Bu yazıda, dinamik kontrastlı floresan videomikroskopi kullanarak in vivo tümör mikrodamarlar analiz etmek için bir yöntem mevcut. İki sayısal parametreler elde edilmiştir: işlevsel tümörün damarlanma yansıtan kılcal yoğunluk ve endotel duvarın bir sızıntının yansıtma indeksi sızıntı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Flüoresans Konfokal videomikroskopi kullanılarak tümör Angiogenesis İn vivo
Bu makalede
Özet
Özet
Bir fiber optik demeti ile fibered konfokal floresan in vivo görüntüleme floresan konfokal mikroskopi gibi aynı prensibi kullanır. Bu, optik fiberlerin yoluyla in situ elemanlarında floresan heyecan ve daha sonra aynı fiber optik üzerinden, fotonların bir kaydedebilir. Işık kaynağı, elyaf demeti içinde bir öğe aracılığıyla verici ışık gönderir ve bu örnek üzerinde tarar, piksel, bir görüntü piksel yeniden bir lazerdir. Bu tarama özel bir görüntü işleme yazılımı ile birleştirerek, çok hızlı olduğu için, 12 kare / sn 'lik bir frekans ile gerçek zamanlı görüntüleri elde edilebilir.
Biz bir konfokal floresan videomikroskopi cihazı kullanılarak, kantitatif kılcal morfolojisi ve fonksiyonunu karakterize etmek için bir teknik geliştirdi. Bizim deneyde ilk adım kılcal ağ görselleştirmek için tümörün dört kadranda 5 sn film kaydetmek oldu. Tüm filmleri (yazılım kullanarak işlendi ImageCell, seçilmiş çapı (bizim durumumuzda 10 mikron) etrafında gemilerin otomatik segmentasyon gerçekleştiren Mauna Kea Teknoloji, Paris Fransa). Böylece, toplam damar alanı ve görüntü toplam alanı arasındaki oran fonksiyonel kılcal yoğunluk 'ölçmek olabilir. Bu parametre genellikle patoloji araçlarını kullanarak ölçülen mikrovasküler yoğunluk için bir vekil belirtecidir.
İkinci adım interstisyuma kılcal duvarından makromoleküler kontrast madde sızmasını ölçmek için 20 dakika boyunca tümörün film kaydetmek için oldu. Damarlarda bu fazla interstisyumda sinyal yoğunluğu oranının ölçülmesi ile, bir "göstergesi kaçak 'kılcal geçirgenliği için bir belirteç olarak hareket eden, elde edildi.
Giriş
Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının oluşumunu içeren karmaşık bir süreçtir 1'dir. Arteryollerin, kılcal damarların ve venüllerin oluşan doku mikro patolojik değişiklikler, örneğin kanser, iltihap ya da diyabet gibi hastalıkların geniş bir ürün yelpazesi söz konusu olmaktadır. Bu kantitatif Mikrodamar yapısını ve fonksiyonunu değerlendirmek için yöntemler geliştirmek elzemdir. Görüntüleme gerçek zamanlı olarak ve in vivo olarak, bir non-veya mikro-invasif bir şekilde, mikrokapların çalışma sağlar ve aynı hayvanda 2 zamanla tekrar ölçer.
Şu anda, dinamik kontrastlı (DCE) görüntüleme 3 yaygın doku mikrodolaşımı değerlendirmek için kullanılır. Dinamik kontrastlı görüntüleme zaman içinde intravenöz olarak enjekte edilen bir izleyici bir biyo dağılıma takip eden bir tekniktir. Bu alım, niceliksel parametreler doku kanlanmalı yansıtan elde edilebilir. DCE görüntülemeçoğu zaman CT, MRI veya ultrason ile kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu görüntüleme teknikleri, özel deneysel cihazların kullanımı ile dışında kendi çözünürlük, en sık makroskopik kaldığı için, mikrokapların doğrudan görüntüleme izin vermez.
Bu yazıda, fibered konfokal videomikroskopi ile, dinamik kontrastlı optik görüntüleme kullanarak mikroskopik ölçekte ve in vivo tümör damarsal çalışma öneriyoruz. Biz, molekül ağırlığı ve doku endotel özellikleri incelenmiştir 4 göre, interstisyuma endotel bariyerini damarlar ya da sızıntı içinde özel olarak kalan bir makromoleküler bir kontrast madde (FITC-dekstran) kullanılır. Bu sızıntı ve interstisyumda biriktirerek, doğru damarları çizen hem mikrovasküler yapı çalışması, ve kılcal geçirgenliği sağladı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Kontrast maddenin hazırlanması
- FITC-dekstran 70 kDa için enjekte edilen doz, 500 mg / kg (FITC-dekstran 10 mg 20 gr ağırlığında bir fare için 0.1 ml tuzlu su içinde seyreltilmiş) 'dir.
- Madde ışığa uzun süre maruz olmamalıdır. Ağartma önlemek için, alüminyum folyo ile tüp karşılamak için tavsiye edilir.
2. Anestezi
- Fareler ksilazin 01:04 karışımından bir intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi edilmiştir (Rompun% 2, Bayer, Puteaux, Fransa) ve ketamin (ketamin 500, Virbac, Carros, France), sırasıyla, 66 mg / kg ve 264 mg / kg 20 g bir fare için.
3. İlgi Organ hazırlanması
- Biz, (deri altından tümör üzerinde, örneğin) ilgilenilen yerde fareler traş. Hayvan saç genellikle beyaz otomatik floresan olduğunu. Ne siyah, ışık emer.
- Yansıması için organı bakan deri kazıma edildi. Bu kanayan kadar beklemek önemlidirg aksi takdirde kan sızıntı ve görüntüyü kirletecek, kontrast madde enjekte etmeden önce durdu.
4. Edinme
- Kontrast madde jugular damar ya da kuyruk ven yoluyla enjekte edildi. Bir fluoresan kontrast maddesi yokluğunda gözlenen organda hiç veya çok az arka plan sinyal yoktur.
- Sonda, görüntülenecek organın önüne yerleştirilmiştir. Bizim çalışmamızda, bu tümör oldu.
- Lazer tümörü aydınlatmak ve kılcal damarlar floresan görmek için döndü.
- Tümör kılcal ağ görselleştirmek için kayıt yaparken çok yavaş hareket probu hareket ettirerek elle araştırılmıştır. Bir elinizi sabit tutmak için önemlidir, ve bu teknik biraz deneyim gerektirir. Bizim çalışmamızda, bu ilk adım fonksiyonel kapiller yoğunluk ölçümü izin verdi.
- İkinci adım, zamanla dinamik satın alma oldu. Bu çalışma için, 70 kDa FITC-dekstran kullanılır. En normal organlarda hiçbir interstisyel sızıntı yoktur ama tümörlerde bulunmaktadır. (Bizim durumumuzda olduğu gibi) zamanla aynı konumda görüntüler elde etmek için, bu ilgi alanına probu korumak için bir sistem kurmak için önemlidir. Bu prob tutmak için bir el yapımı desteğini kullanarak yapılır ve prob ucunda ultrason jeli biraz koyarak edildi. Kayıttan önce, zaman tümör ile temas halinde yerleştirilen probu stabilize harcanmıştır. Pozisyon güvenli bir kez nedeniyle fare nefes sadece minimal hareket vardı. Lazer kılcal sızıntı varlığını tespit etmek için 20 dakika boyunca 3 görüntüleri 30 saniye kaydetmek için çalıştırılmıştır. Bu kontrast madde beyazlatma azaltmak için her kayıt arasında kapalıydı.
- Deneyde, farenin tümörleri histolojik analiz için prosedür sonunda kurban edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Toplanan veriler kullanılarak, kantitatif Mikrodolaşımı yansıtan farklı parametreleri analiz edebilirsiniz.
Biz çalışılan in vivo bir lifli konfokal videomikroskopi floresan sistemi (Cellvizio, Maunakea Technology, Paris, Fransa 2), bir makromoleküler fluoresan kontrast madde enjekte edildikten sonra floresein izotiosiyanat-dekstran kullanarak (Balb-c farelere implante bir kolon tümör periferik vasküler ağ 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Fransa) ve sırasıy...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tümör mikrodolaşımında çalışma tümör büyümesi, yayılması ve tedaviye 1 yanıtı hastalık patofizyolojisi gerekli hale gelmiştir. Optik görüntüleme bir fluoresan kontrast maddesi kullanılarak kılcal gözlemlemek ve morfolojik (Fonksiyonel Kılcal Yoğunluk) ve fonksiyonel (index kaçak) parametrelerini ölçmek için kullanılabilir tekniklerden biridir.
Bu çalışmada kullanılan floresan mikroskobu görüntüleme avantajları ve sınırları hem de vardır. Bir avantajı, kullanılan kontrast maddenin ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| İnsülin serenge Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Floresein izotiyosiyanat-dekstran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg / mL tuzlu su içinde seyreltilmiş |
| Fiberli konfokal videomikroskopi | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| için Kalibrasyon ve Temizleme Kiti | LSU-488 | 4 > C | |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mozaikleme yazılımı | MaunaKea Technologies | ||
| Gemi algılama yazılımı | MaunaKea Technologies |
Kaynaklar
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
