Yöntem makalesi

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

DOI:

10.3791/50389

⸱

6 Mayıs 2013

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz adacık antigen spesifik primer CD4 + T-hücrelerinin adoptif transfer yoluyla, iki hafta içinde farenin tip 1 diyabet (tip 1 diyabetin) ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obez olmayan diyabetik (NOD) fare kendiliğinden yaş 12 hafta sonra otoimmün diyabet gelişir ve insan Tip 1 diyabet (T1D) en çok çalışılan hayvan modelidir. Işınlanmış alıcı farelerde hücre transferi çalışmaları T hücreleri bu modelde T1D patogenezinde önemli olduğunu kurduk. Hızla arıtılmış adoptif transfer yoluyla T1D endüklemek için burada basit bir yöntem tarif primer CD4 + NOD.SCID alıcı farelere adacık-spesifik T hücre reseptörü (TCR) BDC2.5 için transgenik pre-diyabetik NOD farelerde T hücreleri. Bu tekniğin en önemli avantajlarından aynı gün içinde, alıcıların ışınlama gerekli değildir, ve tip 1 diyabetin yüksek oranda T hücre transferinden sonra 2 hafta içinde ortaya çıkarılan bir diyabetojenik T hücrelerinin izolasyonu ve evlatlık transferi tamamlanabilir vardır. Böylece, T1D patogenez ve tedavi edici girişimlerin çalışmaları heterojen T hücre popülasyonlarının veya klonlar dayalı yöntemlere göre daha hızlı bir oranda devam edebilirsinizNOD farelerinde diyabet türetilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOD farelerinde kendiliğinden otoimmün diyabet gelişir ve yaygın olarak insan tip 1 diyabetin 1,2 için bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. NOD farelerinde tip 1 diyabetin patogenezi T ve B hücreleri tarafından takip dendritik hücreler ve makrofajlar tarafından Langerhans pankreatik adacık arasında, yaş, 3-4 haftalık başlayarak, infiltrasyonu ile karakterize edilir. Tahribatsız peri-insülit Bu aşama 3 yaş arasında 4-6 ay belirgin diabetes ile sonuçlanan, insülin üreten pankreatik β hücre yavaş ilerleyen yok edilmesini sağlar. 4,5 splenositler, CD4 +, NOD farelerinde diyabet ikinci 6,7 veya CD8 + T hücreleri, 8,9 transferini adacık-reaktif T hücreleri, tip 1 diyabetin patojenezinde merkezi bir rol oynadığını gösteren, bağışıklık sistemi, NOD farelerinde diyabet aracılık ettiği gösterilmiştir. Deneysel koşullara bağlı olarak, diyabet bu çalışmalarda birkaç hafta boyunca, yavaş yavaş alıcı farelerde geliştirilmiştir. Benzer şekilde, çeşitli T hücresi klonları, zaman alıcı ve pahalı bir hesaplayarakdiyabetojenik T hücrelerinin kültürlenmesi, birkaç hafta alıcı farenin 7,10 içine transferinden sonra şeker hastalığı aracılık ettiği bildirilmiştir. CD4 veya CD8-kısıtlı diyabetojenik T hücresi klonları, birkaç laboratuar tarafından türetilen TCRS eksprese eden transgenik farelerin kullanılması ile daha sonra bu farelerin dalak T hücreleri 11-13 alıcıya diyabet aktarmak mümkün olduğunu göstermiştir. Özellikle, BDC2.5 NOD farelerinde kromogranin A, pankreatik beta hücreleri 14-16 bir protein için spesifik olan BDC2.5 TCR için transgenik olan. In vitro-aktif veya verimliliği 11,17-19 değişen yenidoğan veya bağışıklık yetersizliği NOD fareler diyabet transfer açıkça diyabetik veya prediyabetik BDC2.5 farelerin un-aktif tamamen veya fraksiyone dalak hücrelerinde devri.

Bu saflaştırılmış CD4 transgenik kullanan basit bir yöntem + yüksek verim ve müteşekkildi de alıcı farelerde T1D endüklemek için, pre-diyabetik BDC2.5 farenin alınan T hücreleri tanımlamakNCY. Naif, adacık antijene özgü CD4 + T hücrelerinin çok sayıda CD4 floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) TCR transjenik Vβ4 zincirini ifade + CD62L + T hücreleri, bu farelerden izole edilmiştir. Saflaştırılmış transgenik sonra T hücreleri fonksiyonel T ve B hücreleri eksikliği ve insülit ve şeker içermeyen 20 vardır NOD.SCID farenin içine aktivasyonsuz aktarılır. Alıcı fareler T hücre transferinden sonra iki hafta içinde hızla gelişir T1D, gösteren idrar glukoz konsantrasyonları için izlenir.

Heterojen özgünlükleri ile diyabetojenik T hücreleri aktarmak, bizim protokol FACS-sıralaması CD4 + neredeyse sadece diyabetojenik BDC2.5 TCR ifade T hücreleri kullandığı diğer yöntemler aksine. Homojenlikleri bağlı olarak, transfer T-hücreleri (1x10 ~ 6 hücre / fare) sadece çok az sayıda% 100 görülme az 2 hafta içinde hızlı bir tip 1 diyabetin gelişimi için gereklidir. Bizim protokol bir diğer avantajı irradiatio olanalıcı farenin n bazı diğer yöntemler için olduğu gibi gerekli değildir. Bu yöntemin özel bir potansiyel bir sınırlama hem CD4 ve CD8 T hücresi alt ya da özellikle diyabet ve CD8 T hücrelerinin katkı soruşturma izin olmamasıdır.

Açıklanan protokol hedef organa adacık antijen belirli Th hücreleri yuvalandırma müdahalede saf, monospesifik CD4 + T hücreleri, hem de tedavi edici stratejiler aracılığı ile oluşan hızlı bir tip 1 diyabetin gelişimi, çalışmak için yararlı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dalak ve BDC2.5 Farelerin lenf düğümleri alınan T Hücre İzolasyonu

  1. Diyabetojenik CD4 + T-hücrelerinin vericisi olarak 6 haftalık bir pre-diyabetik BDC2.5 dişi farenin kullanın. Idrar glukoz ölçümü (bkz. aşağıda) tarafından belirlenen Fare diyabet arındırılmış olmalıdır.
  2. CO 2 boğulma kullanarak her fare Euthanize ve steril koşullar altında dalak, aksiller ve brakiyal lenf düğümleri kaldırın. Dalak kaldırmak için,% 70 etanol ile kürk ıslatın, sonra kesmek ve cilt geri çekin. Dalak farenin sol tarafında koyu kırmızı organı olarak görülebilir. Küçük makas kullanarak periton bir 1 inç kesi olun ve yavaşça küçük bir cımbız ile merkezinde dalak kavramak. Dikkatlice bağ dokusu ve ekli yağ mümkün Döşeme ve dalak çıkarın.
  3. Buz üzerinde 15 ml konik bir tüp içinde 10 ml Dulbecco's-Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde dalak ve lenf düğümleri toplayın.
  4. Inci kullanarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlayınyavaşça 70 mikron hücre süzgeçler (süzgeç başına bir dalak ve süzgeç başına 4-6 lenf düğümleri) aynı 50 ml konik tüp içine aracılığıyla lenfoid organlara basın steril bir 10 ml şırınga pistonu e sonu.

Bu işlem sırasında, süzgeç hücreleri kurtarma en üst düzeye çıkarmak için, 1 ml DMEM ile birkaç kez her süzgeç yıkayın.

  1. Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 300-400 xg'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine 50 ml konik tüp, toplanan hücre transfer edin.
  2. Kırmızı kan hücreleri lize etmek için, supernatant 5 ml amonyum-klorür Potasyum (ACK) tampon maddesi (pH 7.2) 'de hücrelerin yeniden askıya, ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında ACK hücre süspansiyonu inkübe edin.
  3. ACK-hücre süspansiyonu, 10 ml DMEM ekleyin ve yukarıdaki gibi santrifüj tüpü. 10 ml DMEM içinde bir kez hücre pelletini yıkayın.

2. Diyabetojenik CD4 Floresan ile aktive Hücre Ayırma + BDC2.5 fareler ile T hücrelerinin

  1. 5 ml FACS s yeniden askıya hücreleritampon temi ve tripan mavi boya dışlama tarafından canlı hücreler (bir faz kontrast mikroskop ve hemasitometre kullanarak) sayısını.
  2. FACS tamponu kullanarak, 5 x 10 7 hücre / ml hücre süspansiyonu hacmi ayarlanır. ~ 1 çıkarın x 10 boyama kontrolü başına 6 hücre (1 leke, 3 adet tek kişilik lekeleri). Aktif olmayan transgenik CD4 + anti-CD4 T hücreler (APC), bir anti-TCR Vβ4 (FITC), 15 ml lik tüp içinde bir anti-CD62L (PE) monoklonal antikor (mAb) için örnek Leke. Karanlıkta 4, 20-30 dakika için üretici tarafından önerilen mAb konsantrasyonu ° C kullanarak hücre boyama gerçekleştirin.
  3. > 3X boyama reaksiyon hacmi, FACS tamponu ile ve numune bir leke kontrol yıkayın. (1-2 x 10 7 hücre / numune sıralama için ml ve 300 ul tek leke kontrolleri için) ve buz üzerinde mağaza sonraki kadar 300-400 xg tüp santrifüj, süpernatant kaldırmak ve FACS tampon hücrelerin yeniden askıya adım.
  4. 35 mikron hücre aracılığıyla hücre örneği geçmeksüzgeç kapaklı tüp hücre kümeleri kaldırmak için. CD4 için örnekleri sıralamak + TCR Vβ4 + CD62L + eğitimli bir operatör ile hücre sıralayıcı hücreleri. 15 ml'lik bir tüp içinde 3 ml DMEM içine kriteri hücreleri toplamak. 2 x 10 4 toplam olay / sn bir tür oranında 1,5 x 10 8 hücre (3 donör farelerden elde edilen hücrelerin yaklaşık sayısı) sıralamak için, kurulum dahil olmak üzere 2.5-3 saat, izin verin. Bekleyin ~ 2.5 x 10 6 sigara aktif transgenik CD4 + hücre sıralama sonra fare başına T hücreleri.
  5. Sıralama sonunda sıralama kriteri hücrelerinin mutlak sayısı kaydedin ve 300-400 x g 7 dakika onları santrifüj. Süpernatant atılır ve yeniden askıya hücreleri (2 x 10 6 hücre / ml) içinde steril fosfat tamponlu adoptif T hücre transferi tuzlu su (PBS) (Mg2 + / Ca2 + içermez).

3. BDC2.5 fareler ile diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer + T Hücreleri

  1. Yeniden askıya FACS-saflaştırılmış CD4 hafifçe, bir 1 ml şırınga ve 18-1 ½ iğne kullanarak +1 ml şırınga T hücreleri ve yükleyin. Enjeksiyon için hazırlanırken, 18-1 yerine ½ iğne bir 27 ile ½ iğne.
  2. Bu davranış bakım sergilenirken kadar bir ısıtma lambası için 6-8 haftalık dişi NOD.SCID alıcı fareler Açığa.
  3. Bir süzgeç olarak alıcı farenin sınırlamaya ve enjeksiyon dezenfekte etmek için% 70 (v / v) etanol ile kuyruk silin.
  4. Lateral kuyruk damar birine 1-2 x 10 6 FACS sıralama kriteri hücre / fare (en fazla 500 ul PBS) enjekte edilir.

Piston zorlamayın. Iğne damar uygun bulunuyorsa, enjeksiyon hemen hemen hiçbir direniş ile gerçekleşecek.

4. Hiperglisemi için Alıcı Fare İzleme ve T1D

  1. T hücre transferinden sonra beş gün başlayan, NOD.SCID alıcı fareler üreticinin talimatlarına göre reaktif şeritler (Bayer Diastix) kullanarak yüksek idrar glukoz için günlük olarak takip edilmektedir. Birbirini takip eden iki purin ile fareninE şekeri> 250 mg / dl 'diyabetik olarak kabul edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulgularımız başta pankreas lenf düğümleri gibi ikincil lenfoid organlara eve T hücreleri için önemlidir CD62L, ifade transgenik BDC2.5 hücrelerin izolasyonu göstermektedir. Bulgularımız hızlı aktarmak ve verimli NOD.SCID alıcı farelere T1D için bu monospesifik T hücre popülasyonunun güçlü yeteneğini göstermek.

Diyabetojenik CD4 + BDC2.5 farenin alınan T hücrelerinin izolasyonu, Şekil 2'de gösterilmiştir. Toplanmış, dalak ve lenf düğümleri yaklaşık 5 x 10 7 hücrel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip 1 diyabetin, NOD farelerinde diyabet veya diyabetojenik T hücresi klonları elde TCRS için transgenik farelerden dalak hücreleri tamamen veya T hücre alt adoptif transfer yoluyla verimliliği değişen alıcı farelerde uyarılabilir. Bu tarifnamede NOD.SCID farelere FACS saflaştırılmış CD62L + BDC2.5 transgenik CD4 + T hücreleri,% 100 aktarma oranı iki hafta içinde alıcı farelerde T1D ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunulmaktadır.

BDC2.5 T hücre transferi modelinin özel avantajlar s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm fareler Penn State Kurumsal Hayvan Bakım kurallarına uygun ve Kullanım Kurulu Tıp spesifik patojen free (SPF) tesisinin Penn State College ev sahipliği edildi.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Dr teşekkür ederim. Yararlı yorumlar için Robert Bonneau ve Neil Christensen.

Bu çalışma Tıp fonların Pennsylvania State Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BDC 2.5 TCR transgenik NOD fareleri (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)JAX004460
BAŞINI SALLA. SCID fareleri (NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Themo ScientificSH30022.01
Bayer DiastixFisher ScientificAM2803
15 ml konik tüplerFalcon352095
50 ml konik tüplerFalcon352070
Steril cerrahi cımbız
Steril küçük çift makas
Steril büyük çift makas
70 μ m hücreli süzgeçlerFisher Scientific22363548
35 μ M Hücreli Süzgeç Kapağı TüpleriBD Biosciences352235
Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) tamponu0.15 M NH4< / sub>Cl, 1 mM KHCO3, < / sub>0.1 mM Na2< / sub>EDTA, pH 7.2 < dHsub>2< / sub>O
BD FACSFlowTM kılıf sıvısıBD Biosciences342003
FACS boyama tamponuPBS, 0,2 mM EDTA, %0,5 BSA/FCS, filtre sterilize edilmiş
Faz kontrast mikroskobu
Tripan mavisi
Hemositometre
Anti-CD4 (APC) mAbBiolegend1005616klonu RM4-5
Anti-TCR V & # 946; 4 (FITC) mAbBD Biosciences553365klonu KT4
Anti-CD62L (PE) mAbBD Biosciences553151klonu MEL-14
Hücre sıralayıcıBD Biosciencese. BD FACSAria III
Isı lambası
Fare kısıtlayıcı
1 ml şırıngaBecton Dickinson309602
18-1½ gauge iğneler (steril)Becton Dickinson305196
27½ gauge iğneler (steril)Becton Dickinson305109

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
  2. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
  3. Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
  4. Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
  5. Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
  6. Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
  7. Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
  8. Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
  9. Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
  10. Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
  11. Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
  12. Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
  13. Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
  14. Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
  15. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  16. Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
  17. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
  18. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
  19. Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
  20. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
  21. Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
  22. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
  23. Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
  24. Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Adaptif T H cresi TransferiCD4 T H cresi Safla t rmaNOD SCID FarelerBDC2 5 Transgenik FarelerH cre Ay klama ProtokolKuyruk Venine Enjeksiyondrar Glukoz zlemiLenf D m HasadDalek zolasyonu

İlgili makaleler