Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Photothrombotic İskemi: Fare İnme Araştırmalar bir Minimal İnvaziv ve tekrarlanabilir fotokimyasal Kortikal Lezyon Model

36.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50370

⸱

9 Haziran 2013

 , 
1Department of Neuroscience, University of Turin , 2Neuroscience Institute of Turin (NIT), University of Turin , 3Neuroscience Institute Cavalieri-Ottolenghi (NICO), University of Turin , 4Department of Anatomy, Pharmacology and Forensic Medicine, University of Turin

Bu makalede

Özet

Fototromboz son derece tekrarlanabilir bir şekilde ilgi alanları küçük ve iyi ayrılmış enfarktüsü uyaran için hızlı, minimal invaziv bir tekniktir. Bu transgenik farelerde beyin plastisitesi oluşturan hücresel ve moleküler okuyan cevapları için özellikle uygundur.

Özet

Photothrombotic inme modelinde, daha önce enjekte ışığa duyarlı bir boya foto-aktivasyon vasıtasıyla belirli bir kortikal alan içinde bir iskemik hasara neden amaçlamaktadır. Aydınlatma sonra, boya aktive edilir ve tekli oksijen üreten olduğundan daha sonra trombosit agregasyonu ve sonunda lokal kan akışının kesilmesi belirler trombüs oluşumu, endotelyal hücre zarının hasar bileşenleri. Başlangıçta 1977 yılında Rosenblum ve El-Sabban tarafından önerilen bu yaklaşım, daha sonra sıçan beyninde 1985 yılında Watson tarafından geliştirilmiş ve şimdiki model temelinde kurulmuştur. Ayrıca, transgenik fare hatları artan durumu daha da Fototromboz model üzerinde faiz yükseltmek için katkıda bulunmuştur. Kısaca, ışığa duyarlı bir boya (Rose Bengal) intraperitoneal olarak enjekte edilir ve kan akışı içine girer. Bir soğuk ışık kaynağı tarafından aydınlatıldığında, boya aktif hale gelir ve yerel sonuçlanan trombosit aktivasyonu ve tromboz ile endotel hasarı nedenkan akımı kesinti. Işık kaynağı bir tekrarlanabilir ve non-invaziv bir şekilde ilgi herhangi bir kortikal alanı hedef sağlar kraniotomi, gerek ile sağlam kafatası uygulanabilir. Fare daha sonra sütüre ve uyanmak için izin verilir. Iskemik hasar değerlendirme hızlı bir şekilde-trifenil tetrazolyum klorid ya da krezil mor boyama ile gerçekleştirilebilir. Bu teknik hassas hücre karakterizasyon veya fonksiyonel çalışmalar için son derece avantajlı küçük boyutlu ve iyi ayrılmış sınırları, bir enfarktüs üretir. Ayrıca, transgenik farelerde beyin plastisitesi oluşturan hücresel ve moleküler okuyan cevapları için özellikle uygundur.

Giriş

21. yüzyılın başında, iskemik inme uzun süreli sakatlık 1 ve inme 2004 2 yaklaşık 5,7 milyon ölüme sebep olduğu ölüm dünya çapında, ikinci neden, ikinci neden temsil eden bir yıkıcı bir hastalıktır. Konuldu birçok çabalarına rağmen, inme sonrası fonksiyonel iyileşme geliştirmek için kullanılabilecek etkili bir tedavi hala var. Bu iskemik hasar patofizyolojisi modelleme izin ve in vivo olarak farklı nöroprotektif stratejilerinin etkinliğini test inme hayvan modelleri yaygın olarak inme araştırma alanında kullanılmaktadır. Bu modellerin çoğu diğer modelleri genellikle belirli alanlarda, motor ve somatosensoriyel korteks küçük boyutta lezyonlar incelemek için geliştirilmiştir ise, orta serebral arter içinde (geçici veya kalıcı) kan akışını keserek geniş infarktlar neden hedefliyoruz. Ancak, çeşitli faktörleri de oluşturabilir katkıda bulunabilirkullanılan fare suşu dahil olmak üzere deneysel inme çalışmaları, içinde değişkenlik ertain derecesi, her şeyden önce yaş ve cinsiyet çalışmaya dahil hayvan ve, teknik iskemik hasar ikna etmek için kabul etti. Son nokta, cerrahi süresi ve invaziv (yani kraniotomi ihtiyacı) yanı sıra güvenilir bir iskemik lezyon ikna etmek için operatör için gerekli cerrahi beceri ile ilgili olarak kritik belirleyicileri olan başarılı ve in vivo inme çalışma tarafsız .

Fototromboz kavramı ilk olarak 1977 3. yılında Rosenblum ve El-Sabban tarafından önerilen ve Watson ve arkadaşları tarafından sıçan beyninde uygulama ile ünlü oldu 1.985 4 tekniği büyük ölçüde geliştirilmiş ve şimdiki model 3 temelinde kurulmuştur hangi oldu. - 6. Photothrombotic yaklaşım daha önce kan sistemi, WH içine teslim ışığa duyarlı boya fotoğraf aktivasyonu ile bir kortikal enfarktüsü neden hedefliyorICH ışığa maruz alanlarında yerel damar tromboz ile sonuçlanır. Dolaşan boya bir soğuk ışık kaynağı tarafından uygun bir dalga boyunda aydınlatılır, bu da son derece reaktif singlet oksijen ürün büyük miktarda bir oksijen molekülleri, enerji bırakır. Bu oksijen ara-maddelerinin, endotelyal hücre zarı peroksidasyonu neden trombosit yapışması ve yığılmasını yol açan ve sonunda lokal serebral akışı kesilmesi de 7 trombüsün oluşmasına neden olur.

Fototromboz genellikle insan inme olur, ama ışığa maruz bölgelerde kan akımının seçici kesinti neden daha yüzeysel damarları, lezyonları neden olarak sadece bir arter tıkamak ya da sonu yok bir kanonik olmayan iskemik modelidir. Bu nedenle, bu yaklaşım, kortikal plastisite hücresel ve moleküler çalışmalar için uygun olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajı yürütme sadeliği bulunur.Fırçalayın 2 dakika; kafa derisi tıraş 1 dakika;, stereotaksik aparat üzerine hayvan yerleştirmek için 3 ile 5 dk Ayrıca, Fototromboz kolayca yirmi dakika bekleyin (anestezi için 3 dk da dahil olmak üzere hayvan başına yaklaşık kırk dakika, yapılabilir antiseptik solüsyon ile kafa derisi, bir kesi yapmak ve kafatası temizlemek, 2 ila 4 dk soğuk ışık lif yerleştirmek için, gül Bengal çözüm enjekte 1 dakika; intraperitoneal difüzyon için 5 dakika bekleyin-; aydınlatma 15 dakika ve 5 dakika yara temiz ve) hayvan dikiş. Ayrıca, herhangi bir cerrahi uzmanlık lezyon sağlam kafatası basit aydınlatma ile bağlı olarak bu tekniği gerçekleştirmek için gereklidir. Klasik arter tıkanıklığı farklı olarak, bu yöntem ışınlanmış bölge içinde pial ve intraparenkimal mikrodamarlar seçici tıkanıklığı belirleyen ve hiçbir teminat gemi hedeflenen bölgede oksijen kaynağı bırakılır gibi lezyonlar arasında değişkenlik azaltır.

Kendine özgü doğası, rağmenphotothrombotic hasar hisse temel mekanizmaları beyin inme meydana. Benzer şekilde insan inmede arter tıkanıklığı için, trombosit agregasyonu ve pıhtı oluşumu ışınlanmış alanında 7 kan akımının kesilmesi belirler. Aynı şekilde, bu model de orta serebral arter tıkanıklığı 8 gibi temel inflamatuar yanıtları paylaşıyor. Ancak, iyi sınırlandırılmaktadır sınırlarının, kısmen korunmuş metabolizmasının bir alana karşılık gelen halkalı bölgesi, bir photothrombotic lezyon sonra çok düşük ya da yok olan bir. Bu, açık bir sınır iskemik veya bozulmamış kortikal bölgede hücresel yanıtların çalışma kolaylaştırabilir. Fototromboz fare modeli transgenik hayvanların çeşitli inme çalışmalar için özellikle uygundur. Gerçekten de klasik modelleri fare suşu önyargı 9 neden olabilir yüksek bir ölüm oranı bildirilen C57BL / 6 tüm suşları ve uzun süre çalışmalara sığamaz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ameliyat öncesi

  1. Bir 1.5 ml tüp Rose Bengal tartılır ve 15 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyon elde edilene kadar steril tuzlu su çözeltisi içinde çözülür. 0.2 mikron filtre ile sterilize Filtre ve en fazla iki aya kadar oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
  2. Otoklav bütün cerrahi aletler sterilize edin. Cerrahi alan ameliyat başlamadan önce en az bir saat sterilize edilmelidir.
  3. Enjekte edilecek Rose Bengal dozunu ayarlamak için, fare vücut ağırlığı kaydedin. Biz mevcut protokolde 12 haftalık dişi CD1 farelerde 10 ul / g hayvan ağırlığı enjekte. Rose Bengal miktarı, istenen kortikal lezyon büyüklüğü kolayca farklı dozlarda (tipik olarak 2 ul / g, 5 ul / g ya da 10 g / ml vücut ağırlığı) test ederek ön deney kümesinin ayrı tespit edilebilir üretmek için gereklidir. Enjekte edilecek Rose Bengal miktarı, ışık kaynağının özellikle tip deney koşullarına bağımlı olduğuna dikkatkullanılan ve ışık maruz kalma süresi. Bu çalışmada, 10 g / ml (150 ug / g), doz diğerleri gruplar bilgi ise, 15 dakika boyunca ışığa maruz kalma üzerine Fototromboz ikna etmek için gerekli olduğu tespit edildi, 50 ug / g 6,8 ve 100 mg / g 10 intraperitoneal bir photothrombotic lezyon uyaran için yeterli oldu.

2. Anestezi Prosedürü

  1. En az% 50 olarak, şeffaf bir indüksiyon odası (indüksiyonu için% 3.5-4, muhafaza edilmesi için% 1.5-2) (v / v) oxygen/50% (v / v) dinitrojen gazından isofluran ile fareler anestezi. Gaz anestezi hayvanların hızlı bir uyandırma sağlar ve anestezik gaz seviyesi kolayca ayarlanabilir. Alternatif olarak, fareler de bir ketamin-ksilizin karışımı ile anestezi olabilir.
  2. Derin anestezi ulaşıldığında, bir yüz maskesi kullanarak anestezi, indüksiyon odasından, anestezi verilen hayvanın kaldırmak stereotaksik çerçeveye yerleştirmek ve korumak. Isoflura ayarlayınne doz yeterli anestezi düzeyi elde etmek. Işlem boyunca solunum hızı izlemek ve (40 - dakikada 60 nefes) sabit olduğundan emin olun.
  3. Hayvan derin anestezi sağlamak için ayak tutam kullanın.
  4. Kurumasını gözleri önlemek için, göz merhemi sürün.
  5. Yavaşça cerrahi prosedürler boyunca sıcaklık izlemek için rektal prob takın. ± 0.5 ° C sıcaklıkta 37, fare vücut ısısını korumak için ilgili geri-besleme ile kontrol edilen ısıtma yastığı ayarlama

3. Hedef Alan aydınlatılması için Cerrahi

  1. Bir elektrikli tıraş makinesi ile fare derisi Tıraş.
  2. Sıkıca baş güvenli ve dış meatus içine kulak çubukları yerleştirin. Zarar eardrums için dikkatli olun.
  3. Pamuklu kullanarak% 70 etanol ve betadin bira alternatif ile yüzeye deri dezenfekte edin.
  4. Göz le gelen orta hat boyunca bir kesi yapmak için bir neşter kullanınboyun aşağı Vel. Kafatası maruz tutmak için cilt Retraktörler uygulayın.
  5. Hafifçe bir neşter ile kafatası kenarlarına periost geri ve kafatası yüzeyi steril pamuklu çubuk kullanarak kurumaya bırakın. Bregma ve lambda belirleyin. Referans noktası olarak Bregma bir cam mikropipet yerleştirin, daha sonra ilgi bölgenin koordinatlara taşıyın. Bu yazı için seçilen ilgi bölgesi, kabaca yuvarlak şekilli bregma lateral yaklaşık 2 mm merkezli ve Franklin tarafından fare beyin atlas göre sensorimotor korteksin büyük bir kısmını içeren ve yaklaşık 30 mm 2, bir alanı kapsayan Paxinos 11.
  6. Referans noktaları ile ilgi konumunu işaretleyin ve ışık saçılması önlemek ama üzerine baskı uygulamayın değil dikkat kafatası yüzeyi ile yakın temas içinde bir fiber optik koydu. Işıklı alan fiber optik gui ucunda küçük diyafram veya bir kap ile kafatası üzerinde bir maske uygulayarak sınırlandırılabilirde.

4. Rose Bengal Enjeksiyon ve Aktivasyon

  1. 1 ml şırınga içinde Rose Bengal çözüm yük ve vücut ağırlığı 10 ml / g olan bir doza göre enjekte edilecek miktarı hesaplanır.
  2. Yavaş intraperitoneal geçin.
  3. Boya yaygın izin ve kan dolaşımına girerek. 5 dakika sonra, soğuk ışık aydınlatıcı açın. Işık kaynağı tarafından başka bir hayvanın aydınlatma kaçının. Biz 150 W yoğunluk fiber optik aydınlatma kullanılır.
  4. Aydınlatma 15 dakika sonra, ışığa maruz kalma durdurmak ve yara dikiş. Aydınlatma beş dakika önce infarkt ve 10 dakika azami etki elde etmek için 12 olası yeterlidir. Değişkenliği en aza indirmek için, biz 15 dakika boyunca aydınlatmak için tercih.

5. Dikin

  1. Cilt retraktörlere çıkarın ve dehidratasyonu önlemek için steril serum fizyolojik geçerlidir.
  2. Ters kesme needl kullanarak yara kadar yakıne ve ipek veya naylon dikiş konu.
  3. Tamamen uyanık kadar anestezi teslim Kesme, dikkatle stereotaksik cihazdan fare çıkarın ve önceden ısıtılmış ısıtma yastığı üzerine koydu, daha sonra kafesine geri. Vücut ısısı infarkt uzantısı değişkenliği sınırlamak için prosedürler boyunca dikkatle izlenmelidir. Konsantrasyon ve uygulama yoluna göre, Bengal yine enjeksiyon 13 birkaç saat sonra kan akışında tespit edilebilir yükseldi. Potansiyel hasarlar (Rose Bengal emme dalga boyu yeşil spektrumda olan) önlemek için ısınma lamba ısıtma battaniye tercih edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol zaten çıplak gözle (Şekil 1A-1C) için korteksin diseksiyonu zaman görülmektedir bir kortikal lezyon üretecek. Photothrombotic lezyon doku Rose Bengal Fotoğraf-aktivasyon izin vermek için yeterince saydam olduğu yüzeysel ve derin kortikal katmanları gelişir. Beyin enfarktüsü ölçüde ölçümü% 4 paraformaldehid (PFA) tespit sonrasında taze doku veya cresyl menekşe ile trifenil-tetrazolyum klorür (TTC) ile histolojik boyama ile hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. TTC kuluçka önce, taze disseke...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Değişiklikler ve oyuncu değişikliği

Çünkü 562 nm onun emme tepe, bir filtre ksenon ark lambası bir yeşil ışık lazer aslında ışığa Rose Bengal ışın tedavisi için seçildi. Lazer aracılı uyarma hala recently5 kullanılmış olmasına rağmen, aynı zamanda boya uyarma 10,15 emin olun soğuk ışık lamba ile değiştirilebilir. Soğuk ışık fiber optik lazer kaynaklarına göre işlemek için daha kolay ve daha ucuzdur. Ancak, lazerler yaygın damar özgü pıhtılaşma 10 in vivo bir için ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz anlayışlı öneriler ve yorumlar ve Maurizio Grassano, Marina Boido ve çekim için Ermira Pajaj için Annalisa Buffo teşekkür ederim. Bu çalışma FP7-MC-214003-2 (Marie Curie İlk Eğitim Ağı AXREGEN) ve Compagnia di San Paolo, gliarep proje tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Solüsyonlar ve kimyasallar
Rose Bengal Sigma, İtalya330000
Isofluran Veteriner Merial103120022
Betadine Asta Medica
Paraformaldehit Sigma-Aldrich158127
Cerrahi malzeme ve ekipman
Fluosorber Filtre Havardaparatı 340415
150W fiber optik aydınlatıcıFotonikPL3000
Plaka TCAT-2DF Havard cihazı727561
Stereotaksik Alet Çalma51950
Çalışma mikroskobu TakagiOM8
Isıtma yastığı
Oksijen ve nitrojen gazı
Cerrahi AletlerDünya hassas aletOptik fiber musluklar ve maske özel yapımdır
için Sıcaklık Kontrol Cihazı

Kaynaklar

  1. Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
  2. Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. Global and regional causes of death. Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).
  3. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circ. Res. 40, 320-328 (1977).
  4. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
  5. Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16(2003).
  6. Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).
  7. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).
  8. Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).
  9. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).
  10. Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).
  11. Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 1st, Academic Press. New York. (1997).
  12. Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).
  13. Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP). Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).
  14. Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Res. 367, 296-300 (1986).
  15. Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 18, 1113-1119 (1987).
  16. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  17. Kleinschnitz, C., et al. Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis. Stroke. 39, 1262-1268 (2008).
  18. Porritt, M. J., et al. Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane. PLoS One. 7, e41090(2012).
  19. Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).
  20. Markgraf, C. G., et al. Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats. Stroke. 24, 286-292 (1993).
  21. Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke. 26, 444-450 (1995).
  22. Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats. Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).
  23. Maxwell, K. A., Dyck, R. H. Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis. Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).
  24. Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40, 248-253 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fare İnme ModeliFotokimyasal İnmeRose Bengal EnjeksiyonuEndotelyal HasarTrombosit AgregasyonuStereotaktik DüzenekHistolojik BoyamaBeyin Plastisitesi
Photothrombotic İskemi: Fare İnme Araştırmalar bir Minimal İnvaziv ve tekrarlanabilir fotokimyasal Kortikal Lezyon Model
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.