Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Summary

Biz retina dekolmanı bir transkriptomik analizi için retinektomi gelen retina örnekleri kullanılır. Ayrıca, cerrahi blokları ve laboratuar arasında RNA koruma sağlayan bir işlem geliştirilmiştir. Biz saflaştırılmış RNA mikroarray analizi için uygun olduğunu sağlamak için sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol.

Abstract

Retina dekolmanı (RD) retina pigment epiteli (RPE) gelen nörosensöriyel retinanın bir ayrılık açıklar. RPE ışığa duyarlı nöronlar, fotoreseptör normal fonksiyonu için gereklidir. RPE, retina dekolmanı hücre dışı sıvı ile dolu bir fiziksel boşluk oluşturur. RD nörosensöriyel retina ve iyonları ve metabolitleri fizyolojik değişim ciddi tedirgin çünkü RPE hem etkileyen hücresel ve moleküler yan etkiler başlatır. Vizyonu için sonucu vizyonu ¹ restorasyon iki doku sonuçları hızlı bir reapposition beri dekolmanı süresi ile ilgilidir. RD tedavisi sadece cerrahidir. Vitreus jeli (vitrektomi) çıkarılması retina dekolmanı lehine müstakil alanı çevresinde retina kaldırılması olmayan parçası takip eder. Kaldırılan retina örnekleri res nullius (bir şey) ve dolayısıyla normal atılır.Bu cerrahi örneklerden RNA kurtarmak için, laboratuvara cerrahi blok aktarımı sırasında RNA koruma sağlar prosedürü dergi geliştirdi. Ayrıca sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol saflaştırılmış RNA'lar küresel gen ekspresyon analizi için uygun olduğunu sağlamak için. RNA kalitesi hem RT-PCR ve mikroarray analizi ile doğrulandı. Verilerin analizi RD iltihap ve fotoreseptör dejenerasyonunun bir anda tutulumu görülmektedir.

Introduction

Retina dekolmanı temel tedavi amacı (RD) retina pigment epitel hücrelerinden fotoreseptör ayrılması kaynaklanan fotoreseptör hücre hasarı ve retina iltihabı sınırlamak için bir yol bulmaktır. RD sırasında, RPE hücreleri dediferansiye, göç, aktive edilir ve komplikasyonlara yol açabilir kasılma güçleri uygulamakla, müstakil retina yüzeyinde çoğalırlar. RD transkriptomik analizi RD ve cerrahi ile birlikte son görme sonucu geliştirmek dolayısıyla gelecekteki tedavi molekülleri takip modifiye ifade ile hedef genleri tanımlamak için bir yoldur. İyi deoksiribonükleik asit (DNA) olarak ribonükleik asit (RNA) sabit değil bilinen, genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır ikincisi, istikrarı ² eski 30.000 'den fazla yıllık paleontolojik örneklerinden Neandertal genomunun diziliminin izin vardı. Haberci RNA'ya genomundan genlerin DNA transkripsiyonbüyük gen ifadesinde süreci ve mRNA bir sinyal teşkil için kararsızdır. RNA'lar sinyal sona RNAse enzimler tarafından çok hızlı bir şekilde bozulmuş. Ifade bir araştırma laboratuvarında incelenmiştir önce dokularının organizma izole zaman, RNA'lar çok sık bozulmuş. Bozulmuş RNA analizi gen ekspresyonu için uygun değildir. Laboratuvar personeli ameliyat katılamazlar çünkü, biz kolay bir prosedür geliştirdiği ve sadece cerrah uygun RNAse-ücretsiz bir çözüm içine dokuları kurtarmak için gerektirir. Dokuların RNA stabildir ve bu çözelti, oda sıcaklığında, 72 saat sonra herhangi bir bozulma işareti olmadan analiz edilebilir. Örneklerden RNA'lar laboratuar ³ aktarıldıktan sonra, bir sezyum klorür gradyanı üzerinde ultrasantrifügasyon, bir içeren bir standart yöntem ile saflaştırılır. Daha sonra, RNA kalitesi agaroz jel elektroforezi ve RT-PCR ile incelenmiştir. RNA saflaştırma protokolü vardırDNA ve RNA için farklıdır ve RNA geni ekspresyon çalışmalarında yapısından sinyaller üretecek bir DNA molekülü tarafından kirlenmemesini sağlar kendi yoğunluğuna göre moleküllerin ayrılması avantaj sağlar. Buna ek olarak, sayısal olarak bir hücre içinde en bol RNA olan transferi RNA'lar (tRNA), ribozomal RNA (rRNA) ve haberci RNA'lar (mRNA), olmak bu iki sonuncusu, aynı fiziksel özelliğine göre ayrılır arıtma sürecinin ürünü sonunda. Mikrodizi analitik protokolleri en tRNA, ^4-6 tarafından inhibe ters transkriptazlar, ve RNA polimerazlarının kullanımının, çünkü dahil hazırlanmasından tRNA kaldırılması yararlıdır. Cerrahi örneklerden saf RNA standart bir protokol kullanarak etiketli ve bir mikroarray çip melezleşmiştir ve sonuçları iki tamamlayıcı yöntem, yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak ve karşılıklı bilgi ve visuali dayalı yeni bir yöntem kullanılarak analiz edilmektedir edilirWeb-tabanlı sunucu Retinobase ^7,8 üzerinde zed.

Protocol

1. Journal: Cerrahi Blok gelen örnekler yeniden elde etmek Prosedürü

Laboratuarda

1. Ekspres kargo şirketi bir ithalat sözleşme alın.
2. Laboratuvar (Telefon numarası ve E-posta adresi) olarak kişi gösteren laboratuvarın posta adresi ile (veya 25) nakliye formları 10 doldurun.
3. (Veya 25) 10 hazırlayın örnek formlar 10 (veya 25) 1 sayılı. Bu formlar), hastanın bir) anonim kimlik hakkında bilgi vermek cerrahi tarih ve c) herhangi bir ek açıklamalar cerrah eklemek istiyorum b özel boşluk. 10 (veya 25) yastıklı zarflar (150 x 210 mm) hazırlayın.
4. (DEPC) _H2O (GHCl) ile tedavi edilen dietilpirokarbonat içinde 6 M guanidin klorür, RNaz içermeyen reaktifler 25 (veya 65), her ml kullanılarak hazırlandı.
5. Dolgu 10 veya 25 GHCl çözüm 2.4 ml 5 ml steril polietilen yuvarlak alt tüpler sayılı.
6. Basın ti daha, bu tüplerin üst kısmı doldurmak için argon gazı kullanılırghtly cerrahi kabininde depolama birkaç yıldır GHCl çözeltisi oksidasyonunu önlemek için kap.
7. 50 ml steril polipropilen konik alt tüp vidalı kapaklı her 5 ml tüpler tanıtmak. 50 ml tüp içine 5 ml tüp tutmak için temiz bir kağıt doku parçası kullanın, tüp kapatın.
8. Yastıklı zarflar, nakliye formları, örnekleri formları ile bir karton kutu içine bir polistiren raf ve raf 50 ml tüpler yerleştirin.
9. Onların okuma kolaylaştırmak için karton kutusunun kapağının iç: talimatları (1,12-1,19 bakınız) yapıştırın.
10. Hastanede kişi posta ile karton kutu gönder.

Hastanede

11. Cerrahi odasına cerrahi kabinden karton kutu getirin. Not Dikkat: prosedürü bir bağışıklık sistemi zayıflamış hasta içeriyorsa, karton cerrahi odasına getirildi olmamalıdır.
12. Ameliyat sırasında, retina specim yersayılı 5 ml steril polipropilen içine en GHCl çözümü ile dolu. Tüpü sıkıca kapatın.
13. Kısaca Tüp tekrar.
14. 10 dakika boyunca kan tüpü külbütör tüp yerleştirin.
15. Ekteki örnek numaralı formu doldurun.
16. İlgili sayılı 50 ml tüp üzerine kimlik numarası bildirin.
17. 50 ml tüp içine cerrahi örnek ile 5 ml tüp tanıtmak, kağıt mendil yerine ve tüp vida.
18. Ekteki yastıklı zarf birinde tüp ve içine doldurulmuş örnek form tanıtmak. Kapatın.
19. Almak için ekspres kargo şirketi arayın.

2. RNA Arıtma

Laboratuarda

1. Tüp yukarı ve aşağı hareket ederken 1 dakika bir homojenizatör ile GHCl çözümü ile 5 ml tüp polipropilen numune homojenize.
2. 2 M potasyum asetat, pH 5.0, 270 ul ekleyin. Onun bir çalkalayıcı tüpü yerleştirilerek 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanıryatay konumda (420 ^min-1).
3. 20 ° C'de 5000 rpm (6500 xg) 10 dakika santrifüj
4. Pelet bozmadan düzgün çözünür fraksiyon aspire.
5. Bir 14 ml'lik steril bir tüpe aktarın.
6. 100 mM Tris, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1% 5.3 ml ilave edilir.
7. Sezyum Klorür (CsCl) 3.2 g ekleyin ve karıştırın tarafından tüp karıştırın.
8. , Steril bir 11 ml'lik santrifüj tüpüne polyallomer CsCI / etilen-diamintetraasetik asit (EDTA), 1.8 ml ilave edilir.
9. 10 ml'lik steril bir Pasteur pipeti ile, yoğunluk yastık rahatsız etmemek için tüpün kenarına yavaş kaydırarak 1.8 mi CsCI / EDTA üzerine RNA çözeltisi aktarın.
10. Rotor içine tüpler (retina gerekirse olmadan tampon içeren ikinci bir tüp) yerleştirin.
11. 20 ° C'de 32.000 rpm (225,000 xg) 24 saat santrifüj
12. Steril bir Pasteur pipeti ile çözüm üstün parçası kaldırmak, ve atın.
13. Kontrol ederken yavaş yavaş çıkarınDNA (viskoz) ikinci bir steril Pasteur pipet ile aspire, ve atın bir an.
14. Üçüncü bir steril Pasteur pipeti ile RNA pelet serbest bırakmak için özen kalan çözüm çıkarın.
15. Ile tüp bölümü altındaki bir neşter alev sterilize edilmiş, sonra steril bir ters bakışları borunun geri kalan kısmı koydu.
16. Tüp ters ve GHCl 160 ul ile ince durulayın.
17. 10 dakika pelet kurumaya bırakın.
18. 150 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) içinde pelet yeniden süspanse edin.
19. 2 ml steril mikrosantrifüj tüpü içine transfer çözeltisi, daha sonra 30 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) ile kalıntı pelet hasat.
20. 150 ul (- 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.5) ilave edilir.
21. 3 M sodyum asetat, pH 5.0, girdap tüpün 30 ul ekle.
22. Etanol% 100 (-20 ° C), vorteks tüpün 900 ul ekleyin.
23. Erime buz tüpü 30 dakika yerleştirin.
24. Cen4 ile 15,000 rpm'de 30 dakika tüp ° C trifuge
25. Ince çözünür fraksiyon aspire, ve atın.
26. 500 ul% 70 etanol (RT), girdap tüp ekleyin.
27. 4 az 15.000 rpm (18.000 xg) tüp 20 dakika ° C santrifüj
28. Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın.
29. Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır.
30. 10 dakika için pelet hava kurumasını bekleyin.
31. 50 ul DEPC ile tedavi edilen H ₂ O içinde pelletini tekrar
32. Vorteks şiddetle karıştırın.
33. Bir su banyosu içinde 45 ° C'de 15 dakika ° C'de inkübe edin.

3. Jel Elektroforez RNA Analizi

1. Bir kimyasal kaput içinde bir agaroz jel dökün.
2. Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde, analiz edilecek RNA 2 ul ve örnek hazırlık tampon 6.4 ul ekleyin.
3. Ikinci bir 1.5 ml lik tüp içinde, RNA standartları 3 ul ve örnek hazırlık tamponu 9.6 ul ekleyin.
4. 65, tüpler 15 dakika ısıtın ° C, Buz koydu.
5. RNA örnek tüpü ve RNA standartları tüp boya ile 1 ul EB yükleme tampon boya olmadan 1 ul etidyum bromür (EB) yükleme tamponu ekleyin.
6. Bir boya (bromofenol mavisi) jelin alt 2/3 ulaşıncaya kadar akan tampon kimyasal bir başlık içinde 100 V, - 80 altında jel çalıştırın.
7. Jel 250 ml iyonu DEPC işlenmiş 2x SSC ile iki kere 15 dakika çalkalayın.
8. UV aydınlatma altında dijitalize edilen görüntü almak.
9. Üst bant (23S rRNA) ve alt bant (16S rRNA) arasındaki oranı hesaplar.

4. RNA son saflaştırma

1. DEPC ile tedavi edilen H ₂ O (gerekirse) ile 100 ul RNA örnek hacmi ayarlayın.
2. 100 ul fenol asit (1 mi fenol sodyum asetat, pH 5.2, 50 mM DEPC işlenmiş _H2O + 130 ul içinde doyurulmuş) kuvvetli bir şekilde karıştırın. Ekleme
3. Oda sıcaklığında 13.000 rpm'de (15000 x g) de 10 dakika santrifüj yapılır.
4. RecoveR, yeni bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine sulu faz (üst faz) ve dikkatli bir şekilde aktarılır.
5. 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve etanol içindeki 250 ul% 100 (-20 ° C) 10 ul ekle.
6. Erime buz içine tüp 30 dakika inkübe edilir.
7. 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 30 ° C dakika santrifüj
8. Dikkatlice aspire çözünebilir fraksiyon ve atın.
9. 500% 70 etanol ul (oda sıcaklığı) ve tüp vorteks ekleyin.
10. 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 20 ° C dakika santrifüj
11. Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın.
12. Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır.
13. Hava 10 dakika süre ile pellet kuruması beklenir.
14. DEPC işlenmiş H ₂ O. 50 ul içine pelletini
15. Sonra 45 tüp 15 dakika ° C inkübe
16. RNA numunesinin üzerine 2 ul 260 nm ve 280 nm'de absorbans (ABS) ölçün. Oranı Abs260/Abs280 hesaplanmıştır.
17. Mağaza -80 RNA örnek ° C (birkaç yıldır istikrarlı).

5. Çözümler ve Temizleme Prosedürleri

1. Potasyum asetat 2 M, pH 5.0: DEPC ile muamele H ₂ O., 70 ml içine 19.6 g potasyum asetat çözülür DEPC işlenmiş H ₂ O ile 5 durulama ardından, 15 dakika boyunca 1 M NaOH ile içine ıslatarak pH metre prob temizlemek Asetik asit ile pH 5.0 'a ayarlayın ardından DEPC ile muamele H ₂ O ile 100 ml hacim ayarlama
2. Tris-HCl, 100 mM, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1:% 0.5 M Tris-bazlı bir pH 8.0 40 ml N-Lauroylsarcosine 2 g (bir davlumbaz altında) çözülür. ) DEPC tedavi H ₂ O ile 200 ml ses seviyesini ayarlamak CSCL / EDTA: DEPC tedavi H ₂ O ile hazırlanan 50 ml 10 mM EDTA pH 7.5 CSCL 96 g Otoklav ve DEPC ile tedavi edilen H ₂ O ile 100 ml ses seviyesini ayarlamak PH <7.5 olup olmadığını kontrol edin.
3. Agaroz jel% 1: 62 ml DEPC tedavi H ₂ O içinde agaroz 1 g koyun Bir mikrodalga fırında kaynatın. 12.3 M, 18 mlformaldehit, 5x MOPS 20 mi. Bir kimyasal kaput içinde dökün.
4. Örnek hazırlık Tampon: hazırlanan hazırlıksız olmak. 5x MOPS, 12.3 M formaldehit ve formamidin 40 ul 16 ul arasında kimyasal bir kaput 8 ul içinde karıştırın.
5. EB yükleme tamponu (boya olmadan): hazırlanan hazırlıksız olmak. DEPC işlenmiş H ₂ O. ile hazırlanan% 80 gliserol, 20 ul halinde 4 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin
6. EB yükleme tamponu (boya ile): hazırlanan hazırlıksız olmak. % 0.25 ksilen cyanol, DEPC ile muamele H ₂ O ile% 0.25 bromofenol mavisi ihtiva eden% 80 gliserol, 10 ul içine 2 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin
7. Tampon Koşu: 60 ml 5x MOPS için, 12.3 M formaldehit 54 ml DEPC ile tedavi edilen H ₂ O 186 ml
8. Karıştırarak, 37 ° C'de 2 saat boyunca% 0.1 v / v dietilpirokarbonatla inkübe damıtılmış su ° C: H ₂ O DEPC ile muamele edildi. Otoklav ile sterilize edin.
9. Homojenleştiriciyi temizlenmesi: 1 L temizlik çözeltisi, 25 ml (RBS) ekleyin DEPC_H2O muamele edilmiş ve karıştırma ile eksen 1 dakika immerge. 60 ° C'de 2 saat inkübe ° C. Alüminyum içine DEPC ile tedavi edilen H ₂ O Wrap aracı ile iyice durulayın ve alet kutusuna koydu. Kutusu sarın. Otoklav ile sterilize edin.
10. Elektroforez cihazı Temizleme: cihazı, tepsi ve 15-kuyu tarak yıkayın. % 3 hidrojen peroksit oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. % 100 etanol ile bir kez yıkayın. Hava kuru.
11. Cam temizlik yemekler: tüm gece cam yemekleri RBS 2% temizleyin, daha sonra 200 ° C'de sterilize edilmeden önce distile su ile durulayın

Results

Prosedür Dergisi (Şekil 1) bize saflaştırılmış RNA için cerrahi blok retina örnekleri kurtarmak ve retina dekolmanı transcriptome analiz etmeyi sağlar. Monosit kemotaktik MCP1 gen CCL2, en upregülasyonu ve gen GNAT1, kısa dalga koni opsin OPN1SW ve homeogene CRX (Şekil 2) iletici çubuk fotoreseptör ifade azalma retina dekolmanı sonuçları. GNAT1, OPN1SW ve CRX eş zamanlı olarak indirgenmesi fotoreseptör dejenerasyonu, çubuk ve koni he...

Discussion

Cerrahi blok doku kurtarma için bir prosedürün geliştirilmesi retina dekolmanı transcriptome analizi için gerekli olmuştur. Bir cerrahi bu tip acil durumlarda ve göz doktorlarının çalışma, faaliyet zaman biyolojik bir araştırma programına katılmak için çok az zaman var uygulanan olduğunu dikkate almalıyız. Bu retinektomi da istatistiksel numaraları ulaşmak için daha kolay bir şekilde bir ağ ile çalışmak, böylece her hizmet stokastik gerçekleştirilir. Bu ağ olarak, doku toplama standardizasyon biyolojik analiz başarısı g...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Santrifüj	Beckman Coulter	Aventi J-E
Rotor	Beckman Coulter	JS-5.3
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	LE 80K
Rotor	Beckman Coulter	SW41
Güç kaynağı	Biorad	Pac 3000
PolytronTM	Kinematica	PT 2100	Birlikte Verilir PT-DA 2105:2
Agaroz jel elektroforez cihazı	Biorad	MiniGel Cell GT
Görüntüleme Sistemi	Biorad	GelDoc-It Görüntüleyici
5 ml steril polietilen tüp	Greiner	115261
Steril poliallomer santrifüj tüpü	Beckman Coulter	331372
Kimyasal reaktifler	Sigma		Moleküler biyoloji sınıfı (RNase ve DNaz içermeyen ürünler)
Temizleme Solüsyonu	VWR	RBS
Mikroarray çip	Affymetrix	İnsan U133 artı 2 dizi