Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi
Bu makalede
Özet
Özet
Burada, etkili bir şekilde insan pluripotent kök hücreleri (PSC'ler) dan telencephalic glutamaterjik nöronlar üretmek için bir aşamalı prosedürü tarif edilmiştir. Farklılaştırma prosesi hücreler bir süspansiyon kültürü içinde yerleştirilmiş iken agregatlar oluşturması için yuvarlak kümeleri haline insan PSC'ler kırılma tarafından başlatılır. Agregalar sonra spontan farklılaşma sağlamak için günde 1-4 hESC ortamda yetiştirilen. Bu süre boyunca, hücreler üç germ tabakasından herhangi haline kapasitesine sahiptir. Günde 5-8, hücrelerin nöral soy içine itmek için bir nöral indüksiyon ortamı olarak yerleştirilir. Günde 8 civarında, hücreler 6 kuyucuğu üzerine takın ve hangi zaman nöroepitelyal hücrelerin formu sırasında ayırt etmek için izin verilir. Bunlar, nöroepitelyal hücreler 17. günde de izole edilebilir. Onlar lamelleri üzerine kaplama için hazır olana kadar hücreler daha sonra neurospheres olarak muhafaza edilebilir. Herhangi caudalizing faktörü olmadan bir temel ortam kullanılarak, nöroepitelyal hücreler specifie olansonra daha verimli dorsal telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları içine ayrılabilirler telencephalic öncüleri, içine d. Genel olarak, bizim sistem bu nöronların gelişimi ve onları etkileyen hastalıklar çalışma araştırmacılar için insan glutamaterjik nöronlar oluşturmak için bir araç sağlar.
Giriş
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreleri (PSC'ler), nöronlar 1-3 dahil olmak üzere vücuttaki her hücre tipi, oluşturmak için kapasitesine sahiptir. Insan PSC'ler çeşitli nöronal alt tipinin farklılaşması yönlendirilmiş rejeneratif tıpta bu hücrelerin uygulama için anahtar tutar. Geliştirme sırasında fonksiyonel nöronal subtiplerinin nesil nöral soyunun indüksiyon, rostro-kaudal ekseni boyunca bölgesel progenitörlerinin şartname ve 4,5 bölgesel öncü hücrelerden post-mitotik nöron tiplerinin farklılaşması içeren karmaşık bir süreçtir. 2001 yıl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. İnsan Pluripotent Kök Hücre Agrega Üretimi (D1-D4)
- İnsan pluripotent kök hücreleri temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile desteklenmiş HESC orta varlığında, fare embriyo fibroblast (MEF) besleyiciler üzerinde kültürlenmiştir. Kültür 5-7 gün sonra, koloniler büyük ama yine de ayrışmamış olduğunda, bir sonraki adım için hazırsınız.
- Enzim çözeltisi önce hazırlanmalıdır. Bir 50 ml tüp içinde, DMEM/F12 ortamı içine bir 1 mg / ml konsantrasyonda dispase (veya kollagenaz) çözülür. Isınmış iken bu çözümler en iyi şekilde karıştırmak için, 10-15 dakika için bir 37 ° C su banyosu içine orta ve enzim içeren tüp yerleştirmek ve sonra bir St....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, bir protokol çeşitli kritik adımlarda telencephalic glutamaterjik nöronlar içine insan PSC'ler farklılaştırmak için: PSC agregatların oluşumuyla, nöroepitelyal hücrelerin indüksiyonu, telencephalic progenitörlerinin nesil ve telencephalic nöronlar içine bu progenitörlerinin terminal farklılaşma (Şekil 1) vardır tarif edilmiştir. Bu sistem telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları nesil güçlü ve verimlidir. Bir örnek (Şekil 2) gibi, caudalizing faktörlerin ilavesi olma.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Nöral farklılaşma sürecinde çok kritik adımlar vardır. Aksi takdirde hücrelerin önceden nöronal olmayan soy olma yolunda önyargılı olabilir, çünkü insan PSC'ler pluripotent olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu, bu tür Oct4, Sox2, Nanog, ve Tic-1-60 olarak 1-3 pluripotency belirteçler karşı antikorlar ile insan PSC'ler lekeleme ile teyit edilebilir. İnsan PSC'ler onları pasajlanmasını sonra çok iyi ekleyiniz yoksa, ROCK inhibitörü (Y27632) yardım eklenebilir. Sistemde hücre pluripotent tutma zo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Yazarlar cömertçe FOXG1 antikor sağlamak için Dr Y. Sasai teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler (08-SCB-UCHC- 022 ve 11-SCB24) ve Spastik Parapleji Vakfı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco'nun F12 besin karışımı (DMEM/F12) ile modifiye edilmiş kartal ortamı | Gibco | 11330-032 | |
| Nakavt Serum İkame Edici | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamin (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Esansiyel Olmayan Amino Asitler | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt &# 8211; thanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Nörobazal ortam | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Poli-L-ornitin hidrobromür (poliornitin) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminin (insan) | Sigma | L-6274 | |
| Laminin (fare) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | İkizler | 100-106 | |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Kollajenaz | İnvitrojen | 17104-019 | |
| Accutase | Yenilikçi Hücre Teknolojiler | AT104 | |
| ROCK İnhibitörü | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | |
| Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2, bFGF) | İnvitrojen | 13256-029 | |
| Tripsin inhibitörü | Gibco | 17075 | |
| %0.1 jelatin | Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 antikoru | Dr. Y. Sasai | ||
| Hoxb4 antikoru (1:50) | Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 antikoru (1:5000) | Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 antikoru (1:200) | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 antikoru (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| vGLUT1 antikoru (1:100) | Sinaptik Sistemler | 135302 | |
| Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Glial türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| İnsülin büyüme faktörü 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| Döngüsel AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Sonik kirpi (SHH) | R& D | 1845-SH | |
| 50 ml tüpler | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| 15 ml tüpler | BD | 352097 | |
| 6 oyuklu plakalar | BD | 353046 | |
| 24 kuyucuklu plakalar | BD | 353047 | |
| T25 şişeleri (işlenmemiş) | BD | 353009 | |
| T75 şişeleri (işlenmemiş) | BD | 353133 | |
| Lameller | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 6 cm Petri kapları | BD | 353004 | |
| 9'' cam pipetler | Fisher | 13-678-20D | |
| Steriflip filtreler (0.22 μ M) | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup filtreleri 1.000 ml (0.22 μ M) | Millipore SCGPU10RE | ||
| Faz kontrast mikroskobu (Observer A1) | Zeiss | R2625 | |
| Karbondioksit inkübatörü (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| Biyogüvenlik başlığı (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | ||
| Santrifüj (5702 R) | Eppendorf |
Kaynaklar
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
