Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Özet

Mikroplaka dayalı işlemler hücre dışı enzim aktivitesi, kolorimetrik veya florometrik analizi için tarif edilmiştir. Bu işlemler yönetilebilir bir süre içinde çevre örneklerin çok sayıda bu tür aktivitenin hızlı analizi için izin verir.

Özet

Doğal ortamlarında besin döngüsü ve karbon işleme çok mikroorganizmaların serbest hücre dışı enzimlerin aktivitesi ile gerçekleşir. Bu nedenle, bu hücre dışı enzimlerin aktivitesinin ölçülmesi gibi organik madde ayrışma ya da azot ve fosfor gibi mineralizasyon ekosistem seviyesi süreçlerin oranları içine bakış açısı verebilir. Çevresel numunelerde hücre dışı enzim aktivitesi deneyleri, genellikle, yapay kolorimetrik veya florometrik substratlara örnekleri maruz bırakılması ve substrat hidroliz hızı izleme içerir. Burada kısa bir süre içinde örnekleri çok sayıda analizine izin bu işlemler için mikrolevha tabanlı yöntemleri açıklanmaktadır. Örnekler mikro blok mikro ya da derin kuyu 96 oyuklu içinde yapay alt-tabakalar ile reaksiyona girmesine izin verilir ve enzim aktivitesi, daha sonra, tipik bir mikro-Reade kullanılarak elde edilen son ürünün emilim veya floresan ile belirlenirr veya florimetre. Bu gibi yüksek üretim işlemleri uzaysal olarak ayrı bölgelerde veya ekosistemlerin arasında karşılaştırma sağlamak değil, aynı zamanda esasen genel olarak, numune başına gerekli reaktif hacimlerini azaltarak Bu tahlillerin maliyetini azaltmak değil.

Giriş

Bakteri ve mantar gibi mikroorganizmaların hücre dışı enzimlerin üretimi ile kompleks organik bileşiklerin besin ve karbon elde edilir. Bu enzimler, tipik olarak hücre içine alınabilir daha küçük alt-birimler halinde polimerler hidrolize. Bu nedenle, ekolojik bir seviyede, bu mikrobiyal hücre dışı enzimler besin mineralizasyonu ve doğal ortamlarında olarak ortaya çıkan organik madde ayrışımı daha sorumludur. Bu tür sellobiyohidrolaz (CBH) ve β-glukosidaz gibi enzimler mikrobiyal alımı ve asimilasyonu için kullanılabilen bir karbon taban malzeme oluşturur ^1,2 Selülozun glukoza hidroliz, katalize etmek için uyum içinde selüloz bozulması ve çalışmaları için önemlidir. Enzim fosfataz organofosfatlar çözünür inorganik fosfat gruplarını, esas olarak fosfat mineralleştirici ve en çok ³ organizmalar ile kullanım için uygun hale serbest bırakır. Örneğin N-acetylglucosaminidase (Nagase) gibi diğer enzimler, importan vardırkitin bozulması t karbon ve mikrobiyal edinimi ⁴ için kullanılabilir hem de azot yapabilirsiniz.

Doğal ortamlarında mikrobiyal hücre dışı enzim etkinliğinin test edilmesi için prosedürlerin bir yapay p-nitrofenil (p NP) bağlanmış alt-tabakalar, orjinal toprak fosfataz aktivitesi ⁵ tespit etmek için geliştirilmiş bir yaklaşım kullanılmasıdır. Bu yaklaşım yapay alt-tabaka, uygun bir enzim ile hidrolize edildiğinde serbest renkli bir son ürün, p-nitrofenol, tespit dayanır. P-nitrofenol, daha sonra yaklaşık 400-410 nm'de absorbans ölçümü ile kolorimetrik tayin edilebilir. Bu yöntem, bu yana böyle Nagase ⁶ gibi diğer enzimleri tespit etmek için uygulanmıştır ve toprak ve sediment ^7-9 mikrobik hücre dışı enzim aktivitesi şu an çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır.

Orjinal oldu alternatif bir yaklaşımy ^10,11 4-metilumbelliferon (MUB) bağlanmış alt-tabakaların kullanan su ortamlarında hücre dışı glukosidaz aktivitesini değerlendirmek için geliştirilmiştir. (4-metilumbelliferon) serbest son ürün yüksek floresan ve 360/460 nm civarında bir uyarım / emisyon ayarına sahip bir flüorometre kullanılarak tespit edilebilir. MUB bağlanmış yapay alt-tabakalar arasında çeşitli p NP-kolorimetrik alt-tabaka prosedürü kullanılarak analiz edilebilir olarak en az bir çok enzim (örneğin, β-glukosidaz, selobiyohidrolaz, Nagase, fosfataz) aktivitesinin fluorometrik ölçümü olanak mevcuttur. Örneğin protein-bozucu lösin aminopeptidaz gibi diğer mikrobik hücre dışı enzimler, 7-amino-4-metilkumarin (COU) bağlanmış alt-tabakalar kullanılarak florometrik olarak analiz edilebilir. MUB-ve çiftler bağlanmış alt tabakalar hem de çeşitli karasal ve su örnekler ^12,13 enzim aktivitesini belirlemek için kullanılmıştır.

Önceki çalışmalar descri varkenIBED florometrik ya da kolorimetrik mikro hücre dışı enzim aktivitesi ¹⁴ belirlemek için yaklaşımlar, bu tür testleri yapmak için nasıl açık bir bakış açısı için bir ihtiyaç vardır. Burada kolorimetrik p NP-bağlanmış alt-tabakalar yaklaşım kullanılarak topraklar ve sediment ve floresan MUB-bağlanmış alt-tabakalar tekniği kullanılarak, doğal sularda, hücre dışı enzim aktivitesinin analizi için yüksek verimli mikro teknikleri yapılması için işlemleri göstermektedir. Bu enzimler, sırasıyla, karbon, azot, fosfor ve bisiklet bağlı olabilir olarak biz β-glukosidaz, Nagase ve fosfataz etkinliklerinin ölçümü odaklanır. Bununla birlikte, burada açıklanan usuller farklı yapay substratlar kullanılarak diğer hücre dışı enzimler ölçümüne uygulanabilir.

Protokol

Topraklar ve tortulları Ektraselüler Enzim Aktivitesi kolorimetik Analizi

1.. Enzim Aktivitesi Colorimetric Analizleri İçin Yüzey ve Tampon Çözümleri hazırlanması

1. 50 ml 0.1 M asetik asit (2.87 ml su içinde 500 ml buzlu asetik asit) karıştırılarak 50 mM asetat tampon (pH 5,0-5,5) hazırlanması 150 ml 0.1 M sodyum asetat ve 200 ml damıtık _H2O Gerekirse 0.1 M asetik asit ile 5,0-5,5 'ye ayarlayın.
2. Damıtık _H2O içinde 1 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi hazırlayın
3. 50 mM asetat tamponu içinde p NP-bağlanmış alt tabaka çözelti hazırlayın. Fosfataz, 50 mM asetat tamponu içinde 5 mM p NP-fosfat hazırlanması test etmek için, β-glukosidaz 5 mM p NP-β-glukopiranosid hazırlamak tahlil için Nagase 2 mM PNP-β-N-asetilglukosaminid hazırlamak için tahlil. Steril 15 ml veya 50 ml santrifüj tüplerine tüm alt-tabaka solüsyonları hazırlayın. Solutions 2-3 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

2. P NP Konsantrasyon Absorbans dönüştürme bir Standardının Belirlenmesi

1. 50 mM asetat tamponu içerisinde p-nitrofenol standart çözeltiler hazırlayın. Konsantrasyonlar mM 0,025-1 arasında olmalıdır.
2. Açık bir 96 çukurlu mikrolevhanın her transfer konsantrasyonunun 100 ul üç çoğaltır. Her bir oyuğa, H ₂ O damıtılmış 10 ul 1 M NaOH ve 190 ul ekleyin.
3. Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 410 nm'de absorbansı.
4. 0.3 ile standart eğri Çarp konsantrasyonları 300 ul reaksiyon hacmi başına umol p NP olsun. P NP umol emmeye karşı bir eğri çizilir. Eğrinin eğimi her bir Enzim reaksiyonu p NP umol absorbans ilgili olacaktır dönüşüm faktörü (C) olarak hizmet vermektedir.

3. Enzim Testi yürütmek

1. Toprak, bir concentr bir steril 15 ml santrifüj tüpüne test edilecek her numunenin bir bulamaç hazırlamakyaklaşık olarak 1 g / ml ^-1 50 mM asetat tamponu kullanarak ation. Sediment için, bulamaç kolayca pipettable yapmak için yeterli asetat tamponu ilave edin. Gerekli bulamacın tam hacmi, enzimlerin tahlil sayısına göre değişir, fakat 5 ml 'lik bir minimum tavsiye edilir. Vortex toprak veya tortu her kümeleri dağılana ve nihai hacim dikkat kadar, her bulamaç.
2. Yeniden girdap her bulamaç ve hemen, 96-çukurlu derin kuyu blok (Şekil 1) üzerine, altı kuyu her birine 150 ul pipetle. Bu süspansiyon içinde kir partikülleri tutmak için iyice ve sık sık girdap önemlidir. Bir alt-tabaka bir kontrol olarak hizmet etmek için boş blok başına en az iki kuyu bırakın. Not: Toprak çamurlar ipuçları tıkama eğilimi olarak önce pipetle için makas ile pipet ipuçları ucunu klibi. Denenecek her bir enzim için, bir 96-yuvalı blok hazırlayın.
3. Bir pipet rezervuar içine asetat tamponu, yaklaşık 5 ml dökün ve l için 150 ul tampon eklemek için bir 8 kanallı pipet kullanınast Her numunenin iki kuyu (bu örnek tamponu kontroller olacaktır) ve iki alt-tabaka kontrol havuzlarını (Şekil 1)
4. Bir pipet rezervuara uygun p NP-alt-tabaka çözeltisi, yaklaşık 10 ml dökün ve (Şekil 1) her bir numune ilk dört kuyu ve iki alt-tabaka kontrol kuyuları için alt-tabaka çözeltisi 150 ul eklemek için bir 8 kanallı pipet kullanın. Reaksiyon kısa zamanda substrat çözeltisi ilave edilir olarak başlar olarak zaman unutmayın.
5. 0.5-4 saat boyunca oda sıcaklığında (22 ° C) inkübe edin. Tam Kuluçka süresi aktivitesi örneklerde seviyesi ve analiz edilecek enzim bağlı olarak değişir. Nagase ve diğer enzimler> 2 saat inkübasyon süresi gerektirir, oysa en toprak ve tortular için, fosfataz ve β-glukosidaz, 0.5-1.5 saat arasında bir bekleme süresi gerektirir.
6. Deneyleri absorbansı okumak için mikroplakalarda net 96-iyi hazırlamak kuluçka iken. (Örneğin, her bir E için her bir blok için bir derin bölmeli mikroplaka hazırlanmasınzyme) deneye tabi tutuldu. Pipet 10 ul 1 M NaOH ile mikrolevhanın her oyuğuna damıtılmış su 190 ul. Not: NaOH enzimatik reaksiyonu yavaşlatır ve reaksiyon sırasında ortaya çıkan p NP rengini artırır pH yükseltir.
7. İnkübasyondan sonra, kir partikülleri peletleştirmek için 5 dakika boyunca 2,000-5,000 xg'de 96 oyuklu blok santrifüj.
8. Pelet önlemek için dikkatli olmak, her bir kuyunun 100 ul çekilme için bir çok kanallı pipet kullanın, ve hazırlanan açık 96-kuyu mikrolevhadaki iyi gelen transfer.
9. Mikrotabak okuyucu açın ve gerekli yazılımları kurmak. 410 nm'de absorbansı. Belirli bir oyuk absorbansı, plaka okuyucusu doğrusal saptama sınırının üzerinde, su ve yeniden ölçüyle ki kuyu 1:01 seyreltin edin. Absorbans hala çok yüksek ise, deney daha kısa bir kuluçka süresi ile tekrar edilmelidir.

4. Numune kuru kütlesinin belirlenmesi

1. Her sampl pipetle 1 ml önceden tartılmış bir alüminyum tava içine e bulamaç.
2. 48 saat için bir 75 ° C kurutma fırınında kurutulur ve tartılır. Bulamacın 1 ml toprak ve tortu kuru kütlesi elde etmek için bu değerden tencerenin ağırlığını çıkarın. Enzim deneyinde de her bir göze ilave 150 ul numune kuru kütlesi belirlemek için 0.15 'lik bir faktör ile çarpın.

5. Kuru Toprak Kitle veya Sedimentin başına Enzim Aktivitesi hesaplama

1. Numune deney emiliminden numune kontrol absorbansı çıkartılmasıyla her numunenin absorbansı son hesaplayın. Alt-tabaka kontrol yüksek absorbans varsa (yaklaşık> 0.060), daha sonra da bu çıkarın.
2. Umol hr ^-1 g kuru kütle ^-1 denklemden enzim aktivitesi hesaplayın:

Enzim aktivitesi, son emme / (C x inkübasyon süresi x numune kuru kütle)

Doğal Sularda Ektraselüler Enzim Aktivitesi Floresan Analizi

Enzim Aktivitesi Florimetrik Analizleri için tle "> 1. Yüzey, Standard Hazırlama ve Tampon Çözümleri

1. Steril ve fizyolojik olarak uygun bir alt-tabakanın eritilerek MUB bağlanmış alt-tabakalar (örneğin, 4-MUB-β-glukopiranosid, 4-MUB-fosfat, 4-MUB-N-asetil-β-D-glükozaminit) 200 uM solüsyonları hazırlayın (otoklav) damıtılmış steril 15 ml veya 50 ml santrifüj tüplerine _H2O. Işık dahil değildir ve kullanım öncesinde buzdolabı içinde depolamak için bir alüminyum folyo içinde tüpler sarın. Bu şekilde depolandığında Elyaf en azından 1 hafta için kararlı olmalıdır.
2. Steril damıtılmış _H2O içinde 100 uM 4-metilumbelliferon 'lik bir stok solüsyonu yaparak MUB standardı hazırlayın Mağaza kehribar veya folyo sarılı şişede buzdolabında. Kullanılmadan hemen önce, enzim tahlilleri için 10 uM çalışan bir solüsyonun hazırlanması için steril, _H2O içine 1/10 ile 100 uM stok solüsyonu seyreltik.
3. NaHCO <8.4 g çözülerek 100 mM bikarbonat tamponu içinde bir stok çözelti hazırlayınsub> 3 1 LH ₂ O ve otoklav içine. Enzim deneyleri için 5 mM bir çalışma çözeltisi oluşturmak için gerekli gibi steril _H2O içine bu stok solüsyonu 1/20 seyreltin.

2. 96-Well siyah bir mikroplakanın ilgili düzenleme Su Örnekleri

1. Şekil 2'de gösterilen örnekte, aşağıdaki her bir enzim için bir mikrotabla düzenleyin. Yeterli çoğaltma, standartlar ve kontrol sağlayan, bu işlem, bir 96 oyuklu siyah bir mikroplakanın üzerinde dokuz su örnekleri için, tek bir enzimin aktivitesini tahlil unutmayın.
2. Bir pipet rezervuar içine ilk numunenin yaklaşık olarak 5 ml dökün ve mikro-(ler) in ve sütun 1 içindeki bütün gözlere içine ul pipette200 için bir 8 kanallı pipet kullanın. Kullanılmış pipet ipuçları atın ve sütunları 1-9 doldurmak için her su numunesi için gerektiği gibi tekrarlayın.

3. Örnek kurma, Standart, Söndürme ve Yüzey Kontrolleri

1. Standart numuneler, hesaba kontrolleri ayarlayıns, alt-tabaka ve numuneler ile aynı siyah bir mikroplakanın (Şekil 2) üzerinde su verme.
2. Örnek kontrol numunesi, su ve bikarbonat tampon içeren ve aktivite hesaplamalarda kullanılan değil, deney süresi boyunca tutarlılık okuma gösterecektir. Söndürme kontrol numunesi, su ve floresan etiket standart bir miktarı oluşur ve numune su içinde floresans kırınım ölçmek için kullanılır. Alt-tabaka ve alt-tabaka, standart kontrol-bağlanmış ya da standart floresan etiket, sırasıyla, ve bikarbonat ya da tampon maddesi oluşur.
3. Temiz bir pipet rezervuar içine 5 mM bikarbonat tamponu içinde yaklaşık olarak 5 ml dökün. Pipet mikro kuyulara tampon maddesi 50 ul 1 satırlar 9 arasındaki D ve E, iki örnek başına numune kontrol kuyuları çoğaltmak oluştururlar. Değişim pipet uçları o satırlar 10 ile 12 kuyu bikarbonat tampon 200 ul transfer A ve H.
4. Li karartma veya kapatarak ortam ışıklarını azaltınFloresan standart olarak ghts ışığa karşı hassastır.
5. Temiz bir pipet rezervuara 10 uM 4-metilumbelliferon yaklaşık olarak 5 ml dökün. Pipet mikro kuyulara 50 ul Row H 1 ile 12 arasındaki ve kuyulara satırlar G ve F olarak 1 ile 9 arasındaki bir örnek için söndürme kontrol ve genel olarak standart üç kontrol çoğaltır oluştururlar. Karanlıkta mikroplağı koymayın veya Mub ışık bozulmasını azaltmak için opak kapak ile kapatın ya.
6. Florometrede açın ve set-up tabakayı eklemeden önce okumaya hazır olması için gerekli yazılımları. Not: Bazı florimetre ampuller 3 dakika veya daha fazla bir ısınma süresi gerekebilir.
7. Temiz bir pipet rezervuarına uygun MUB bağlanmış alt-tabaka (örneğin, 4-MUB-fosfat) yaklaşık 5 ml dökün. Her numune için üç suret tahlilleri alt-tabaka ve üç kontrol oluşturmak üzere 1 satırlar B ve C, 1 ile 9 Sıra A 12 ile mikro kuyulara 50 ul pipet ve kuyu içine bir 12 kanallı bir pipet kullanın. Immediately 4.1, kayıt floresan adıma geçin.

4. Kayıt Floresan

1. Hemen mikroplakaya ilave edilmesinden sonra alt-tabaka ilk floresans okunur. Floresan okuduktan sonra, ya oda sıcaklığında (22 ° C) de inkübe mikroplak koyu veya MUB ışık bozulmasını azaltmak için bir opak bir kapak ile kapatıldı.
2. Bir su numune içinde maksimum potansiyel enzim aktivitesini ölçmek için gerekli olan kuluçka süresi numune içindeki enzim konsantrasyonuna bağlı olacaktır. Tahlil tamamlanmadan önce bu bilinmeyen olduğu için, mikro birden fazla zaman adım okunmak üzere olacaktır. Belirli enzimler için çok yüksek bir aktiviteye sahip numuneler, 10 dakika önce, tepe olsa da tipik olarak, 1 saat boyunca 10-15 dakika aralıklarla okuma, birçok enzim için kabul edilebilir.
3. En az 1 saat süre ile belirlenen aralıklarla mikrotablada floresan okuma. Mikrolevha kapalı tutmak için emin veya okuma arasındaki karanlıkta oluns.

5. Su hacmi başına Enzim Aktivitesi hesaplama

1. Ilk numune floresan (kuyu D ve E), ortalama ortalama son numune floresan (kuyular AC), ortalama standart floresan (kuyu H10-11), ve ortalama kontrol floresan söndürülmesi (kuyu: Her bir zaman aralığı her bir numune için hesaplanır FG).
2. Her bir zaman aralığı için, nmol saat enzim aktivitesinin hesaplanması ^-1 mi ^-1 denklemle:

Enzim aktivite = (örnek floresan demek - ilk örnek floresan ortalama) / (() hr zaman (x) 0.2 ml (standart floresan) x ortalama / kontrol floresan gidermek ortalama (standart floresan / 0.5 mol) x ortalama)

3. Her zaman adımı için hesaplanan etkinlik değerleri inceleyin. En yüksek etkinliği olan zaman aşama son potansiyel aktiviteyi belirlemek. Etkinlik değerleri artmaya devam ederse daha sonra zaman adımları gerekli olabilir; aktivite değerleri Throug düşersemhout çalıştırmak tabii ki, o kısa zaman adımlarla yeniden çalıştırın. Final aktivite tabaka tüketilen saat ^{-1 -1} ml nmol'ü olduğunu ancak saat ^-1 L ^-1 umol olarak ifade kadar ölçeklendirilebilir.

Sonuçlar

Topraklar ve su çökeltiler genellikle bağlı mikrobiyal toplulukları (biyofilm) parçacıkların yüzeyi üzerinde artan bir sonucu olarak, hücre dışı enzim etkinliğinin kayda değer bir düzeyde vardır., Bu etkinliği, bir üçüncü yüzey tortu elde edilen partikül büyüklüğüne bağlı olarak değişir kadar 3: Şekil kuzey Mississippi, ABD'de sipariş akışı. Bir önceki çalışmada bu akımdan tortu partikülleri üzerinde bakteri topluluklarının kendi toplum yapısının moleküler analizine göre üç ayrı gruba ayrılabilir göster...

Tartışma

Toprak ve tortular mikrobiyal hücre dışı enzimlerin çeşitli aktivitesini belirlemede besin mineralizasyon ve organik madde işleme ¹⁷ oranlarında yararlı açılımlar sağlayabilir. Ancak, toprak kendi nem düzeyleri değişebilir, bu nedenle toprak kuru ağırlık aktivitesi standart önemlidir. Bu sadece enzim aktivitesinin ölçülmesi dışında (tipik haliyle iki gün) ek bir kuruma adımı gerektirir. Bu nedenle, ani sonuçlar yakın sağlamak su örneklerdeki enzim aktivitesi deneyleri aksine, toprak ve sedimanlarda enzim akti...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
REAKTİFLER VE MALZEMELER
>Buzlu asetik asit			Çeşitli tedarikçiler
Sodyum asetat			Çeşitli tedarikçiler
Sodyum hidroksit			Çeşitli tedarikçiler
p-Nitrofenol	Fisher	BP612-1	Alternatifler mevcut
p-Nitrofenil (pNP)-fosfat	Sigma	N3234	pNP-substrat
pNP-β-glukopiranosid	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-asetilglukozaminide	Sigma	N9376	p NP-substrat
Şeffaf 96 oyuklu mikroplakalar	Fisher	12-563-301	Alternatifler mevcut
96 kuyulu derin kuyu blokları	Costar	3958	Alternatifler mevcuttur
Alüminyum tartım tavaları			Çeşitli tedarikçiler
Steril 15 ml santrifüj tüpleri			Çeşitli tedarikçiler
Steril 50 ml santrifüj tüpleri			Çeşitli tedarikçiler
4-Metilumbelliferon	Sigma	M1381
4-Metilumbelliferil (MUB)-fosfat	Sigma	M8883	MUB-substrat,
4-MUB-glukopiranosid	Sigma	M3633	MUB-substrat
, 4-MUB-N< / em>-asetilglukozaminid	Sigma	M2133	MUB-substrat
Sodyum bikarbonat			Çeşitli tedarikçiler
Siyah 96 kuyulu mikroplaka	Costar	3792
Pipet haznesi			Çeşitli tedarikçiler
EQUIPMENT
>Santrifüj	Eppendorf	5810R
Santrifüj rotoru	Eppendorf	A-4-81	Mikroplakalar/derin kuyu blokları için
Mikroplaka okuyucu	BioTek	Synergy HT	Alternatif alternatifler mevcuttur
Mikroplaka florometre	BioTek	FLx 800	Alternatif olarak mevcuttur
8 kanallı pipetleyici			Çeşitli tedarikçiler