Yöntem makalesi

Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak Murine Direnç Arter Fonksiyon değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/50328

⸱

7 Haziran 2013

 , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research, Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi olarak, bir geminin bir sağlam küçük bir bölümü iki küçük kanüller üzerine monte edilir ve uygun bir lümen basınca basınçlandırılmıştır. Burada, fare 3 vasorelaxation tepki ölçmek için yöntem tarif Rd için mezenterik arterler 1 - / - Basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak fareler.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basınç myograph sistemleri, küçük arterlerin fonksiyonel değerlendirilmesinde zarif yararlıdır uygun bir transmural basınç basınç uygulanır. Basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi elde Yakın fizyolojik durum vasküler yatağın in vivo davranış için çıkarım olabilir farmakolojik ve fizyolojik uyaranlara, içsel yanıtları derinlemesine karakterizasyonu izin verir. Basınç myograph geleneksel tel myographs üzerinde birçok avantajı vardır. Örneğin, küçük direnç damarları sıkı kontrol ve fizyolojik ilgili lümen içi basınçta incelenebilir. Burada, asetilkolin yanıt olarak vazo-dinlenmek için fenilefrin ile preconstricted 3. amacıyla mezenterik arter (uzun 3-4 mm),, kabiliyeti çalışma. Mezenterik arter 60 mmHg'lik sabit bir basınçta muhafaza edilen bir basınçlı ve kapalı sistem bağlı iki kanül üzerine monte edilmiştir. Damar lümeni ve dış çapı vardır continuousinsi sırasıyla, fenilefrin ve asetilkolin yanıt olarak vazokonstriksiyon ve vasorelaxation gerçek zamanlı kantitatif sağlayan bir video kamera kullanılarak kaydedildi.

Kardiyovasküler hastalık etiyolojisinde çalışma basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi uygulanabilirliğini göstermek için, sistemik hipertansiyon bir fare modelinde endotel bağımlı vasküler fonksiyonu değerlendirildi. Çözünebilir guanilat siklaz (- / - sGCα 1) arasında α alt birimi 1 eksikliği farenin zaman 129S6 (S6), arka plan (sGCα -/-S6 1) üzerine, hipertansiyon, ancak zaman bir C57BL / 6 (B6), arka (sGCα üzerine 1 -/-B6). Basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak, göstermektedir ki engelli endotel bağımlı vasorelaxation in sGCα 1-eksikliği sonuçları. Vasküler disfonksiyon sGCα 1 daha sGCα 1 -/-S6 daha belirgindir -/-B6 fareler, muhtemelen katkınınsGCα 1 -/-B6 farelerde daha sGCα 1 -/-S6 en yüksek kan basıncına ng.

Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi böylece kalp-damar hastalığı altında yatan mekanizmaları içine bizim fikir artırmada, damar kasılma ve gevşeme çeşitli uyaranların etkisini değerlendirmek için kullanılabilecek nispeten basit, ama hassas ve mekanik olarak yararlı bir tekniktir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basınç myograph sistemleri küçük arterler, damarlar ve diğer gemilerin fizyolojik fonksiyonu ve özellikleri ölçmek için kullanılır. Bir damar veya damar bozulmamış bir küçük bir kısmı, iki küçük cam kanül üzerine monte edilmiş ve kabın in vivo özellikleri (Şekiller 1 ve 2) 'deki en korumasına izin verir, uygun bir lümen basınca kadar basınçlı hale getirilir. Bir basınç myograph yakın fizyolojik durumu izole damarlarının yapısal özellikleri (örneğin miyojenik sesi) soruşturma izin, vasküler yatağın in vivo davranış yansıtır. Kas kasılması bir güç dönüştürücü 1 doğrudan mekanik bağlantı ile değerlendirilir tel kasılmaların kâğıda çizilmesi, üzerinde baskı kasılmaların kâğıda çizilmesi avantajlarından bazıları, ise damar sisteminde geliştirilen genel direnci tanımlamak mikro direnci arterler, okudu olabilir (i) tel Myograph büyük boru damar sertliği, (ii) t sınırlıdırhiçbir teller (iii) geminin doğal şekline daha iyi muhafaza edilmesi, damar lümene gereken beri endotel zarar şapka riski azalır, ve (iv) bu gemi boyutu geniş bir de incelenebilir baskılar veya kayma gerilmesi 2.

Küçük damarların incelenmesi hipertansiyon gibi kardiyovasküler hastalıklarda değişmiş vasküler sesi katkıda patofizyolojisi ve moleküler mekanizmaları anlamak için daha büyük kanal arterler okuyan daha bilgilendirici olabilir. Örneğin, 8 hafta boyunca fareler yüksek yağlı diyet beslenme ile ilişkili endotelyal fonksiyon bozukluğu ancak aort halkaları 2. dereceden mezenterik arterler 3 (Şekil 3) gösterilmiştir olabilir. Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi başka bir avantajı da, basınçlı kabın iç miyojenik daralma mevcut olmasıdır, ve bu olay da endotele rolü ve fonksiyonu incelenmiştir edilebilir. Burada, Descrengelli nitrik oksit (NO)-cGMP sinyal bir ortamda fare mezenterik 3. amacıyla direnci arterlerin vasküler reaktivite incelemek için bir basınç myograph bir kullanımı IBE.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Çözüm hazırlanması

  1. 500X EDTA stok: 500 mg EDTA-Na 2 • 2H 2 O ağırlığında ve 50 ml deiyonize suda çözülür. Oda sıcaklığında saklayın.
  2. KCl çözeltisi depolarizan.
    1. 3.69 g NaCl, 18.64 g KCl, 0.36 g MgSO 4 susuz, 0.41 g KH 2 PO 4, 0.46 g CaCl2 • 2H 2 O: K10X stok solüsyonu hazırlayın 250 ml deiyonize su içinde çözülür. Oda sıcaklığında saklayın.
    2. 100 ml son KCI çözeltisi 1X depolarize için: 0.21 NaHCO3, 90 ml deiyonize su içinde 0.18 g glikoz çözülür. K10X stok solüsyonu 10 ml ilave edilir. 500X EDTA çözeltisi 95 ul ekle. İyice karıştırın. 4 ° C'de saklayın Bir hafta içinde kullanın.
  3. Deney günü (1 litre için) taze HEPES-PSS çözüm hazırlayın.
    1. 6.96 g NaCl, 0.35 g KCl, 0.288 g MgSO 4 • 7H 2 O, 0,1605 g KH 2 PO 4, 2.38 g HEPES. 100 ml suda çözülüriyonu giderilmiş su. Balon A. olarak işaretle
    2. 0.312 g CaCl2 • 2H 2 O 100 ml deiyonize su içinde çözülür. Balon B. olarak işaretle
    3. 1.25 g NaHCO3, 0.991 g glikoz. 98 ml deiyonize su içinde çözülür. Şişesi C olarak işaretle
  4. Şişesi C. büyük bir şişede 700 ml deiyonize su Take 500X EDTA 2 ml ekleyin. Sürekli vorteks ile büyük şişe içinde şişesi A, B ve C içeriği dökün. NaOH ile pH'ı 7.4 'e ayarlayın.

2. Uyuşturucu kullanılmış

  1. Fenilefrin (10 -2 M), 10 ml deiyonize su içinde 20.37 mg çözülür. -80 Kısım 1 ml ve mağaza ° C Seri deney gününde 10 -3 10, -4, -5 10 ve 10 -6 mol / L elde etmek için seyreltilir.
  2. Asetilkolin (10 -2 M), 10 ml deiyonize su içinde 18.17 mg çözülür. -80 Kısım 1 ml ve mağaza ° C Seri 10 -3, 10 -4, 10 -5 ve 10 -6 elde etmek için sulandırmakmol / deney gününde L.

3. Fareler

Erkek WT ve sGCα 1 - / - S6 ve B6 zemin üzerine fareler bu çalışma boyunca incelendi. SGCα 1 - / - 4,5 önceden tarif edildiği gibi oluşturulmuştur. Konut ve deney hayvanlarında (fare) ile ilgili prosedürler Massachusetts Genel Hastanesi, Boston, MA Araştırma Hayvan Bakım Alt Komitesi tarafından onaylanmıştır.

4. Mezenterik Arter Vasküler Reaktivite ölçümü

  1. Ile fareler euthanize pentobarbital (200 mg / kg, ip). Karın boşluğu açın ve mezenterik doku teşrih. Izole ve bağ ve yağ dokusu serbest 3. düzenin bir mezenterik arter incelemek ve buz-soğuk HEPES-PSS% 95 O 2 /% 5 15 dakika için CO 2 ile önceden dengelenmiş çözüm. Arter yerleştirin Hiçbir mezenterik dallanma ile 2-3 mm uzunluğunda halkalar kesinarter. Damarlarda kan olduğunda mikro damarları düzeyde arter ve venler arasında ayırım problemlidir. Onu dışarı diseksiyon önce hala hayvan sağlam iken Bu nedenle, geminin belirlenmesi tavsiye ederiz.
  2. Giriş ve çıkış vanaları ile 10 ml şırınga yardımı ile HEPES-PSS çözümü ile basınç myograph odası (DMT Model 110P ve 11P sürümü 1.31, Şekil 2) cam kanüller doldurun. Aşırı basınç kanüller bağlı kırılgan dönüştürücü zarar gibi kanül Dolum nazikçe ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Doldurduktan sonra kanül sıkı giriş ve çıkış vanaları hem kapatın.
  3. Sağ kanül üzerine geminin bir ucunu monte edin ve dikkatle naylon sütür biri ince iplikçik ile kravat. , Bir şırınga yardımı ile, temizleme ve giriş valfi ile Hepes çözeltisi ile kabın doldurun. Yakın damar için sol kanül getirmek ve bunun üzerine teknenin diğer ucu monte edilir. Naylon sütür ile kravat. Doldurmakodasını HEPES çözeltisi ile 10 ml'ye ile. Hafifçe bir şırınga yardımı ile giriş valfi ile HEPES çözüm iterek sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
  4. Myograph ve video kamera altında odası takın. Odacığın içinde oksijen ve ısı (37 ° C) olmalıdır. Valfi kapalı iken, birinci HEPES çözeltisi haznesindeki tüp P1 giriş valfi bağlayın. Tüp içinde hava kabarcığı kalmayıncaya kadar tüp aracılığıyla herhangi bir kabarcık ve çözüm geçmesine izin. Vanasını açın.
  5. Tüp P2 basınç regülatörü gelen ile odasının sol valfi bağlayın. Kabarcıkları için tekrar kontrol edin. Tüm sistemi herhangi bir kabarcıkları veya sızıntı olmamalıdır.
  6. Myo-arayüzü panelinde veya yazılım içindeki basınç menüsüne gidin ve akış KAPALI açarken pompa açın.
  7. Programı açın ve TOPLA tıklayın. Gemi artık ekran (Şekil 3) üzerinde görülmelidir. Geminin audiomonitoring sağlayan bir mikroskop üzerine monte bir kamera ile görüntülenmiştirng ve damar lümen, damar çapı ve duvar kalınlığı analizi.
  8. Yavaş yavaş myo-arayüzü panelinde veya program P1 basıncı seçerek P1 valfi ile interluminal basıncını yükseltmek ve aşağıdaki gibi basınç değeri girin; 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Gerginliğini ayarlamak veya dikey veya boyuna micropositioner (Şekil 2) yardımı ile buna göre zorlanma; Gemi bazen büküm veya basınç artarken dürülmüş eğilimindedir. 60 mm Hg de damar dengeye ve 37 ° C de 45 dakika boyunca en azından. Dengeleme sırasında önceden ısıtılmış HEPES ile bir kez banyo çözüm değiştirin.
  9. KCI depolarize 10 ml çözelti uygulanır, tam olarak düz kas hücreleri depolarize ve maksimum daralma elde etmek için banyo, 37 ° C'de önceden ılıtılır. Istikrarlı bir sıkıştırmadan sonra, HEPES çözelti 3 kez her 10 dakikada bir banyo ile yıkayın.
  10. Istikrarlı ve üreme ile endotel gemi ve bütünlüğü canlılığı kontrolfenilefrin ilavesi (10 -5 M) ve asetilkolin için ible yanıtları (10 -5 M). HEPES çözüm her 10 dakika ile 3 kez durulayın.
  11. (10 -5 M) fenilefrin ekle gemi preconstrict için, ve istikrarlı bir daralma elde edildiğinde, asetilkolin artan dozlarda (10 -9, 3 x 10 sıralı eklenmesiyle kümülatif konsantrasyon-vazodilatasyon yanıt eğrisi (CRC) gerçekleştirmek - 9, 10 -8, 3 x 10 -8, 10 -7, 3 x 10 -7, 10 -6, 3 x 10 -6 ve 10 -5 M). Son dozdan sonra HEPES çözümü ile 3 kez yeni CRC başlamadan önce her 10 dakikada yıkayın.
  12. 2 mM EGTA içeren 2 + ücretsiz PSS Ca uygulayarak pasif lümen çapı belirleyin. Tüm parametreleri hesaplamak için kullanılacak her bir doz-yanıt (Şekil 4), için kaydedilen iz önlem lümen çapı.
  13. Perc gibi tüm asetilkolin gevşeme yanıtları ifadefenilefrin preconstriction sonra lümen çapı entage değişiklik, aşağıdaki denklemi kullanarak, fenilefrin sıkıştırmadan sonra kalsiyum içermeyen çap ve çapı arasındaki fark ile karşılaştırıldığında:
  14. Yüzde dilatasyon =% 100 x [(D x - B I) / (D Ca içermeyen - D i)], burada D ölçülen lümen çapına ve x = i, ve kalsiyum içermeyen her agonist dozu ortalama arter çapı ifade (x), başlangıç ​​çapı aşağıdaki (i) daralma fenilefrin ve Ca 2 + ücretsiz tampon (Ca-ücretsiz).

5. İstatistiksel Analiz

Tüm sürekli ölçümler ortalama ± SEM olarak ifade edildi. Mezenterik arterlerde vasküler reaktivite tekrarlayan ölçümler iki yönlü ANOVA ile analiz edilir. Tüm durumlarda, p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NO merkezi insanlarda 6 ve hayvan modellerinde 7 hem de kan basıncını homeostazın katılır. Vasküler düz kas gevşeme kontrol etmek için hiçbir kabiliyeti çözünebilir guanilat siklaz (SGC), cGMP 8 üreten bir heme içeren heterodimerik bir enzimi aracılık etmektedir. Son zamanlarda, kan basıncı-değiştirerek genetik varyant insanlarda 9'da kan basıncının düzenlenmesinde SGC ve alaka gösteren, sGCα 1 ve sGCβ 1 genleri içeren bir odağı tespit edilmiştir. İlginç ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kısmen çünkü böylece insan patofizyolojisi için fare modelleri üreten genetik değişiklikler, tanıtmak olasılığı, birçok araştırmacı için tercih edilen deneysel model vardır. Vazoaktif küçük direnç durumu değil, büyük boru gemilerin büyük ölçüde damar sistemi 11 boyunca kan akışının düzenlenmesi tanımlar. Fare gibi küçük hayvanlar, direnç damar boyutu mikrovasküler fonksiyonunu incelemek için bir tel myograph en kullanılmasını önler. Basınç myographs yalnızca bu sınırlamanın üstesinden değil, aynı zamanda...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Dr kabul etmek istiyorum. DMT basınç myograph ve Dr kullanımı için Paul Huang ve Dmitriy Atochin. Yüksek yağlı diyet ya da standart diyetle beslenen fareler sağlamak için Binglan Yu ve Chong Lei.

FİNANSMAN KAYNAĞI

Bu çalışma Harvard Tıp Fakültesi (ES Buys) den Tıp Alimler için Bilim Geliştirme Amerikan Kalp Derneği (ES Buys) Grant 10SDG2610313, ve Eleanor ve Miles Shore 50. Yıl Bursu programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NaClFisher ScientificBP358
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500
KClSigmaP9333
MgSO4 Fisher ScientificM65-500
KH2PO4 SigmaP3786
NaHCO3 Fisher ScientificBP328
NaOHFisher ScientificS318
D-GlikozSigmaG8270
EDTAFisher ScientificBP121
HEPESSigmaH3375
FenilefrinAcros OrganicsAC20724
AsetilkolinSigmaA6625
Basınçlı Miyograf SistemiDMT

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J. Vis .Exp. (55), e3119(2011).
  2. Arribas, S. M., Daly, C. J., McGrath, I. C. Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy. Methods Enzymol. 307, 246-273 (1999).
  3. Lei, C., Yu, B., et al. Inhaled Nitric Oxide Attenuates the Adverse Effects of Transfusing Stored Syngeneic Erythrocytes in Mice with Endothelial Dysfunction after Hemorrhagic Shock. Anesthesiology. , (2012).
  4. Buys, E. S., Cauwels, A., et al. sGCα1β1 attenuates cardiac dysfunction and mortality in murine inflammatory shock models. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297 (2), H654-H663 (2009).
  5. Buys, E. S., Sips, P., et al. Gender-specific hypertension and responsiveness to nitric oxide in sGCα1 knockout mice. Cardiovasc. Res. 79 (1), 179-186 (2008).
  6. Panza, J. A., Quyyumi, A. A., Brush, J. E., Epstein, S. E. Abnormal endothelium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension. N. Engl. J. Med. 323 (1), 22-27 (1990).
  7. Huang, P. L., Huang, Z., et al. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature. 377 (6546), 239-242 (1995).
  8. Friebe, A., Koesling, D. The function of NO-sensitive guanylyl cyclase: what we can learn from genetic mouse models. Nitric Oxide. 21 (3-4), 149-156 (2009).
  9. Ehret, G. B., Munroe, P. B., et al. Genetic variants in novel pathways influence blood pressure and cardiovascular disease risk. Nature. 478 (7367), 103-109 (2011).
  10. Buys, E. S., Raher, M. J., et al. Genetic modifiers of hypertension in soluble guanylate cyclase alpha1-deficient mice. J. Clin. Invest. 122 (6), 2316-2325 (2012).
  11. Kauffenstein, G., Laher, I., Matrougui, K., Guerineau, N. C., Henrion, D. Emerging role of G protein-coupled receptors in microvascular myogenic tone. Cardiovascular Research. 95 (2), 223-232 (2012).
  12. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010: Blood pressure and the kidney. Nat. Rev. Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  13. Michael, S. K., Surks, H. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (18), 6702-6707 (2008).
  14. Mendelsohn, M. E. In hypertension, the kidney is not always the heart of the matter. J. Clin. Invest. 115 (4), 840-844 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mesenteric ArteryVascular ReactivityEndothelium Dependent VasodilationPhenylephrine ConstrictionAcetylcholine RelaxationSGC Alpha One KnockoutMurine Hypertension ModelLuminal Diameter MeasurementVessel Mounting Technique

İlgili makaleler