1. Microchip Fabrikasyon
İlk adım Mikrokanallı oluşturmak veya satın almaktır. Mikroçip malzeme için birçok seçenek vardır.
Seçilen en yaygın malzemelerden biri (PDMS) (dimetilsiloksan) poli. Yumuşak litografi 16,17,18 ile PDMS üretim için yönde birçok yayın bulunmaktadır.
PDMS kanal imal edildiğinde, çeşitli yüzey işlemleri, doğal hidrofob tersine çevirmek için mevcut bulunmaktadır. Oksijenli plazma tedavi ortak bir seçenektir.
Zhou, Ellis ve Voelcker (2009) yüzey işlemleri bir eleştiri vermek ve PDMS nasıl etkilediğini. Bu sonuçlar, ancak su, ve kan farklı özelliklere sahiptir. Bu yüzey işleme kan için ne anlama geldiği konusunda bir çalışma Pitts ve ark. (2012A) tarafından yapılmıştır.
Sonuçları burada sunulan için, mikroçip yüzeyler ve cam slaytlar onlar45 saniye için oksijenli plazmaya maruz kalan ve daha sonra sıkı bir kalıcı bir bağ ile sonuçlanan, her ikisi de bir arada basılı bağlanmıştır.
2. Kan Hazırlık
- Akredite bir tesis kan örnekleri toplayın. Örneğin domuz kan bir pıhtılaşma önleyici olarak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile birlikte kullanılabilir. Su 4 ml 'si ile 1 gr EDTA ekleyin ve yavaşça karıştırılarak 10x, tam kan, 1 L çözeltisi ekleyin.
Kan örnekleri kaldırmak istediğinizde, onları RT yavaş yavaş soğumasını bekleyin. Kan örnekleri taze ve ideal onlar kan reolojik özelliklerini korumak için toplanır gün kullanılan gerekir.
Örnekler oda sıcaklığında bir kez buzdolabında olabilir; antikoagülan olmadan ancak tam kan soğutma sonra kullanılamaz hale gelecektir. Antikoagülan bağlı olarak, en fazla 42 gün için eritrositler buzdolabında tutulabilir, ve tam kan 35 gün boyunca buzdolabında muhafaza edilebilir, ancak kirlenme olmayan bir m mümkün olacaktıredical tesisi 21.
Ayrıca, sığır veya domuz örnekleri ile toplama yöntemi dikkatli olun ve kemik iliği tarafından kirlenmesini önlemek.
- 10 dakika her zaman için 3.000 rpm'de 3x kan örnekleri santrifüj. İlk Santrifüj sonra, plazma ve buffy coat çıkarın atın. İlk plazma kaldırmak için genellikle en kolay, ve daha sonra tek başına buffy coat kaldırmak için daha sonra, atmak veya ileride kullanılmak üzere tutun.
Kana geri buffy coat karıştırmayın şekilde, yavaşça pipet tanıtmak. Buffy coat çıkardıktan sonra, fosfat yaklaşık 20 ml (PBS) tamponlu tuzlu su ve hafifçe recentrifuge karıştırın. Son adımı yineleyin. Üçüncü Santrifüj sonra, PBS ve kalan buffy coat çıkarın atın.
Bu kan toplayarak özelliklerini tutmak istiyorsanız yerine PBS yerli plazma kullanmak da mümkündür. Herhangi bir buffy coat veya beyaz karıştırmayın emin olunplazma içine kan hücreleri.
- Temizlenmiş kırmızı kan hücreleri (eritrositler) alın ve istenen konsantrasyonları (hematokrit) PBS veya plazma askıya. Bir mikrosantrifüj (CritSpin FisherSci, ABD) ile hematokrit kontrol edin.
10 ila 20% hematokrit kan 40 ya da% 50 (fizyolojik hematokrit) daha görselleştirmek için kolay olmalıdır. Mikro, kan genellikle makro sirkülasyon yarısı hematokrit, bu nedenle H = 20 15 yeterlidir.
- Kan numuneleri istenen konsantrasyonda izleme parçacıklar floresanlama ekleyin. Genel bir kural olarak önceden hesaplanabilir bir ilişki pencerede 10 parçacıklar sahip olmaktır.
Örneğin, partiküllerin 30 ul video tasvir ayarlama için kan solüsyonu, 1 ml ilave edilir. Alternatif olarak, kırmızı kan hücreleri kendilerini floresan etiketli olabilir.
- Ayrıca, su ve grip ile bir kalibrasyon çözüm yapmakparçacıklar orescing. Bu, bir Newton çözeltisi ile kalibre sistem için gerekli olacaktır.
Örneğin, 100 mikron ölçekte bir kanalı olan 10X objektif kullanarak, uygun bir konsantrasyon damıtılmış su, 15 ml ile karıştırılır parçacıkların 300 ul. Başka bir seçenek, kan makro viskozitesi daha yakın olan 3Cp, bir viskoziteye kadar damıtılmış su ile seyreltildi gliserol kullanmaktır.
3. μPIV Ölçümler
- Lazer güvenlik: sıcaklık ve nem kontrol edin. Uygun lazer güvenlik gözlükleri takın. Lazer perde kapatmak veya laboratuvar kapı maruz korunmaz engellemek için üzerine lazer işareti açın.
- Davis yazılımı ile Prosedür video gösterilir. Belirli bir sistemin kullanım kılavuzuna bakın daha fazla bilgi için.
- Veri çekmeden önce, kamera ölçekli bir mikrometre kullanılarak kalibre edilmesi gerekmektedir.
- Sistemin uygun azaltmak için, boru, en kısa sürede bir kullanımıD bir 15 ya da 50 ul Hamilton Gaz geçirmez şırınga gibi, mümkün olan en küçük katı şırınga. Sistem içine kan ya da hava emme sızmasını azaltmak için, şırınga ve çipe boru mühür. Bu tutkal, PDMS veya vazelin (kan kontamine için dikkatli olmak) ile yapılabilir.
Mikro şırınga hacmi genellikle doldurmak için hacimden çok daha az olduğu için, izleyici parçacıkları ile bezenmiş su ile mikro şırınga doldurmak için geri akış yöntemi.
Bizim akış yöntem, bir ikincil plastik şırınga kullanılarak kanalın çıkışı ile birlikte mikro şırınga ve kanalı doldurmak için oluşur. Tüm mikro kabarcıklar mikro şırınga, tüp ya da dışarı kadar bunun için, ilk olarak mikro şırınga piston kaldırmak, daha sonra kanalın çıkışına bağlı klasik plastik şırınga kullanılarak sıvı itme, mikro şırınga üzerinden sıvı akışı sağlar çip, son olarak piston geri koymak ve plastik şırınga çıkarın. O varlığımikro kabarcık r yokluğu bir mikroskop ile kontrol edilebilir.
- Yatay boru elde etmek için şırınga pompası Seviye. Istenen debi için şırınga pompası programlayın.
Rijit sistemi veya gerçek akış hızı değiştirmek sistemin uyum için "darboğaz etkisi", gibi olası geçici etkileri, farkında olun. Bir sistemin karakteristik zamanlar, sistemin malzeme ve boyutlarda bir fonksiyonu olarak tahmin edilebilir. (Bölüm 2, s 77-81, Tabeling, 2005)
- Mikroskop sahnede mikroçip yerleştirin ve pompa başlar. Orta hız profili için sistem kalibre ve dT (darbeli görüntüler arasındaki zaman) kalibre etmek için parçacıkları ile su kullanın.
Parçacıklar 11 için iyi bir korelasyon çerçeveler arasında 5 ila 10 piksel hareket etmelidir. Kalibre ederken, kanalın ortasında ölçmek için dikkatli olun. Ortasında odak düzlemi en yüksek olanhızı 8.
Yuvarlak bir kanal kullanıyorsanız, etkileri gölgeleme dikkatli olun.
Örnek bir görüntü En iyi görüntü ilk sinyalin ve alt görüntü ikinci darbe ise, darbeli bir kamera kullanılarak, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Bu parlak noktaları (floresan parçacıkların)-odak en olduğu şekilde görülebilir.
- İSTEĞE BAĞLI: farklı yüksekliklerde veri alarak bir 3D hız profili tek bir görüntü içine farklı vektörleri ekleyerek yeniden inşa edilebilir. Video sürecinin otomasyonu için geliştirilen bir rutin sunulur.
- Kan ile veri çekerken, su ile aynı yöntemle kan istenilen miktarda şırınga doldurun. Istenen debi için şırınga pompası programı ve istenen verileri almak. Elde edilen ham görüntüleri bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. De RBC sedimantasyon dikkatli olun. Şırınga doldurma her çalıştırma veya herdiğer çalışma eritrosit yerleşim azaltacaktır.
- Görüntüleri aldıktan sonra, çapraz korelasyon görüntüler arasında hız vektör alanları elde etmek için görüntü çiftleri üzerinde gerçekleştirilir. İyi bir ilişki için iyi görüntü olması önemlidir. Ilişkilendirerek önce, ön işleme arka plan gürültü kaldırmak için yapılabilir.
Çapraz korelasyon boyutu ve korelasyon etkileme şekli değiştirilebilir bitişik görsel pencereler arasında yapılır. Çapraz korelasyon sonra, görüntü işleme hatalı vektörler veya aykırı kaldırmak için yapılabilir.
Farklı seçenekler ve doğrulukları ayrıntılı bir açıklama Pitts ve ark bulunabilir. (2012b), kan için en iyi işleme pencere uzunluğunda uzatılmış ile "görüntü örtüşen" yöntemi bulundu ve akışı ile uyumlu nerede . Bu işlemler MATLAB gibi, ya da sistemi ile yazılım paketi içinde bir programda elle yapılabilir. yazılım önemli değil, işlemleri arkasında matematik daha önemlidir ve her işlem son hız profili doğruluğunu etkileyebilir.
Ortaya çıkan vektörleri ortalama, temsilcisi hız profili elde etmek için anlık hız profilleri elde, ve zaman içerisinde yeniden ortalama için kanal boyunca uzayda ortalama olabilir. Kloosterman ve arkadaşları. (2011) alan derinliğini büyük μPIV ölçümlerde hata bir açıklama. Burada sunulan veri işleme hata üzerine tartışmalar yüksek hızlı ölçümler için darbeli ölçümleri ve Chayer ve ark. (2012) için Pitts ve ark. (2012b) bulunabilir.
Hız profilleri örnekleri, Şekiller 3 ve 4'te gösterilmektedir. Şekil 3H de RBC 10 ul / saat akış merkez için tek bir hız profili, bir 140 mikron genişliğinde kanal = 10 sunulur.
çadır "> Bu tek bir profil bir hız profili almak için kanal boyunca ilişkili vektörleri ortalama elde, ve sonra bir temsilci ölçüm almak için zaman içinde ortalama olarak. Bu durumda, 100 çift görüş alanı genelinde sürede ortalaması alınmıştır.
30 ul / sa 'lik bir akış hızı ile programlanmış bir 100 mikron kare kanallı bir su akışı için kalibrasyon alınan 3D yeniden profilinin bir örneği Şekil 4' de bulunur. Şekil 4'te, profiller 1 mikron aralıklarla ölçülür.
- İSTEĞE BAĞLI: set-up tasvir yüksek hızlı görüntülerde geçiş kameralar (ve veri toplama sistemleri) ile aynı koşullar alınabilir. Bu kanal hücre içermeyen katman görselleştirmek için ve toplama miktarının belirlenmesi için yararlı olabilir. Veri analizi (Chayer ve ark., 2012) biraz daha farklıdır.
Ve RBC toplama olmadan beyaz ışık görüntü örnekleri prese olanH = 20, Şekil 5 nted. Üst görüntüleri agrega için eritrosit yeteneğini kaldırır PBS, H = 20 1 ul / saat de gösterir. Alt görüntü 0.5 ul / saat de yerli plazma H = 20'dir. Alt resimde, toplama görülebilir.
- Ölçümleri tamamlanmış zaman güvenli bir şekilde sistemini kapatın. Lazer güç kaynağı tamamen kapatılacak kadar uygun lazer güvenlik prosedürleri kullanın.