Yöntem makalesi

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

DOI:

10.3791/50313

⸱

18 Mart 2013

 ,  ,  , 
1Département Nociception et Douleur, Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), 2Departments of Anesthesiology and Pharmacology, Columbia University , 3Department of Anesthesiology, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir viral vektörün intraparankimal enjeksiyon nöronlar ya da merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerinde farklı popülasyonlarda şartlı gen manipülasyonu sağlar. Biz fare omurilik dorsal boynuz hedeflenen gen ekspresyonu veya susturulması sağlayan bir stereotaksik enjeksiyon tekniği göstermek. Cerrahi prosedür kısa. Bu hayvan ve omurganın uğramamış motilite hızlı kurtarma sağlayan, tek vertebra laminektomi gerektirir. Eğimli cam kanül ile mikroenjektör düşük hız ve kullanım küçük bir vektör süspansiyon hacmi Kontrollü enjeksiyonu doku lezyonu aza indirmek. Vektör lokal bağışıklık cevabında istihdam virüs içsel özelliklerine bağlıdır; bizim deneyim, bir rekombinant adeno-ilişkili virüs kullanıldığında küçük ve kısa sürelidir. Bu tür gelişmiş yeşil floresan proteini gibi bir raportör gen vektör izlenmesi uzaysal dağılımının kolaylaştırır ve etkinliği ve hücresel specitransfeksiyon özgüllük.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare koşullu gen manipülasyonu Gelişmiş teknolojiler merkezi sinir sisteminde sinaptik yollar ve fonksiyonel bağlantılarının araştırılması için çok yönlü yaklaşımlar sağlar. Transgenlerin östrojen reseptör 1 mutasyona uğramış bir ligand-bağlayıcı etki tanıyan bir repressör veya gen transkripsiyon aktivatörü veya tamoksifen gibi çalışması için dizayn edilebilir bir tetrasiklin kontrollü Transaktivatörü, hareket gibi doksisiklin gibi küçük moleküllü etkileyiciler tarafından düzenlenebilir . Tersinmez transgen değişiklik yaygın deoksiribonükleik asit (DNA) rekombinaz tarafından elde edilir. Cre (nedenleri rekombinasyon) ve FLP (flippase rekombinasyon enzim) e....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan cerrahi prosedür Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ekipman ve Virüs Parçacık Süspansiyon hazırlanması

  1. Ekipmanı temizleyin ve dezenfekte edin, cerrahi aletler ve vertebra L1 düzeltmek için kullanılacak V çentik sivri sterilize.
  2. Çekin ve konik cam pipetler. Biz, 40 um arasında bir uç çapı olan ve 20 ° 'lik bir açı ile eğimli olan pipetler kullanır. Cam pipetler sterilize.
  3. Stereotaksik çerçeve kurma, manipülatör üzerine mikroenjektör enjektör montaj ve kontrol için enjektör bağlayın.
  4. Sıkıştırma montaj takımı kullanılarak m....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başarılı transfeksiyon getirileri karşı tarafa, ventral boynuz ve dorsal kök gangliyon dorsal boynuz koruyucu enjekte dorsal boynuz (Şekil 1) nöronlar, sağlam gen ekspresyonu.

figure-results-1
Şekil 1. Dorsal boynuz nöron transfeksiyonu. (A) L4 omurilik, rAAV-EGFP bir stereotaksik enjeksiyon iki hafta sonra (serotip AAV2 / 8/10 9 genom kopyalarının sol arka boynuzu flüoresan raportör EGFP (yeşil) E.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereotaksik vektör enjeksiyon, nörodejenerasyon 11 önlenmesi veya tedavisi için yaralanma 9,10, veya gen tedavisi rejenerasyon sırasında 6,7 veya optogenetic disseksiyon 8, akson kılavuz yayılan virüs transsinaptik dayalı bu tür nöronal ağ eşleme gibi uygulamalar için, omurilik nöronları hedefleme sağlar 12. Viral vektörler somatosensoriyel, motor ve otonomik yolların 9,10,13-15 çalışma omurilikte gen manipülasyonu için kullanılmıştır. Fare en.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz teknik yardım için Bakhos A. Tannous, Ph.D., rAAV-eGFP vektör bize sağlamak için Massachusetts Genel Hastanesi, Charlestown, Massachusetts, Nörobilim Merkezi Vektör Geliştirme ve Üretim Direktörü, ve John Whang ederim. Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü ödenekle R01 NS050408 (JS için) desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzeme Adı Şirket Katalog Numarası
Spinal taban plakası David Kopf Instruments 912
Küçük hayvan stereotaksik alet David Kopf Instruments 900
Fare gaz anestezi kafa tutucu David Kopf Instruments 923-B
Ayarlanabilir taban bağlar David Kopf Instruments 982
V çentik sivri David Kopf Instruments 987
Küçük hayvan sıcaklık kontrol sistemi David Kopf Instruments Tcat-2LV
Adson forsepsi Güzel Bilim Araçları 11006-12
Laminektomi forseps Güzel Bilim Araçları 11223-20
SYS-Micro4 Controller ile UltraMicroPump (bir) Dünya Hassas Aletler UMP3-1
Mikroenjektör, 65RN Hamilton 7633-01
RN sıkıştırma uydurma, 1 mm Hamilton 55750-01
Borosilikat cam kapilerleri Dünya Hassas Aletler 1B100F-4
Microgrinder Narishige EG-44

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
  2. Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
  3. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Laminektomi Prosed rCam PipetMikro r ngaGeli tirilmi Ye il Floresan ProteinDorsal BoynuzCerrahi Teknik

İlgili makaleler