar düzenleyen nöral devrelerin hücre fizyolojisi anlayışı bu iş CNS sinir devresi bozulmadan kalır sağlam bir beyin hazırlanmasında yapılabilir hangi model sistemler kullanılarak büyük ölçüde geliştirilmiştir. Biz gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) nöronlar genetik sağlam beyinde tanımlanması için yeşil flüoresan protein ile etiketlenmiş edildiği transgenik balık kullanabilirsiniz. Balık GnRH nöron birden fazla nüfusa sahip ve işlevleri onların beyindeki yeri ve 1 ifade ettiği GnRH gen bağlıdır. Biz transgenik Medaka balık bozulmamış beyin (Şekil 1B ve C) kullanarak koku ampuller ile ilişkili terminal sinirler (TN) bulunan GnRH3 nöronlar bizim gösteri odaklanmıştır. Çalışmalar Medaka TN-GnRH3 nöronlar merkezi sinir sistemi ile dış çevreden bir bilgi verici olarak hareket eden, nöromodülatör olduğunu göstermektedir; they gibi tanınmış hipotalamik GnRH1 nöronlar 2, 3 yapmak. TN-GnRH3 nöronların spontan aksiyon potansiyeli ateşleme tonik desen içsel bir özellik 4-6, frekans, hipofiz-gonadal fonksiyonları düzenleyen doğrudan bir rol oynamaz hangi conspecifics 2 ve nöropeptid kisspeptin 1 5 ila görsel ipuçları ile modüle edilir. Bu video, TN-GnRH3 nöronların nasıl nöronlar belirlemek ve tüm beyin kendi elektriksel aktivite izlemek için size göstermek için gelişmiş yeşil flüoresan protein 7 bağlantılı Gnrh3 promotor bölgesinde içeren bir transgen ifade edildiği transgenik Medaka istikrarlı bir satırını kullanın Hazırlık 6.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yetişkin Medaka gelen Brain diseksiyonu

  1. Daldırma tarafından (Şekil 1A) kadın ya da erkek yetişkin anestezisi 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7.4); solungaçları hareketleri decapitating önce durdurdu sonra birkaç dakika bekleyin. Tüm işlemler California-Los Angeles Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
  2. 60 mm çapında Petri kabındaki makas ile operculum'un kuyruk sonunda balık tuzlu su içinde balık başını kesmek.
  3. 35 mm çapında Petri kabı transfer balık kafası, yarım tuzlu balık dolu ve beyin diseksiyon için baş konumlandırmak ve korumak için bir depresyon vardır Sylgard ile kaplı. Konum ve böcek işaretçilerine ile baş dorsal tarafı yukarı sabitleyin.
  4. Dikkatlice ince makas ile çevresinde kafatasının dorsal kısmı kesilmiş ve hafifçe tamamen omuriliğin ön kısmı dahil olmak üzere beynin dorsal kısmı açığa forseps ile çıkarın.
  5. ince ucu forseps ile yavaşça omurilik kaldırın ve ince uçlu makas ile ikili bağ sinirler sever: beynin ventral tarafta kranial sinirler, spinal sinirler ve optik sinirler ve ön kısmında koku sinirlerinin beyin.
  6. Balık tuzlu su ile dolu yeni bir Petri kabındaki tamamen disseke beyin yerleştirin ve tüm beyin herhangi bir kesik veya delikler olmadan (hipofiz bezi dahil) sağlam olduğundan emin olmak için mikroskop altında dikkatle kontrol edin. Hasarlı beyinleri deney için kullanılmaz.

2. Bir Kayıt Odası Beyin Montaj

  1. Siyanoakrilat küçük bir damla ya da kayıt odasının merkezine bir iğne ile diğer bazı hızlı etkili tutkal yerleştirin ve 1 cm yaklaşık 2 tutkal yayıldı.
  2. Hızlı bir ventral tarafı yukarı konumda beyin ve tutkal aşağı aktarın.
  3. Bu kayıt gözü doldurur ve beyin kapsar, böylece balık 1 ml tuzlu su ekleyin. Sürekli serpmeken az 200 ul / dak 'lık bir hızda tuzlu su ile gazlı balık beyin.
  4. Ince ucu kullanılarak dikkatlice beyin kayıt alanının yüzeyi üzerinde zarları forseps çıkarın.

3. Elektrofizyoloji

  1. Aksiyon potansiyeli ateşleme gevşek yama kayıt
    1. Cam Mikroelektronlar (M 6-10) bir elektrot çektirmesi (örneğin Sutter P-87) ile borosilikat cam pipetler (1B150F-4, Dünya Hassas Aletler) inşa ve geri yarım yukarı gevşek yama kayıt çözümü ile doldurulur elektrot.
    2. Bir soğutmalı şarj bağlı cihaz (CCD) kamera ile dik bir floresan mikroskop kullanılarak, GFP-ifade 10x ile TN-GnRH3 nöronlar (Şekil 1B), sonra 40x suya daldırma hedefleri (Şekil 1C) bulabilirsiniz. Onlar telencephalon sadece ön koku ampuller, en ventral yüzeyinde veya yakınında bulunmaktadır.
    3. Sağlayan bir video monitörü geçinmikroskop gerçek zamanlı görüntü TN-GnRH3 nöron kümesi (Şekil 1C) bulmak için.
    4. Elektrot ucu nöron hedefin üzerinde olduğunu, banyo içine mikroelektrot yerleştirin. Bu hale tıkanmış ve yavaşça elektrot ucu ile hedef nöron yaklaşım değildir böylece mikroelektrot sürekli hafif pozitif basınç uygulayın.
    5. AxoGraph yazılım ve Axograph yazılım (Axon Instruments) ile amplifikatör Axoclamp 200B kullanarak gerilim-kelepçe modunda elektrot direnci kontrol edin ve izleyin. Eğer elektrot ucu nöron yüzeyinde ve direnç biraz değiştirir AxoGraph ekrandan olduğunu video monitörden görebilirsiniz zaman, düşük bir direnç mühür yapmak için pozitif basınç serbest ve gerekirse hafif negatif basınç uygulayın nöron (<100 MQ).
    6. Akım kelepçe moduna geçin ve ölçek ayarlayarak, herhangi bir akım girişi olmadan sürekli membran gerilimi kayıtGerilim ve kayıt gerektiğinde oranının. Veri Powerlab yazılım (ADInstruments A.Ş.) tarafından toplanan ve analiz edilir.
    7. Herhangi bir tedavi (Şekil 2A) önce yaklaşık 5 dakika için normal bir balık tuzlu su içinde rekor temel elektriksel aktivite. Ilaçlar, hormonlar, peptidler, vb Bath perfüzyon. Balık bir tuza ilave edilmesi, normal tuzlu su balıkları 5, 6, 11, bir yıkanıp temizlenme süresi ile, ardından 200 ul / dk hızında devam eder.
  2. Membran potansiyeli tüm hücre kayıt
    3.1.4 - tüm hücre yama kelepçe elektrofizyolojik işlem adımları 3.1.1, yukarıda tarif edilen hücre-dışı gevşek yama kayıt prosedürü bu kadar aynıdır. Daha sonra, buna göre usul sapma:
    1. Gerilim-kelepçe modunda elektrot direnci kontrol edin ve izleyin. Eğer direnç değişiklikleri biraz, olumlu serbest olduğu elektrot ucu nöron yüzeyinde ve osiloskop ait olduğunu video monitörden görebilirsiniz zamanbasınç ve nöron (~ 3 Giga Ω) bir yüksek direnç mühür yapmak için biraz negatif basınç uygulayın. Rüptürü yamalı membran ağızdan bir negatif basınç uygulayın, siz MQ hakkında 120-250 için direnç ani bir düşüş göreceksiniz.
    2. Akım kelepçe moduna geçin ve kayıt gerekirse gerilim ve hız ölçeği ayarlama, herhangi bir akım girişi olmadan sürekli membran gerilimi kaydedin.
    3. Herhangi bir tedaviden önce yaklaşık 5 dakika için normal tuzlu su içinde balık kayıt taban elektriksel aktivite yanı 3.1.7 (Şekil 2B) olarak yukarıda tarif edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Medaka balık Kesilerek çıkarılan beynin GFP-etiketli TN-GnRH3 nöronların ikili kümelerinin bir örneği Şekiller 1B ve 1C 'de gösterilmiştir. Her küme 8-10 GnRH nöronları içerir. Hedef TN-GnRH3 kendiliğinden nöronal aktiviteleri 0.5-6 Hz tipik ateş oranları ile akım kelepçe modu (I = 0) kaydedildi. Aksiyon potansiyeli ateşleme paterni oldukça düzenli interspike aralığı ile, tipik bir tonik veya dayak kalıptır. Örnek izleri Şekil 2 (:;: tam hücre 2B gevşek yama 2A) ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GnRH 3: GFP transgenik balıklar nöronal entegrasyon ve doğrudan ve dolaylı olarak üreme 3, 8-10 dahil her ikisi de davranışları merkezi kontrol düzenleme altında yatan nörofizyolojik mekanizmaları incelemek için benzersiz modelleri sağlar. Bu model sisteminin önemli avantajlarından biri, GFP ifade eden birçok GnRH3 nöronların sinir devreleri 6, 9, 11, 12 (Şekil bozmadan elektrofizyolojik kayıt için nöronlara nispeten kolay erişim sağlayan, beyin ventral yüzeyi yakın olması...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik yardım için Dr Meng-Çene Lin ve Bayan Yuan Dong teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık HD053767 Ulusal Enstitüsü (NLW için fason), bir hibe ile ve California-Los Angeles Araştırma, Üniversitesi (NLW) için Rektör Yardımcısı fizyolojisi ve Office Bölümü'nden fonları tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MikroskopOlympusBX50W (Dik)
AmplifikatörAxon InstrumentsAxoclamp 200B
AD dönüştürücüComputer Interference Corp.Digidata ITC-18
Soğutmalı CCD kameraPCO Bilgisayar OptiğiSensicam
Xenon lambaSutter Instruments Co.
GFP filtre setiChroma Technologies
Görüntüleme YazılımıAkıllı Görüntüleme YenilikleriSlayt Kitabı yazılımı
Elektrofizyoloji Veri Toplama YazılımıAxon Instruments Axographyazılımı
Elektrofizyoloji Veri Toplama YazılımıAD Instruments Inc.Elektrofizyoloji için PowerLab
HeadstageAxon InstrumentsCV 203BU
MikromanipülatörSutter Instrument CoMP-285
Kayıt Odası PlatformuWarner Instrument Corp.P1
Kayıt OdasıWarner Instrument Corp.RC-26G
Elektrot ÇektirmeSutter aletleriP87
Elektrot çektirme için filamentSutter InstrumentsFB330B3.0 mm genişliğinde oluk filamenti
1.5 mm cam kılcal damarlarWorld Precision Instruments1B150-4Micr & # 8211; Kayıt için lektro
ŞırıngaBecton Dickinson3095863 ml
MS-222 SigmaE10521-10GEtil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu
Balık tuzlumM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Elektrot çözeltisi (gevşek yama) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glikoz
Elektrot çözeltisi (tam hücre yaması) mM: 112.5 K-glukonat; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin; 10 fosfo-kreatin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909(2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

GnRH N ronlarElektrofizyolojik Kay tGFP EtiketlemeYama KenetlemeFloresan MikroskopiAksiyon PotansiyeliMembran PotansiyeliBeyin Diseksiyonu

İlgili makaleler