Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Summary

Nötrofiller, kan içinde en bol bulunan lökositlerin vardır. Nötrofiller proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi transkripsiyonel düzenlenir fonksiyonları sahip. Bu işlevler izole çekirdeklerinde flow sitometri ile nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlar Burada sunulan yöntem ile ele alınabilir

Abstract

Nötrofiller periferik kanda en bol lökosit vardır. Bu hücreler böylece mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olma, inflamasyon ve enfeksiyon sitelerinde görünmesini ilk. Nötrofiller gibi fagositoz, parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve reaktif oksijen türlerinin üretimi gibi önemli antimikrobiyal fonksiyonları sahip. Bu önemli savunma işlevlerine ek olarak, nötrofillerin proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi enfeksiyonuna yanıt olarak diğer görevleri yerine getirir. Sitokinler enfeksiyonu temizlemek yardımcı olan diğer lökositler işe ve apopitoz inhibisyonu nötrofil enfeksiyon yerinde uzun yaşamalarını sağlar. Bu işlevler, transkripsiyon seviyesinde düzenlenir. Nötrofiller kısa ömürlü hücreler çünkü herhangi bir verimli olduğu için Bununla birlikte, bu hücreler içinde transkripsiyonel yanıtlar düzenlenmiş bir çalışma geleneksel raportör gen yöntemler ile gerçekleştirilemezNötrofil transfeksiyon için cient teknikleri. Burada, flow sitometri ile izole ve immunolabeled çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlayan basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Biz insan periferik kan saf nötrofilleri izole teknikleri tanımlamak, anti-reseptör antikorları ile bu hücreleri uyarmak yalıtmak ve immunolabel çekirdekler ve flow sitometri ile çekirdekler analiz. Yöntem başarılı bir şekilde nötrofiller ve diğer hücre türleri çekirdeklerinde NF-KB ve Elk-1 nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, hücre tiplerinde izole edilen çekirdeklerin içinde transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu analiz etmek için bir seçenek oluşturmaktadır.

Introduction

Nötrofiller, periferik kan ^1. en bol bulunan lökositlerin vardır. Inflamasyon ve enfeksiyon nötrofiller sırasında onlar savunma ² ilk satırı olarak hareket nereye etkilenen sitesinde görünmeye ilk hücrelerdir. Nötrofiller fagositoz, reaktif oksijen türlerinin üretimi, degranülasyonu tarafından parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve ^4,5 proinflamatuar sitokinlerin üretimi dahil olmak üzere birçok antimikrobiyal mekanizmaları ³ sahiptirler. Nötrofiller hızla çeşitli hücre yüzey reseptörler aracılığıyla aktif olsun kısa ömürlü hücrelerdir. Nötrofiller, kısa ömrü nedeniyle terminali hücreler sayılır ve inflamatuar süreç ⁶

Protocol

1. İnsan Kanı gelen Nötrofiller İzolasyonu (PMN)

1. Pıhtılaşma önleyici olarak heparin (10 U / ml) ile 20 ml insan kanı kullanın. Kan venopuncture tarafından sağlıklı yetişkin gönüllüler toplanmıştır. UNAM - Tüm deneyler Instituto de INVESTIGACIONES Biomédicas de Biyoetik Komitesi onayı altında yapılmıştır.
2. 15 ml konik santrifüj tüpü içine PBS içinde% 6 dekstran T500, 2 ml koyun ve kan 10 ml eklenir. Ters tüp ile iki veya üç kez karıştırın ve eritrosit sedimantasyon için izin vermek için 45 dakika bekletin.
3. Taze bir 15 ml konik santrifüj tüpünde 5 ml Ficoll-Paque koydu.
4. Sedimanlaşmış eritrositler üzerinde oluştuğunu lökosit zengi....

Results

Saflaştırma yöntemi burada açıklanan genellikle% 95 (Şekil 1A) daha büyük saflık ile uyarılmamış nötrofiller (PMN) sağlar. İzole PMN sonra spesifik monoklonal antikorlar ile çapraz bağlama belirli reseptörler ile stimüle edilebilir. Biz Fc reseptörleri ve integrinler (Şekil 1B) ile PMN canlandırmıştır. Bir kez uyarılan PMN lize ve çekirdekler yüksek verimle izole edilmektedir. Çekirdekler sonra bu özel antikorlar ile nükleer faktör kappa B (NF-KB) (Şekil 1B) gibi, belir.......

Discussion

Burada anlatılan arınma yöntemi kısa bir süre içinde% 95 (mikroskobik gözlem yoluyla belirlenmiştir), daha yüksek saflıkta uyarılmamış nötrofillerin izolasyonu (PMN) verir. İkincisi tamamen lize değilseniz Bazen nötrofiller eritrositler kirlenmiş olabilir. Eritrositler ve PMN kolayca flow sitometri ile farklı hücre popülasyonlarının olarak ayırt edilebilir çünkü bu, genellikle, teknik etkilemez. İzole PMN sonra spesifik monoklonal antikorlar ile çapraz bağlama belirli reseptörler ile stimüle edilebilir. Aslında, PMN da .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Heparin	PiSA (Meksika)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Danimarka)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodyum klorür	Sigma	S7653
Sodyum fosfat monobazik	Sigma	S9638
Sodyum fosfat dibazik	Sigma	S9390
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraksiyonu V
HEPES	Sigma	H3375
Potasyum klorür	Sigma	P9541
Magnezyum klorür susuz	Sigma	M8266
DL- ditiyotreitol (DTT)	Sigma	D9163
Tripan Mavisi (% 0.4 çözelti)	Sigma	T8154
Paraformaldehit	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal sığır serumu (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoklonal antikor IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	İnsana özgü anti-FcRII (CD32)
Monoklonal antikor 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	İnsana özgü anti-FcRIII (CD16)
Monoklonal antikor TS2/16	Dana Farber Kanser Araştırma Enstitüsü (Boston, MA)	Dr. Martin Hemler tarafından bağışlandı	İnsana özgü anti-β 1 integrin (CD29)
Monoklonal antikor IB4	Üniversitesi, San Francisco	Dr. Eric J. Brown tarafından bağışlanmıştır	İnsana özgü anti-β 2 integrin (CD18)
F(ab')2 keçi anti-fare IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-konjuge F(ab')2 keçi anti-fare IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-konjuge F(ab')2 keçi anti-tavşan IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κ B p50	Santa Cruz Biyoteknoloji (Santa Cruz, CA)	sc-114	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-NF-&# 954; B p65	Santa Cruz Biyoteknoloji (Santa Cruz, CA)	sc-109	Tavşan poliklonal antikoru
EQUIPMENT
15-ml santrifüj tüpü	Corning	430791
50 ml santrifüj tüpü	Corning	430291
Santrifüj, Sorvall Masaüstü	Dupont Instruments	RT 6000D
pH ölçer	Corning	340
Pipetman pipeti P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipeti P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipeti P-1000	Gilson	F123602
Hemositometresi	Fisher Scientific	0267110
Mikroskobu	Nikon	Eclipse E600
Ters mikroskop	Nikon	TMS
Su Banyosu İnkübatörü	Fisher Scientific	2IS-M
Mikrosantrifüj	Eppendorf	5414C
Mikrosantrifüj	Eppendorf	5418
Akış Sitometresi	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur