Entegre mikroakışkan termoplastik çip bir moleküler tanı olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Çip nükleik asit ekstraksiyon, ters transkriptaz ve PCR gerçekleştirir. Imalatı ve yonga çalıştırmak için yöntemler tarif edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Hızlı ve etkili bir teşhis etkili hasta yönetimi ve tedavi sağlayarak bulaşıcı hastalık kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, hastanın nazofarengeal (NP) bezlerden ve aspirat olarak influenza A virusu yükseltmek için yeteneği ile entegre bir mikroakışkan termoplastik çip sunuyoruz. Hasta örneği yükleme üzerine, mikroakışkan cihaz sırayla, on-chip hücre parçalama, RNA saflaştırılması ve katı faz ekstraksiyonu (SPE), ters transkripsiyon (RT) ve RT-PCR odalarına polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) içindeki konsantrasyonu adımları yürütmektedir sırasıyla. Bitiş noktası algılama bir off-çip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kullanılarak yapılır. İki ince film ısıtıcılar RT ve PCR odaları için ısı kaynağı olarak kullanılabilir iken çevre için, biz, reaktif ve numune sürücü tek bir şırınga pompası kullanılır. Yonga fabricati azaltmak için yüksek kapasiteli imalatı için tek tabaka ile uygun olacak şekilde tasarlanmıştırzaman ve maliyet. Mikroakışkan çip ilgi yeni patojenlerin saptanması için gerekli reaktif tasarım değişiklikleri ile sınırlıdır virüs ve bakterilerin geniş bir yelpazede, analiz için bir platform sağlar.
Giriş
Ölümlerin Milyonlarca 20. yüzyılın 1. üç influenza pandemisi sırasında bildirilmiştir. Ayrıca, en son grip salgını 2009 yılında Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2 tarafından ilan edildi, ve 1 Ağustos 2010 arasında, 18.449 ölüm DSÖ 3 tarafından rapor edilmiştir. Bu salgın yine bulaşıcı hastalıkların yüksek yük ve hızlı hastalığın teyidi, uygun halk sağlığı yanıtı ve etkili tedavi 4 etkinleştirmek için grip hızlı ve doğru algılanması için ihtiyaç göstermiştir.
Yaygın influenza teşhisi için kullanılan birkaç yöntem vardır, bu hızlı immunoassay, direkt floresan antijen testi (DFA) ve viral kültür yöntemleri içerir. Diğer iki yöntem emek-yoğun ve 9 zaman alıcı iken Hızlı immunoassay dramatik, hassasiyet 5-8 yoksundur. Moleküler testler kısa bir geri dönüş süresine, yüksek sensit dahil birçok avantajlar sunarivity ve spesifitesi yüksek. Çeşitli ticari kuruluşlar bulaşıcı hastalıklar için hızlı moleküler testler (ayrıca nükleik asit testleri veya NAT olarak adlandırılır) doğru çalışıyor olması ve birkaç kendi hatlarında grip deneyleri var. Ancak çoğu çip dışı numune hazırlama gerektirir. Moleküler testler test kartuşu veya modülün içine numune hazırlama dahil feragat Klinik Laboratuar Geliştirme Değişiklikleri (CLIA) Yok.
Lab-on-a-çip teknolojisi noktası bakım test cihazları gelişiminde önemli bir rol oynar. 1993 10 yılında ilk PCR çip girişten sonra, çeşitli girişimlere nükleik asit testi cips gelişmekte girmiştir. Ancak, bunlardan sadece birkaç aşağı amplifikasyon ile entegre ham numune hazırlama var.
Biz daha önce bir plastik mikroakışkan çip 11 içine bir katı faz ekstraksiyonu sütun (SPE) ve minyatür gösterdi ve geliştirmek varsürekli bir akış PCR çip 12 Ment ve optimizasyonu. Burada, klinik teşhis için tek bir yonga içine RT ve PCR adımlarla SPE entegre ve hasta nazofaringeal (NP) bezlerden ve aspirat nükleik asitlerin yükseltmek için kapasitesini göstermek için önceki çalışmaları genişletmek.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Chip Fabrikasyon 12
- Zeonex 690R pelet iki plaklar edin: 5 dakika süreyle 198 ° C'de ısıtılmış pres üzerine bir metal plaka, ön ısıtma merkezinde eşit olarak 8-9 gram Zeonex granül, dağıtılması ve daha sonra başka bir 5 dakika boyunca yavaş yavaş 2,500 psi basınç uygulanır. Bu adımı tamamlamak için, biz bir Carver sıcak pres kullanılmıştır.
- Epoksi kalıp ile plak mikroakışkan kanal Emboss. Kalıp imalatı ile ilgili ayrıntılar başka 12 (Şekil 2b kanal dizaynı) özetlenmiştir: epoksi kalıp üzerine bir plak koydu, sonra 157 de ısıtılmış basın üzerinde ön ısıtma onları ° 10 dk için C ve başka bir 10 dakika süreyle yavaş 1,000 psi basınç uygulayın . Elle kalıptan plak Kaldır veya soğuyuncaya önce bir maşa kullanarak. (Not: Bu adım sırasında termal eldiven giyin.)
- Giriş, atık bağlantı noktası ve mikroakışkan kanal çıkışındaki kabartmalı çip içinde delik delin. Biz 1.25 mm çap kullanılırüç delik yapmak için matkap ucu etre.
- Bond başka bir plak (üstte) ile kabartmalı çip:; diğeri için 350 psi basın 10 dakika süreyle 131 ° C'de ısıtılmış basına Hava kuru ve ön ısıtma onları ve IPA, RNAse Deplasman ve sırayla deiyonize su ile cips yıkayın 10 dk.
- Girişi, atık ve ayrı JB Weld Epoxy kullanarak çıkış limanlarında Nanoports takın; üreticinin talimatlarına göre 15 ila 24 saat boyunca tedavi.
- 100 ul nükleaz ücretsiz su ile izlenen 50 ul RNAse takım ile SPE kanal, durulayın.
- Aşılama çözeltisi (% 3 w / v benzofenon ile metil metakrilat) 4 ul SPE kanal yerleştirin ve daha sonra 365 nm dalga boyu UV ve 2.000 mJ / cm 2 UV altında bir fırın içinde 10 dakika süreyle kuluçkaya alarak metakrilat çapraz bağlar. Vakum ile rezidüel greftleme çözüm çıkarın. Bu duvar vakum kullanılır. En iyi sonuçlar için, taze bir çözüm kullanılmalıdır. Genellikle kabul edilebilir, ancak, bir depolamak içinbir haftaya kadar 4 ° C 'de hazırlanan çözelti.
- % 16 etilen dimetakrilat,% 24 oranında bütil metakrilat,% 42 1-dodecanol,% 18 sikloheksanol,% 1 2-dimetilamino-4-(metil-fenilamino)-fenol ekleyin: SPE kolon çözeltisi (her v / v%) yapmak foto-başlatıcı olarak.
- SPE kolon solüsyonu (1:1 'lik bir karışım yapmak için) olarak silis mikrosferler çözelti aynı hacimde çıkar, ve tamamen ° C'da gece boyunca bir vakumlu fırın içinde 70 kurutun. Kapak kapalıyken tüp dokunarak pelet kadar Break. Kuru silika mikroküre tüp ve karıştırmak için girdap içine SPE kolonundan çözüm ekleyin.
- Aynı kanal içine SPE çözümü 4 ul yükleyin ve sonra 2,5 dakika UV ışını tarafından çapraz. Sonra, fazla fiş çevirmek ve başka 2,5 dakika için ışın. Polimerize SPE kolonundan bir opak beyaz katı olmalıdır.
- Fazla reaktifler uzak durulama için% 100 metanol 500 ul ile kanal yıkayın. Bu yıkama da intra-polimer po kaldırırçevre koşulları ve kurutulduğunda rogenic çözücüler, böylece SPE sütun gözenekli bir yapı oluşturmaktır.
- Termal olarak iletken bant ile çip altına iki ince-film ısıtıcılar takın. Isıtıcıların taraf denatürasyon ve (bkz. Şekil 1) ayrı tavlama için geniş kanal kenarı ile uyumlu hale getirilmesi gerekmektedir.
- Ölü aracılığıyla çip içine yerleştirin beş termokupl her çipin açık yan kanallar (Şekil 2b bakın) sona erdi. Termokupl basın uyum yoluyla bu kanallar içinde kalmak. Bant daha termokupl yerini düzeltmek için kullanıldı.
2. Katı Faz Ekstraksiyonu Metodu
- DEPC işlenmiş ve otoklava su (deiyonize veya Millipore-filtre) ile% 70 etanol 96 ul hazırlayın.
- 25X RNA ekleme 4 ul bir tüp içinde% 70 etanol ile ve 96 ul, güvenli ve bir ayrı tüp içinde% 100 etanol ile aynı karışım çoğaltmak için kullanılır.
- 300 hazırlayınAşağıdaki karıştırma ile kanal tampon ul: 6 M guanidin tiyosiyanat (GuSCN), 2-propanol ve 150 ul, nükleaz serbest su 63 ul, ve güvenli 25X RNA'nın 12 ul of 75 ul.
- 6 M GuSCN, 2-propanol ve 200 ul, güvenli ve 12 ul 25X RNA, 100 ul: karıştırma ile lizis tamponu 312 ul hazırlayın.
- RNA Güvenli aktive etmek için 10-20 dk için 60 ° C sıcaklıkta% 70 etanol ile ısıtılır,% 100 etanol, kanal tampon ve lizis tamponu.
- Mikroakışkan kanal dengelemek için, 0.8 ml / saat 'lik bir akış hızında SPE kanalı ile kanalın tampon çalıştırın.
- Su banyosunda 37 ° C'de VTM içinde test örneği Hızlı çözülme, ve kısa sürede çözülmüş gibi su banyosundan hemen örneği kaldırmak.
- 10 dakika için 13,000 rpm'de santrifüje örnek, ve lizis tamponu içine 300 ul süpernatant 100 ul aktarın. 1 ug / ml 'den taşıyıcı RNA 6 ul ilave edilerek karışım doldurun.
- Karıştırmak için Vortex, ve spin sonrası5 saniye, bir Luer-lok 1 cc şırınga içine tüm lizat yükleyin.
- 0.8 'lik bir akış hızında SPE kanalı ile lizat çalıştırma ml / sa.
- 1 ml / saatte 100 ul of100% etanol, ardından% 70 etanol ile 100 ul ile SPE kanal, yıkayın. (Dışarı itti almazsınız şırınga ucu bir 50 ul ölü hacim var, bu yüzden aslında sadece 50 ul kanalı geçiyor.)
- 0.5 ml işareti boş bir şırınga yerleştirin ve 1 kurumaya kanalından hava itmek ml / saat.
- 0.5 Bağımlı nükleik asitlerin Zehir ml / saat ve atık limanda nanoport 13.5 ul toplamak kanalıyla nükleaz ücretsiz su 67.5 ul çalıştırın. (Sıvı kaybı enjektör ucu ve SPE kanal içinde 54 ul ölü hacim nedeniyle).
3. RT-PCR
- Bir Qiagen OneStep RT-PCR kitleri reaktifleri kullanılarak hava kuru adım (2.12) sırasında RT-PCR master miks 36.5 ul hazırlayın.
- RT-PC yükleyinR atık limanda nanoport olarak reaktif ve RNA ile karışım takip eden 50 ul RT-PCR tepkimesinde elde etmek için: nükleaz serbest su, 4 ul RT-PCR enzim karışımı, 10 ul Q çözelti, 10 μl1X bir 13.5 ul yıkandı, RNA Adım tampon, 2 ul 25 mM MgCl2, 1 ul 50 uM ileri primeri 5'-GAC CRA TGT TCC CAC TGA C CTC-3 ', 1 ul 50 uM ters primerler 5'-GCA AGG TTY TGG ACA AAK CGT-3 CTA ', 2 ul dNTP, 0.75 ul% 1.0 w / v BSA, 0.73 ul PEG8000 ve 5.02 ul nükleaz serbest su.
- Hafif vakum ile RT kanal (biz duvar vakum kullanılır) içine RT-PCR karışımı yükleyin ve kapalı bir montaj ile Nanoport mühür.
- Isıtıcı 1 35 V uygulayın. Isıtıcı 1 50 ° C'de equilibrates sonra 30 dakika için RT kanal içinde reaktiflerin tutun 95 ısıtma tertibatından 1 çıkan equilibrates 15 dakika sonra ° C'de için RT kanal içinde reaktiflerin tutun
- Isıtıcı 1 ve ısıtıcı 2 ila 50 V 27 V uygulayın, 60 ve de az üç dakika ya da ısıtıcı 1 equilibrates kadar bekleying; C ve ısıtıcı 2 95 equilibrates ° C
- 0.5 ul / dk 'PCR kanal içine reaktifleri bastırın. Reaktifler serpantin kanalı akmaya için yaklaşık 20 dakika sürer.
- Örnek serpantin kanalın sonuna kadar ettiği gibi, uygun boyutta bir pipet ucu kullanılarak ve çıkışındaki PCR ürünleri toplamak.
4. PCR Ürünleri Algılama
- Biz ürünleri tespit etmek için Agilent Yüksek Hassasiyet DNA testi kullanın. Bu test buzdolabından test etmeden önce 30 dakika Agilent Yüksek Hassasiyet DNA Kiti almak çalıştırmak için.
- Bioanalyzer açın ve 2100 Uzman yazılımını açın.
- Test içine PCR ürünlerinin 1 ul yükleyin ve Agilent protokolü (takip http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- Analiz ve veri kaydedebilirsiniz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tipik bir sonuç, bir grip A enfekte nazofarenks yıkama örnek için Şekil 3'te de gösterilmiştir. Her bir hasta örneği olarak grip virüsünün farklı miktarlarda nedeniyle, PCR ürününün nihai konsantrasyon olarak değişecektir. İyi bir sonuç düşük gürültü, iki açık merdiveni tepe (35 ve 10380 bp) ve pozitif numune için tasarlanan ürün boyutu (107 bp) tek bir ürün tepe değeri olmalıdır. Ürün pik teorik negatif kontroller için devamsızlık olması gerekirken, bazı örneklerde astar-dimer oluşumu gribi ö...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tanı yöntemi yüksek özgüllük ve düşük algılama sınırı ile hasta örneklerinde, influenza A RNA yükseltmek için entegre bir mikroakışkan plastik çipin yeteneği göstermiştir Burada sunulan 13 Biz bakım test potansiyeli noktası için bu çip tasarlanmıştır:. (A) sıcaklık ve akışkan kontrol basitleştirilmiştir, (b) yonga düşük maliyet ve enjeksiyon kalıplama kullanılarak yüksek akış üretim için uygun olan ve (c) yonga ve böylece numune çapraz kirlenmenin azaltılması endişe, atılabilir ve bir seferlik kullanım için t...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının ilan ettiler.
Teşekkürler
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01 EB008268 tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif / Malzeme Adı | Şirket | Katalog Numarası | |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimetoksi-2-fenilasetofenon | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 19516 | |
| Benzofenon | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, Pensilvanya | A7979-50ML | |
| Bütil metakrilat | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 235865-100 mL | |
| Taşıyıcı RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Sikloheksanol | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 105899-1L | |
| Etanol | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | E7023 | |
| Etilen dimetakrilat | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 335861 | |
| Etilen glikol dimetakrilat | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 335681-100ML | |
| Cam şırınga 250 ul | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidin tiyosiyanat | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 50981 | |
| Yüksek Hassasiyet DNA Kiti | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Sıcak pres | Carver, Wabash, IN | 4386 | |
| JB Weld Epoksiler | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok şırıngalar | BD-Tıbbi, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnezyum Klorür | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, Pensilvanya | AB-0359 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 494437 | |
| Metil metakrilat | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Bilimsel | N-333-01 | |
| Nanoport Montaj | Upchurch Bilimsel | F-120x | |
| Nükleaz ücretsiz su | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, Pensilvanya | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kiti | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 41009 | |
| Güç kaynağı | VWR, Radnor, PA | 300V | |
| Deplasman RNAse | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silika mikroküreler | Polysciences, Warrington, PA | 24324-15 | |
| Şırınga pompası | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Termal İletken Bant | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Isıl çift | Omega Mühendislik, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| İnce film Isıtıcılar | Minco, Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviyole Çapraz Bağlayıcı | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Kimyasallar, Louisville, KY | 690R |
Kaynaklar
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176(2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
