Yöntem makalesi

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

DOI:

10.3791/50425

⸱

14 Kasım 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünohistokimya (İHK) son derece özgün, güvenilir ve çekici protein görselleştirme sağlar. Bir IHC tabanlı renkli etiketleme doğru performans ve yorumlama gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gibi yüksek yağ içeriğine sahip dokusunda hedef proteinler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için kullanılan, özellikle zordur.

Bizim protokol, özellikle fare sinir sistemi ve nöro etkilenen periferal lenf düğümleri (LN), hem de yapısal ve çözünebilir proteinlerin tespiti için düzeltilmiş standart immün tekniğinin bir arıtma temsil eder. Bununla birlikte, daha fazla değişiklik olan veya olmayan, protokol olasılıkla da burada sunulan başka organ ve türlerde, diğer ilgili protein hedeflerinin tespiti için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

methylome, transcriptome hatta proteom düzeyde yapılan analizler gelişmiş yüksek verimlilik kullanımı rağmen, immün doku numunesi, hücre kültürü doğrudan protein tespiti veya bir hücre smear için altın standart olmaya devam etmektedir. yerelleştirme / dağıtım modelini ortaya çıkararak, immünhistokimya (İHK) göreli oranları ve hedef proteinlerin topografik ilişkileri değerlendirmek, ve hatta onların biyolojik aktiviteleri gösterebilir. Bu nedenle, IHC yaygın klinik ve araştırma tanı amacıyla, örneğin, tedavi değerlendirmeleri, hastalık mekanizmaları, hayvan modellerinde fonksiyonel ve fenotipik değişiklikler, vb çalışma için kullanılır

Esasen histoloji, patoloji, biyokimya ve immünoloji oluşan İHK anlamlı floresan etiketli antikorlar enfekte dokuda 1 Pnömokok antijenleri tespit etmek ilk kez kullanıldı 1941 yılından bu yana ilerlemiştir. Vselüler ürünlere ve IHC bileşenlerin isualization spesifik antijen (Ag) antikorlar (ABS) bağlanması üzerine dayanır. Fluorofor etiketli antikorlar kullanılarak Bunun yanı sıra, bağışıklık tepkisi de peroksidaz 2,3 ya da alkalin fosfataz 4 gibi enzimler kullanılarak görüntülenebilir. Radyoaktif etiketler otoradyografi ile görselleştirilmektedir ve daha ileri koloidal altın-etiketli antikorlar 5, ışık ve elektron mikroskopi hem spesifik bir antijen-antikor etkileşimi saptamak için kullanılır.

Ag-Ab immünreaksiyon doğrudan ve dolaylı yöntemlerle tespit edilebilir. Direkt yöntem doğrudan birincil Abs 6 etiketli kullanır gibi esasen daha hızlı ve basittir. Bununla birlikte, duyarlılık önemli olmadığı için, direkt ve indirekt yöntemler olanlar tercih edilir. İki aşamalı indirekt algılama prosedürleri, ikinci kat 7 olarak, birincil Abs yönelik ikincil Abs ilk olarak, birincil Abs etiketsiz ve etiketli gerektirir.Sinyal büyütme daha dahil ederek elde edilebilir, enzime bağlanmış üçüncül antikor (üç aşamalı bir dolaylı yöntem) orta Ab bağlar. Yaygın olarak kullanılan dolaylı saptama yöntemleri avidin-biotin ve peroksidaz antiperoxidase (PAP) bulunmaktadır. Seçenek olarak ise, alkalin fosfataz antialkaline fosfataz (APAAP) kompleksi yerine PAP yöntemi kullanılabilir. Özellikle, alkalik fosfataz (AP) yöntemleri immunperoksidaz yöntemle 4 daha fazla hassas gibi görünmektedir. Avidin-biyotin kompleksi (ABC) yöntemi işaretlenen avidin-biyotin kompleksi (LAB) ile kombinasyon halinde biyotinlenmiş sekonder Ab kullanan, ya da streptavidin-biyotin kompleksi (levha) etiketli. Algılama duyarlılık da peroksidaz veya alkalin fosfataz 8 ile etiketlenmiş avidin dahil ederek arttırılabilir. Kullanılan diğer saptama yöntemleri polimerik etiketleme, tiramin büyütmesi ve bağışıklık haddeleme daire 9 vardır. Özellikle, farklı tespit yöntemleri, aynı dokuda çok Ag tespiti için birleştirilebilirBurada yer alan 1978 4. eşzamanlı yapılan olarak çift immün ilk kez bildirilmiştir örneği sırasıyla peroksidaz-bağlı AP-konjuge sekonder antikor ile formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan CNS LN doku kesitlerinde uygulandı. sinyalleri sırasıyla, (FB) APAAP kompleksi 3,3'-diaminobencidine (DAB) kromojen ve Fast Blue kullanılarak görselleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

etik Beyanı
Bu çalışma Laboratuvar Hayvanları için İsveç Ulusal Kurulu ve Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi gelen kurallarına uygun olarak yapılır etik izinler altında (86/609 / EEC) N338 / 09, N15 / 10 ve N65 / 10, onaylı edildiği Kuzey Stockholm Hayvan Etik Komitesi.

1. Doku Hazırlanması

  1. Perfüzyon ve fiksasyon
    1. sol ventrikül aracılığıyla transcardial perfüzyon gerçekleştirmek için izofluran ile hayvan anestezisi. 0.1 M PBS (PFA) içinde% 4 paraformaldehit ve ardından kan bileşiklerinin ayrılması için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile damar durulama başlatın.
    2. PFA içine batırılarak disseke beyinleri, omurilik ve periferik LN doku sabitleşmek. 4 ° C'de 24 saat sonra, daha fazla işlem kadar 4 ° C 'de PBS içine PFA doku ve mağaza aktarın. Alternatif ticari PBS, 250 ml S & 9 gr NaCl çözülür# 246; rensen tampon ve 750 ml deiyonize su ekleyin (dH 2 O); 2.5 L dH 2 O. HPO 2 PO 4 x 2H 2 O 4 x 1 H H2O ve 71.2 g 2 Na 0.2 M Sörensen tamponu (pH 7.4) çözülür 13.8 gr NaH hazırlamak
  2. Dehidrasyon ve gömme
    1. Bir ustura kullanılarak yaklaşık 5 mm kalınlığında parçalar halinde doku kesilir.
    2. Ksilen ve nihayet parafin (Tablo 1) takip Tissue-Tek VIP Vakum Sızma İşlemci (etanol konsantrasyonları artan içine dalma dayalı standart bir prosedür kullanılarak doku sertleşmesi işlemi (dehidratasyon) başlatın.
    3. bir kalıpta doku yerleştirin ve "parafin blok" oluşturmak için numune etrafında sıvı parafin dökün. Uzun süreli saklama, oda sıcaklığına (RT) gerektirir. Bununla birlikte, kesit önce, gece boyunca, örneğin, 4 ° C'de (O / N) blokları soğumaya tavsiye edilir.

2. Kesit

  1. bıçak boyunca ileri ve geri hareket edebilen kızak mikrotom sabit tutucu, içine parafin blok yerleştirin. blok ve mikrotom bıçak (o bıçak geometrisine bağlı değil, aynı zamanda kesme hızı ve tekniği) arasında optimum açısını ayarlayın.
  2. parafin blok 5 mikron kalınlığında kesitler - 3 kesin.
  3. bir su kabına sadece kesilmiş bölümü aktarın ve cam slayt üzerine su sonradan monte edin.
  4. kalan suyu ve potansiyel hava kabarcıklarını çıkarmak için kağıt havlu karşı dikkatli monte bölümü basın. Ticari olarak önceden kaplanmış yapışkan cam slaytlar tavsiye ediyoruz.
  5. 60 ° C - Kuru 50 bir sobada birkaç saat için slaytlar monte edilebilir.

3. Parafinden arındırma lamların (Rehidratasyon & Engelleme Endojen Peroksidaz)

  1. slaytlar ksilen içine 2x daldırın (alternatif ksilen yerineXEM-200), her zaman 15-20 '.
  2. % 99 etanol içinde durulayın.
  3. Endojen peroksidaz aktivitesi engellemek için,% 0.25 hidrojen peroksit içeren metanol çözeltisi içinde "30 için bölümler inkübe edin.
  4. Su içeriği (% 99,% 70 artış damıtılmış su içine biten etanol kullanılarak rehidrasyon devam edin.
  5. Kapağın montajı kadar bu noktadan sonra bölümler nemli tutulması gerekir kayar.

4. Antijen Alma

  1. Çalışma hazırlamak, 60 '' (bu durumda EDTA pH 8.5 tamponu içinde), bir antijen alma çözeltisi slaytlar kaynamaya bir gıda gemi kullanarak (EDTA tampon stok çözeltisi DH 2 O 50 ml, 1.21 g Tris ve 0.37 g EDTA içerir 47.5 ml dH 2 O) çözelti seyreltik 2.5ml EDTA stok solüsyonu.
  2. yaklaşık RT slaytlar soğumasını. 1 saat karıştırıldı ve daha sonra 3 yıkayın - Tris 5x tuz (TBS, kullanımı, alternatif olarak, PBS), 0.05 M Tris ve 0.15 M NaCl içeren tampon; pH 7.5 ayarlanır, wiinci HCI. Alternatif ticari TBS kullanın.

5. belirsiz Cilt Siteleri Engelleme

  1. , Spesifik olmayan arka plan reaksiyonları önlemek% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 90 DAKO tampon içeren bloke edici çözelti içinde "30, oda sıcaklığında ilgili bölümleri kuluçkalanması.

6. Çift ile immün: Primer Abs ile eş zamanlı Kuluçka

  1. bloke çözeltisi içinde birincil antikor gerekli miktarda seyreltilir ve O / N 4 ° C'de inkübe edin. (; 1 ED1: 1,000) α-CD68 ile veya α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) ya da α-Cd8α (Ox-8; 1: 200):; çift immün için α-eotaksin (300 1 Ccl11) birleştirmek .
  2. slaytlar TBS tamponu ile 3-5x Durulama (alternatif 10x seyreltilmiş DAKO tampon kullanın).
  3. bloke çözeltisi içinde ve oda ile 1 saat inkübe edilir: sekonder antikor miktarı (200 biyotinlenmiş anti-keçi, AP-konjüge edilmiş anti-fare, her ikisi de 1) ile seyreltilir.
  4. (Bizi TBS tamponu ile 5x - slaytlar 3 durulayıne, alternatif olarak 10 x) DAKO tampon seyreltilmiştir.
  5. RT, 1 saat boyunca bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş Avidin-yaban turpu peroksidaz kompleksi (HRP) ile slaytlar inkübe edin.
  6. slaytlar 3 durulayın - TBS tamponu (alternatif 10x seyreltilmiş DAKO tampon kullanın) ile 5 kat.

7. Görselleştirme

  1. Bağlı AP-etiketli ikincil antikor Görselleştirme
    1. 1 L dH 2 O 12.1 g Tris çözülmesiyle 0.1 M Tris-HCl tamponu hazırlayın ve HCl ile pH ayarlanır. 1 M levamisol solüsyonu hazırlamak için, aynı Tris-HCl tampon kullanın. DH 2 O. taze% 4 NaNO 2 çözüm hazırlayın
    2. (37 (bir standart cam küvet için gerekli hacim) Hızlı Mavi (FB) alt-tabaka bir cam tüp içinde 312.5 ul DMF içinde 6.25 mg Naftol-AS-MX-fosfat çözülür ve önceden ısıtılmış 50 ml ilave edin, 50 ml elde etmek için C) Tris-HCI tampon maddesi. 312,5 ul 2 N HCI içinde 12.5 mg FB RR Tuz çözmek için prepa önce bir 312,5 ul% 4 NaNO 2 çözeltisi, kırmızı ve önceden ısıtılmış Tris-HCI tampon maddesi, aynı 50 ml karıştırın. sarı sıvı berrak hale gelinceye kadar hafifçe çalkalayın ve nihayet önceden hazırlanmış 1 M Levamisole solüsyonu 77 ul ekleyin. Süzüntü karışım elde edilmiş ve bir cam küvet içinde yer slaytlar üzerine dökün.
    3. 37 ° C'de inkübasyon başlatmak ve yaklaşık ışık mikroskobu altında geliştirme sürecinde kontrol eder. her 15 - 30 dk. bulanık dönüm Eğer taze karışımı ile FB çözümü değiştirin.
    4. PBS tamponu içine sonradan TBS tamponu ve transfer 5x - slaytlar 3 durulayın.
  2. Bağlı biotinlenmiş sekonder antikor görselleştirme
    1. DAB / H2O 2 49 mi, PBS içinde 1 mi DAB stok solüsyonu (1 mi PBS başına 25 mg DAB) seyreltilerek solüsyon geliştirilmesi hazırlayın. Dökme önceki bölümlerde üzerine 16.5 ul H 2 O 2 ve süzüntü ekleyin.
    2. tetikleyici kaş içine kromojen DAB Dönüşümn pigment hemen olabilir. (Yüksek arka plan yükseltmek ve belirli bir sinyal maskeleyebilir saniye daha uzun inkübasyon bile birkaç) ışık mikroskobu altında gelişen süreci kontrol.
    3. Kahverengi pigment çökelti yoğunluğu, alternatif olarak 5 '% 2 bakır sülfat ve% 0.9 NaCl'den oluşan çözelti içinde inkübe edilerek artırılabilir.
    4. Slaytlar 3 durulayın - PBS ile 5x ve nihayet dH 2 O ile, alternatif olarak musluk suyu kullanın.
    5. Kapak sulu GelTol montaj orta kullanarak sudan doğrudan fişleri ile slaytlar monte edin. hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
    6. Montaj orta tam kurutma, örneğin, O / N 4 ° C'de izin verin. Mağaza RT slaytlar kurutulmuştur.
1. % Etanol 20 ' 40 ° C
2. % Etanol 60# 39; 40 ° C
3.. % Etanol 90 ' 40 ° C
4. % Etanol 60 ' 40 ° C
5. % Etanol 90 ' 40 ° C
6. % Etanol 60 ' 40 ° C
7. % Etanol 90 ' 40 ° C
8. % Etanol 120 ' 40 ° C
9. ksilol 30 ' 40 ° C
10. ksilol 60 ' 40 ° C
11. Parafin 60 ' 60 ° C
12. Parafin 60 ' 60 ° C
13.. Parafin 60 ' 60 ° C
14. Parafin 120 ' 60 ° C

Doku Tek VIP Vakum Sızma İşlemci Tablo 1. Doku İşleme.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çift immunostainings (ko-boyama) formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan CNS LN bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. 3-5 mikron kalınlığında doku dilimleri önceden kaplanmış yapışkan cam slaytlar üzerine sonradan monte edilmiş ve daha önce 10,11,12 tarif edildiği gibi muamele, bir kızak mikrotom kullanılarak kesilmiştir. Kısaca, deparaffinizing doku rehidrasyon ve endojen peroksidaz inaktivasyonu ardından bölümler, spesifik olmayan bağlama merkezlerini ortadan kaldırmak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standart İHK prosedürleri genellikle yaygın geniş deneyime değil, aynı zamanda "deneme yanılma" yaklaşımı ima optimal bir sonuç elde etmek özel ayarlamalar gerektirir. Doku hazırlık hedef görselleştirme kadar protokolde neredeyse her adımı tek tek nihai sonucu iyileştirmek için değişiklik tasarlanmış tabi tutulabilir. Burada sunulan Çift boyama protokolü, özellikle nöro etkilenen formalin ile fikse, parafine gömülü sıçan MSS ve LN doku kesitlerinde bizim ilgi hedef proteinleri arasındaki ilişkileri değerlendir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hans Lassmann ve Jan Bauer'e rehberlikleri ve destekleri için teşekkür ederiz. Ayrıca mükemmel teknik yardım için Katalin Benedek'e ve eleştirel ve dilbilimsel değerlendirme için Caroline Westerlund'a teşekkür ederiz.

Bu çalışma Biogen Idec, Wenner-Gren Vakfı, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Nörolojik Engelli Kişiler Derneği, İsveç Beyin Vakfı, AB 6TH Çerçevesi EURATools (LSHG-CT-2005-019015) ve Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif
izofluran (İzofluran): 1-Klor-2,2,2-trifloretil (diflormetil eter) 2-Klor-2- (diflormetoksi)-1,1,1-trifloretan (C3< / sub>H2< / sub>ClF5< / sub>O)Baxter1001936060Göz ışınlaması. Muhtemelen doğurganlığı etkiler ve rahimdeki bebeğe zarar verir. Sadece yeterli donanımlı anestezi ortamında uygulayın.
Sodyum klorür (NaCl)Merck1.0604
Fosfat Tampon Salin (PBS), tabletSigma-AldrichP4417
Paraformaldehit (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 1x PBS'de %4Apl pharma34 24 28Sağlık tehlikesi. Aşındırıcı. Yanıcı. Akut toksisite.
Etanol ≥ %99,5, mutlak (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1LYanıcı.
Ksilen (Ksilenler, histolojik derece; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056Yanıcı. Akut toksisite.
Histo-Comp Parafin BalmumuDokusu-TekV0-5-1001
Yapıştırıcı Mikroskop SlaytlarıStarfrostMIC-1040-W
Ksilol ikamesi XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200Solunum hassasiyeti. Kanserojenlik.
α-CD8 (Ox-8) fare anti-sıçan, birincil antikorAbD SerotecMCA48G
&alfa;-Iba1 (AIF1) fare anti-sıçan, birincil antikorMilliporeMABN92
α-CD68 (ED1) fare sıçan önleyici, birincil antikorAbD SerotecMCA341R
&alfa;-eotaksin C-19 (CCL11) keçi anti-sıçan, birincil antikorSanta Cruz BTSC-6181
Alkalin fosfataz (AP) konjuge ikincil antikorDakopatts, DanimarkaD0314
Biyotinile ikincil antikorAmersham BiotechRPN1025
Avidin-yaban turpu peroksidaz kompleksi (HRP) Sigma-AldrichA3151
Naftol AS-MX fosfat (C19< / sub>H18< / sub>NO5< / sub>P)Sigma-AldrichN4875-1GAkut toksisite.
Hızlı Mavi RR Tuzu, Azoik Diazo No. 24 (C15< / sub>H14< / sub>ClN3< sub>O3< / sub> x 1/2 ZnCl2< / sub>)Sigma-AldrichFBS25
Levamisol hidroklorür (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742Akut toksisite.
3,3'-Diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB Kromojen)DAKOS3000Son derece yanıcı. Zehirli.
Bakır sülfat (CuSO4)Merck1.02791Akut toksisite. Çevresel tehlike.
GelTol Sulu Montaj Ortamı TermoElektron Şirketi230100
Hidrojen peroksit,% 30 (H < alt > 2 < / alt > O < alt > 2 < / alt >)Merck107210Akut toksisite.
Metanol (CH3OH)Fluka65543Akut toksisite. Solunum hassasiyeti. Kanserojenlik. Yanıcı.
Tris (hidroksimetil) aminometan, TRIS bazı (C4H11NO3AppliChemA1379Cilt ve göz tahrişi.
Tris Tamponlu Tuzlu Su (TBS), tabletSigma-AldrichT5030
Di- Sodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na2< / sub>HPO4< / sub> x 2H < alt > 2 < / sub >O)Merck1.0658
Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat (NaH < alt > 2 < / alt >PO < alt > 4< / alt > x 1H < alt > 2 < / alt >O) Merck1.06346
Fetal buzağı serumu (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO sitomasyon yıkama tamponu 10x DAKOS30062-8 °C'de saklanmalıdır; Bakteri üremesini engellemek için C. Köpürmekten kaçının.
N, N< / em>-Dimetilformamid; DMF (C3H7NO)Fluka40250Yanıcı. Akut toksisite.
Cam lameller 24 x 36 mm Menzel-Glä serBB024036A1
Hidroklorik asit, conc. (HCl)Sigma-Aldrich30721Aşındırıcı, tahriş edici, geçirgen. Akciğer hassaslaştırıcı (asit sisi olarak). Zehirli.
Hidroklorik asit çözeltisi hacimsel, 2 M HCl (2 N)Fluka71826Aşındırıcı, tahriş edici, geçirgen. Akciğer hassaslaştırıcı (asit sisi olarak). Zehirli.
Sodyum nitrit, ReagentPlus, ≥ % 99.0 (NaNO2< / sub>)Sigma-AldrichS2252Oksidan. Zehirli. Çevre için tehlikelidir.
Etilenedinitrilotetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454Oral maruziyetler üreme ve gelişimsel etkilere neden olabilir.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vakum Sızma İşlemcisiSakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Serisi Taban Kızağı Mikrotom Hacker aletleri
Ev tipi yemek vapuru BraunMultiGourmet FS 20
Işık mikroskobu Leica Polyvar 2
)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794(2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nohistokimyaDoku Haz rlamaAntijen Geri Kazan mI k MikroskobuParafin G mmePeriferik Lenf NodlarPrimer AntikorlarSekonder AntikorlarAvidin Yaban Turpu Peroksidaz

İlgili makaleler