Method Article

Hücre içi Ca Ölçme 2 + Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

DOI:

10.3791/50344

⸱

May 24th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología-Universidad Nacional Autónoma de México, 2Math and Sciences Department, Edison State College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi Ca 2 + Dinamikleri Sperm fizyolojisi ve Ca çok önemlidir 2 + Duyarlı floresan boyalar onları incelemek için çok yönlü bir araç oluşturmaktadır. Nüfus deneyleri (fluorometri ve akış fluorometri durdu) ve tek bir hücre deneyleri (akım sitometri ve tek hücre görüntüleme) uzay-zamansal [Ca izlemek için kullanılır 2 +] değişir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sperm, özellikle ulaşmak tanımak ve yumurta ile kaynaştırmak için tasarlanmış erkek üreme hücreleridir. Bu görevleri gerçekleştirmek için, sperm hücreleri sürekli değişen bir ortamda yüz ve birkaç fiziksel engelleri aşmak için hazır olmalıdır. Transkripsiyonel ve translationally sessiz özünde olan bu hareketli hücreler kendilerini yönlendirmek için çeşitli sinyal mekanizmaları derinden güveniyor ve yönlendirilmiş bir şekilde yüzmek ve yumurta bulmak için yolculuk sırasında çevre koşulları zorlu mücadele etmek. Özellikle, Ca 2 +-aracılı sinyal birkaç sperm fonksiyonları için çok önemlidir: motilite, kapasitasyonu (akrozom reaksiyonu için sperm hazırlayan karmaşık bir süreç) ve akrozom reaksiyonu (sperm-yumurta füzyon sağlayan bir eksositotik olay) aktivasyonu. Bu iyonun, hücre içi dalgalanmaları izlemek için flüoresan boyaların kullanım uygulaması duyarlılık kolaylığı nedeniyle önem arzetmektedir ve det yönlülükection. Tek boya yükleme protokolü kullanarak biz sperm Ca 2 + dinamikleri izlemek için dört farklı florometrik teknikleri kullanmaktadır. Her teknik hem tek bir hücre ve hücre popülasyonu düzeyde veri üreten, mekansal ve / veya zamansal çözünürlük sağlayan farklı bilgi sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ca 2 + ökaryotik hücrelerde sinyal iletim yollarının evrensel bir ikinci elçisidir. Hücre içi Ca 2 + (Ca 2 + i) heyecanlı ve olmayan heyecanlı hem hücrelerinde birçok temel fizyolojik süreçlerin düzenlenmesinde katılır. Ca 2 önemi ve evrenselliği + ikinci haberci olarak sinyal iletimi olaylar sırasında hücre içinde bilgi iletimi kendi uzay-zamansal çok yönlülük türetilmiştir. Ca 2 + de novo veya hücre, onun hücre içi konsantrasyonu ([Ca 2 +] i) içinde bozulmuş sentez edilemez farklı hücresel sürekli tampon, Sequester, bölümlere bu mekanizmaları ve / yoluyla çok....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda ölçmek için, dört bahsi geçen tekniklerin kullanımı rapor [Ca 2 +] i insan sperm hücreleri değişiklikler. Iyi bu steroid geçici bir [Ca 2 +] i sperm artış ürettiği kurulmuştur Biz, bir Ca 2 + cevabı tetiklemek için progesteron kullanılır. Özellikle, insan sperm, progesteron doğrudan sperm hücreleri 10,11 plazma membranında özel olarak ifade edilen bir Ca2 + kanal (yani CatSper) harekete geçirir. Ayrıca ölçülen dinlenme [Ca 2 +] i de yaygın bir artış [Ca 2 +] i kapasitasyonu sırasında meydana geldiği kabul olduğu göz önüne alındığında kapa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
1 Şekil. Havuz yöntemi ile sperm örneği hazırlanması için deney protokolünde. Hareketli sperm ayrılması için ve konsantrasyon ayarı için önemli adımlar şematik diyagramı gösterilmiştir. Kapasitasyonu gerekli olduğu zaman, son adım yalnızca inkübasyon gerçekleştirilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi sinyal en hücresel faaliyetleri için hayati önem taşımaktadır, Ca 2 + yaşam döngüsünün sonuna kadar, gübreleme kendi kökenli, onların bütün ömrü boyunca memeli hücrelerinde eşlik her yerde bulunan bir elçisidir. Farklı uyaranlara yanıt olarak, [Ca 2 +] i artar, salınır ve uzay-zamansal kodlama ile azalır, buna göre, çeşitli süreçler aktive, modüle veya Ca 2 +-kodlanmış mesajları ile sonlandırıldı. Hücre içi Ca2 + iyon Bu sinyal transdüksiyon süreçlerin karmaşık bir d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar teknik yardım için Jose Luis De la Vega, Erika Melchy ve Dr Takuya Nishigaki teşekkür ederim. Dirección General de asuntos del Kişisel Académico / Universidad Nacional Autonoma de México (CT IN202212-3); Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Meksika) (BT için 99.333 ve 128.566) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ham'ın F-10Sigma-AldrichN-6013
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA-7906
Kalsiyum Klorür Dihidrat yaklaşık% 99Sigma-AldrichC-3881
Makler Sayma OdasıSEFI Medical Instruments LTDSEF-MAKL
Fluo-3InvitrogenF-124220 şişe / 50 & mu; g her biri
İyonomisinAlomonI-700
ProgesteronSigma-AldrichP0130
Sodyum klorürSigma-AldrichS-9888İnsan sperm ortamı (HSM) için reaktifler
Potasyum klorürSigma-AldrichP-3911İnsan sperm ortamı (HSM) için reaktifler
Sodyum bikarbonatJT Baker3506Reaktifler insan sperm ortamı için (HSM)
Magnezyum klorürSigma-AldrichM-2670İnsan sperm ortamı (HSM) için reaktiflerKalsiyum
klorür susuzSigma-AldrichC-1016İnsan sperm ortamı (HSM) için reaktiflerHEPES
Sigma-AldrichH-3125İnsan sperm ortamı (HSM) için reaktiflerD-Glikoz
JT Baker1906-01İnsan spermi için reaktifler orta (HSM)
Sodyum piruvatSigma-AldrichP-2256İnsan sperm ortamı için reaktifler (HSM)
Sodyum L-laktat (yaklaşık %99)Sigma-AldrichL-7022İnsan sperm ortamı için reaktifler (HSM)
Propidium İyodür InvitrogenL-7011Bileşen B
Triton X-100 (t-Oktilfenoksipolietoksietanol)Sigma-AldrichX-1002.4 mM çözeltisi su içinde
Yuvarlak lamel VWR48380 08025 mm çap
Poli-L-lizin çözeltisi Sigma-AldrichP8920
Manganez klorürSigma-AldrichM-3634
Attofluor; Hücre Odası, mikroskopi içinYaşam teknolojileriA-7816
Dimetil SülfoksitSigma-AldrichD26505x5 ml
: ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
  2. Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intracellular CalciumSperm MotilityConventional FluorometryStopped Flow FluorometryFlow CytometrySingle Cell ImagingFluorescent Dye LoadingCapacitation ProcessProgesterone StimulationIonomycin Control

Related Articles