Method Article

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

DOI:

10.3791/50321

⸱

April 14th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, etkili bir şekilde insan pluripotent kök hücreleri (PSC'ler) dan telencephalic glutamaterjik nöronlar üretmek için bir aşamalı prosedürü tarif edilmiştir. Farklılaştırma prosesi hücreler bir süspansiyon kültürü içinde yerleştirilmiş iken agregatlar oluşturması için yuvarlak kümeleri haline insan PSC'ler kırılma tarafından başlatılır. Agregalar sonra spontan farklılaşma sağlamak için günde 1-4 hESC ortamda yetiştirilen. Bu süre boyunca, hücreler üç germ tabakasından herhangi haline kapasitesine sahiptir. Günde 5-8, hücrelerin nöral soy içine itmek için bir nöral indüksiyon ortamı olarak yerleştirilir. Günde 8 civarında, hücreler 6 kuyucuğu üzerine takın ve hangi zaman nöroepitelyal hücrelerin formu sırasında ayırt etmek için izin verilir. Bunlar, nöroepitelyal hücreler 17. günde de izole edilebilir. Onlar lamelleri üzerine kaplama için hazır olana kadar hücreler daha sonra neurospheres olarak muhafaza edilebilir. Herhangi caudalizing faktörü olmadan bir temel ortam kullanılarak, nöroepitelyal hücreler specifie olansonra daha verimli dorsal telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları içine ayrılabilirler telencephalic öncüleri, içine d. Genel olarak, bizim sistem bu nöronların gelişimi ve onları etkileyen hastalıklar çalışma araştırmacılar için insan glutamaterjik nöronlar oluşturmak için bir araç sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreleri (PSC'ler), nöronlar 1-3 dahil olmak üzere vücuttaki her hücre tipi, oluşturmak için kapasitesine sahiptir. Insan PSC'ler çeşitli nöronal alt tipinin farklılaşması yönlendirilmiş rejeneratif tıpta bu hücrelerin uygulama için anahtar tutar. Geliştirme sırasında fonksiyonel nöronal subtiplerinin nesil nöral soyunun indüksiyon, rostro-kaudal ekseni boyunca bölgesel progenitörlerinin şartname ve 4,5 bölgesel öncü hücrelerden post-mitotik nöron tiplerinin farklılaşması içeren karmaşık bir süreçtir. 2001 yıl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İnsan Pluripotent Kök Hücre Agrega Üretimi (D1-D4)

  1. İnsan pluripotent kök hücreleri temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile desteklenmiş HESC orta varlığında, fare embriyo fibroblast (MEF) besleyiciler üzerinde kültürlenmiştir. Kültür 5-7 gün sonra, koloniler büyük ama yine de ayrışmamış olduğunda, bir sonraki adım için hazırsınız.
  2. Enzim çözeltisi önce hazırlanmalıdır. Bir 50 ml tüp içinde, DMEM/F12 ortamı içine bir 1 mg / ml konsantrasyonda dispase (veya kollagenaz) çözülür. Isınmış iken bu çözümler en iyi şekilde karıştırmak için, 10-15 dakika için bir 37 ° C su banyosu içine orta ve enzim içeren tüp yerleştirmek ve sonra bir St....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir protokol çeşitli kritik adımlarda telencephalic glutamaterjik nöronlar içine insan PSC'ler farklılaştırmak için: PSC agregatların oluşumuyla, nöroepitelyal hücrelerin indüksiyonu, telencephalic progenitörlerinin nesil ve telencephalic nöronlar içine bu progenitörlerinin terminal farklılaşma (Şekil 1) vardır tarif edilmiştir. Bu sistem telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları nesil güçlü ve verimlidir. Bir örnek (Şekil 2) gibi, caudalizing faktörlerin ilavesi olmadan .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral farklılaşma sürecinde çok kritik adımlar vardır. Aksi takdirde hücrelerin önceden nöronal olmayan soy olma yolunda önyargılı olabilir, çünkü insan PSC'ler pluripotent olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu, bu tür Oct4, Sox2, Nanog, ve Tic-1-60 olarak 1-3 pluripotency belirteçler karşı antikorlar ile insan PSC'ler lekeleme ile teyit edilebilir. İnsan PSC'ler onları pasajlanmasını sonra çok iyi ekleyiniz yoksa, ROCK inhibitörü (Y27632) yardım eklenebilir. Sistemde hücre pluripotent tutma zo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar cömertçe FOXG1 antikor sağlamak için Dr Y. Sasai teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler (08-SCB-UCHC- 022 ve 11-SCB24) ve Spastik Parapleji Vakfı tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco'nun F12 besin karışımı (DMEM/F12) ile modifiye edilmiş kartal ortamıGibco11330-032
Nakavt Serum İkame EdiciGibco10828-028
L-glutamin (200 mM)Gibco25030
Esansiyel Olmayan Amino AsitlerGibco1140-050
2-Mercapt &# 8211; thanol (14.3 M)SigmaM-7522
Nörobazal ortamGibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
HeparinSigmaH3149
Poli-L-ornitin hidrobromür (poliornitin)Sigma116K5103
Laminin (insan)SigmaL-6274
Laminin (fare)Invitrogen23017-015
FBSİkizler100-106
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
Kollajenazİnvitrojen17104-019
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojilerAT104
ROCK İnhibitörüStemgent04-0012
SB431542Stemgent04-0010
DorsomorphinStemgent04-0024
Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2, bFGF)İnvitrojen13256-029
Tripsin inhibitörüGibco17075
%0.1 jelatinMilliporeES-006-B
Foxg1 antikoruDr. Y. Sasai
Hoxb4 antikoru (1:50)Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma BankI12
Pax6 antikoru (1:5000)Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma BankPAX6
Nkx2.1 antikoru (1:200)ChemiconMAB5460
Tbr1 antikoru (1:2000)ChemiconAB9616
vGLUT1 antikoru (1:100)Sinaptik Sistemler135302
Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)PrepoTech Inc.450-02
Glial türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF)PrepoTech Inc.450-10
İnsülin büyüme faktörü 1 (IGF1)PrepoTech Inc.100-11
Döngüsel AMP (cAMP)SigmaD-0260
Sonik kirpi (SHH)R& D1845-SH
50 ml tüplerBecton Dickinson (BD)352098
15 ml tüplerBD352097
6 oyuklu plakalarBD353046
24 kuyucuklu plakalarBD353047
T25 şişeleri (işlenmemiş)BD353009
T75 şişeleri (işlenmemiş)BD353133
LamellerChemiglass Life Sciences1760-012
6 cm Petri kaplarıBD353004
9'' cam pipetlerFisher13-678-20D
Steriflip filtreler (0.22 μ M)MilliporeSCGP00525
Stericup filtreleri 1.000 ml (0.22 μ M)Millipore SCGPU10RE
Faz kontrast mikroskobu (Observer A1)ZeissR2625
Karbondioksit inkübatörü (Hera Cell 150)Thermo Electron Corporation
Biyogüvenlik başlığı (Sterilgard III Advance)The Baker Company
Santrifüj (5702 R)Eppendorf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telencephalic Glutamatergic NeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Induction MediumNeuroepithelial CellsNeurosphere FormationGlutamatergic Neuron DifferentiationFoxG1 ExpressionTBR1 MarkerVGLUT1 ExpressionImmunostaining Analysis

Related Articles