Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Bir deri punch biyopsi sık periferik polinöropati 1,2 tanısında intraepidermal sinir lifi yoğunluğu (IENFD) ölçmek için kullanılır. Şu anda, distal bacak (DL) ve uzunluk bağımlı polinöropatiler 3 değerlendirilmesi için proksimal uyluk (PT) 3 mm biyopsi toplamak için yaygın bir uygulamadır. Ancak, IENFs ve çok yönlü olması nedeniyle, iki boyutlu (2B) görüntüleme analizi yoluyla sinir yapıları üst üste incelemek zordur. Alternatif olarak, üç boyutlu (3D) görüntüleme Bu ikilem için daha iyi bir çözüm sağlayabilir.
Mevcut raporda, ağrılı nöropati (PN) incelemek için 3D görüntüleme uygulamak için yöntemler mevcut. IENFs tespit etmek amacıyla, deri örneklerinde protein gen ürünü, 9.5 (PGP), bir pan nöronal belirteç immunofloresans analizi için işlenir. Şu anda, IENFD caydırmak kullanarak küçük lif nöropati teşhis etmek için standart bir uygulamadıraydınlık mikroskobu 4 kullanarak PGP immünohistokimyasal tarafından mayınlı. Mevcut çalışmada, PGP kullanılarak, toplam IENFD belirlemek için çift immunofloresans analizi uygulandı ve nosiseptif İESL, sinir büyüme faktörü 5 A (Trk A), yüksek afiniteli reseptör tropomiyozin-reseptör kinaz tanıyan antikorların kullanımı yoluyla. PGP ve Trk A antikorları ile birlikte boyama İESL avantajları açıkça PGP pozitif, nosiseptif lifler boyanarak PN çalışma yararlanır. Bu floresan sinyalleri PN ile ilişkili İESL nosiseptif IENFD ve morfolojik değişiklikleri belirlemek için ölçülebilir. Floresan görüntüler konfokal mikroskobu ile elde edilen ve 3D analiz için işlenir. 3D görüntüleme daha PN ile ilişkili morfolojik analiz dönme yetenekleri sağlar. Birlikte ele alındığında, floresan ortak boyama, konfokal görüntüleme ve 3D analiz açıkça PN çalışma yarar.
Giriş
Şu anda, küçük lif nöropatiler 3, 6-8 teşhis etmek için kullanılabilir deri punch biyopsi, gelen intraepidermal sinir lifi yoğunluğu, (IENFD) ölçmek için hekimler için yaygın bir uygulamadır. Biyopsiler distal bacak (DL), lateral malleol üzerinde 10 cm, ve proksimal uyluk (PT), anterior iliyak 9 aşağıda 20 cm alınır. Tüm İESL protein gen ürünü 9.5 (PGP), bir pan nöronal belirteç 10-12 kullanılarak etiketlenir. Şu anda, standart kullanarak küçük lif nöropati teşhis etmek için uygulama aydınlık mikroskobu 6 ile PGP boyama tarafından belirlenir IENFD. Olduğu Ayrıca, çeşitli araştırma grupları PGP immünhistokimya 7-9....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bir Bölüm: İmmünohistokimya
Arka plan boyama Delme deri biyopsisi 96 oyuklu plaka hazırlanması ve önlenmesi insan denekler toplandı ve sabitleştirici çözelti içinde 12-24 saat (2% 0.75 M L-Lizin çözeltisi (pH 7.4) ile paraformaldehit ve 0,05 mM sodyum periodat) inkübe edilir 4 ° C sıcaklıkta, daha önce tarif edildiği 8. Örnekler daha sonra daha sonra montaj medya optimum kesim sıcaklık (OCT), bir kriyostat 50 mikron kalınlığında bölüme kesitli gömülü, en fazla 1 hafta için 4 az 20% gliserol ° C ile tuzlu su (PBS) tamponlu fosfat cryoprotected vardır. Aşağıda tarif edilen protokole eden bir 96-çukurlu plaka içinde serbest bir immün....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Biz PN hastalardan PT ve DL biyopsi İESL morfolojisini incelemek için geçerli protokol uygulanır. Cilt, üç konulardan, PN ile ilişkili pathomorphology göstermek için Utah Üniversitesi'nde toplandı. Konular şunlardır: Durum 1: tip 2 diyabet (: 14 ay; ağrı skoru: süresi 51); PN öyküsü olan 51 yaşındaki erkek Durum 2: PN öyküsü olan 56 yaşındaki erkek ve Durum 3: Tip 2 diyabet (: 42 ay; ağrı skoru: süresi 46) PN bir geçmişi olan 66 yaşındaki erkek; tip 2 diyabet (:; 47 ağrı skoru 108 ay süreli) bir. Kantitatif duyusal .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
IENFD ölçümü yaygın periferik nöropatiler 13,14 derecesini belirlemek için kullanılmıştır. Şu anda, en sık kullanılan protokol sadece epidermisin bazal membran nüfuz sinir liflerinin yoğunluğu ölçer, bu dikkate aksonal dallanma ve / veya sinirlerin morfolojik değişiklikler almaz. Buna ek olarak, mevcut IENFD analiz PN 15 ağrı varlığı ile IENFD ilişkili olduğu gösterilmiştir olmamıştır.
Daha önce nosiseptif IENFD artan sayıda db / db farelerinde ağrı davranışları, tip 2 .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etmek.
Teşekkürler
Bu çalışma Sağlık Hibeler Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir K08 NS061039-01A2, Nöroloji Araştırma ve Keşif ve Michigan Üniversitesi'nde A. Alfred Taubman Tıp Araştırma Enstitüsü için Programı. Bu çalışma, Morfoloji ve Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü'nden Sağlık Hibe 5P90 DK-20572 Ulusal Enstitüleri tarafından finanse edilen Michigan Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi, resmi Analizi Çekirdek kullanılır. Yazarlar nosiseptif biyolojik immünhistokimya tekniği ilk gelişimini desteklemek için insan deri örneklerinde kendi cömert bağış için Robinson Singleton ve Gordon Smith (Utah Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | 1X PBS |
| Image-IT FX Sinyal | İnvitrojeni | oluşturmak için I36933 | Image-IT |
| Protein Gen Ürünü 9.5 (Poliklonal tavşan) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin İlgili-Kinaz A (Poliklonal keçi) | R& D Sistemleri | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 eşek & alfa ;-tavşan | Invitrogen | A21206 | AF488 eşek & alfa ;-keçi |
| Alexa Fluor 647 eşek & alfa ;-keçi | Invitrogen | A21447 | AF647 eşek & alfa ;-keçi |
| Albümini, Sığır | Serumu Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Kalibre edilmemiş Loop | LeLoop | MP 199025 | aşılama Loop |
| 96 kuyulu tahlil plakası | Corning Incorporated | 3603 | Kuyu plakası |
| Invitrogen | P36931 | DAPI | Altın antifade reaktifini uzatın |
| Fisher Scientific | 12-541-B | Lameller | |
| Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific | 12-550-15 | Mikroskop Slaytları |
| Olympus Fluoview Lazer Tarama Konfokal Mikroskop | Olympus | FV500 | Konfokal Mikroskop |
| Optimum Kesme Sıcaklığı | Sakura | 4583 | EKİM |
| Leica kriyostat | Leica | CM1850 | Kriyostat |
Kaynaklar
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
