Bir Caenorhabditis elegans Model Sistemi

Özet

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler tarif C. elegans. Biz insan Aβ ifade solucanlar oluşturmak için nasıl göstermek ₄₂ Nöronlarda ve nasıl davranış testleri kendi işlevini test etmek için. Biz daha fazla farmakolojik test için kullanılabilir birincil nöronal kültürlerin edinme göstermektedir.

Özet

Amylopathy zamanla dokularda amiloid beta anormal sentezi ve birikimi (Aβ) tanımlayan bir terimdir. Aβ Alzheimer hastalığı (AH) bir özelliğidir ve Lewy cismi demans, dahil vücut miyozit ve serebral amiloid anjiyopati ^1-4 bulunur. Amylopathies giderek zamanla gelişir. Bu nedenle kısa ömürlü basit organizmaların bu koşulların moleküler yönlerini aydınlatmak için yardımcı olabilir. Burada, solucan Caenorhabditis elegans kullanarak Aβ-aracılı nörodejenerasyon incelemek için deneysel protokolleri tarif. Böylece, yetişkin çift cinsiyetli en sinsisyal gonadlar içine kodlayan DNA insan Aβ ₄₂ enjekte edilerek transgenik solucanlar inşa. Transformant çizgiler Mutasyon-kaynaklı entegrasyonu ile stabilize edilir. Nematodlar yumurtalarını toplama ve ekim ile senkronize yaş vardır. Aβ ₄₂ eksprese eden nöronların fonksiyonu (elverişli davranış tahlillerinde test edilir kemotaksi deneyis). Embriyolardan elde edilen primer nöronal kültürler davranışsal verileri tamamlamak için ve anti-apoptotik bileşiklerin nöro-koruyucu etkisini test etmek için kullanılır.

Giriş

Beta amiloid (Aβ) β ve γ secretases ¹ ile amiloid ön-madde proteininin (APP) sıralı bölünme sonra oluşan 36-43 amino asitlik bir peptiddir. Γ sekretaz Aβ peptidin C-terminal ucu işler ve değişken uzunlukta ⁵ sorumludur. Aβ en yaygın formları Aβ ₄₀ ve Aβ _42, daha yaygın olarak, AD ⁵ gibi patolojik durumları ile ilişkili olan ikinci bulunmaktadır. Yüksek konsantrasyonlarda Aβ formu β-yaprak azından amiloid fibriller ⁶ oluşturmak için agrega. Fibriller yatakları nöronları çevreleyen senil plaklar ana bileşenidir. Plaklar ve yayılabilir, olmayan plak Aβ oligomerler, hem Aβ altında yatan patojenik formları oluşturacağı düşünülmektedir.

Nöronal amylopathies Laboratuvar çalışma süresi ile bu bu koşullar ilerleme gerçeği ile karmaşık. Bu nedenle, importanfareler-kısa ömrü için model-tamamlayıcı genetik uysal hayvan geliştirmek için t. Bu modeller amylopathies-genellikle hücresel ve moleküler-ve basitliği sayesinde, sorunun özünü yakalamak için yardımcı belirli yönlerini aydınlatmak için kullanılabilir. Solucan Caenorhabditis elegans düşüyor bu kategorisidir. Bu kısa bir ömrü vardır, ~ 20 gün ve gen ifadesi, protein kaçakçılığı, nöronal bağlantı, sinaptogenez, hücre sinyalizasyon ve ölüm düzenlenmesi de dahil olmak üzere ek temel hücresel süreçleri memeli ⁷ benzer. Solucanın benzersiz özellikleri güçlü genetik ve bağımsız vasküler hasar nöronal hasarı incelemek için sağlayan bir damar sistemi, eksikliği içerir. Öte yandan, bir beyin eksikliği C kullanımını sınırlamaktadır nörodejenerasyon birçok açıdan eğitim için elegans. Buna ek olarak, lezyonların anatomik dağılımlarının üreme ve kimlik bu organizmada gerçekleştirilemez. Diğer sınırıations gen ekspresyon profilleri ve karmaşık davranış ve hafıza fonksiyon bozukluğu hem de farklılıkları değerlendirmek için zorluk içerir. Burada C oluşturmak için yöntemler tarif amylopathies bir elegans modelleri.

Protokol

1. Transgenik Worms İnşaatı

1. Dönüşüm.
   1. Enjeksiyon pedleri hazırlayın. Bir cam lamel üzerine suda çözünmüş sıcak,% 2 agaroz, bir damla yerleştirin. Hızla açılan ikinci bir lamel yerleştirin ve hafifçe dokunun. Agaroz ayrı slayt lamelleri katılaşmış ve 80 ° C'de bir vakum fırın içinde lamel ped ° CO / N fırında sonra
   2. Pipetler çekin. Biz 1/0.5 mm filament ile OD / ID borosilikat kılcal çekmek için bir Sutter P-97 çektirme kullanın. Pipetler daha sonraki bir aşamada açık kırık kapalı ucu ile dövme.
   3. Enjeksiyon karışımı hazırlayın. Ul / 150 ng arasında nihai bir konsantrasyona kadar, ilgili DNA (yapı başına 20 ng / ml) artı boş plazmid DNA içeren enjeksiyon karışımı olun. Herhangi bir kirletici kaldırmak için enjeksiyon karışımı santrifüj. Kirletici dönüşüm verimliliği azaltmak için bu adım çok önemlidir. B yeni bir tüp en iyi 5 ul (enkaz ve diğer kirleticiler alt toplamak) transferE enjeksiyon kullanılır.
   4. Kılcallık tarafından enjeksiyon karışımı yükleyin. Pipet alt enjeksiyon karışımı batırılır. Tipik olarak 0.5 ul 100 solucanlar enjekte etmek için yeterlidir.
   5. Enjeksiyon pipet yükleyin. Mikromanipülatör sahibinin üzerine pipet yerleştirin ve agaroz pad üzerinde enkaz karşı bir bardak slayt veya alternatif olarak monte edilmiş bir kapak kayma kenarına ucu sürtünme tarafından açık ara. Bu çok büyük ipuçları zarar solucan gibi çok önemli bir adımdır ve çok küçük ipuçları kolay tıkanır. Kırık ucu kalitesi akış hızı en önemlisi şekil ve ile değerlendirilebilir. Akış hızı enjeksiyon basıncına tepki olarak halokarbon 700 bir damla yağ daldırılan açık ucundan akan kabarcıkların büyüklüğü ile değerlendirilebilir.
   6. Enjeksiyon pad solucanlar aktarın. Bir enjeksiyon pad üzerinde 700 halokarbon petrol bir damla koyun ve yağ (yeni başlayanlar için 1 veya 2) birçok solucanlar aktarın. Kadar ped üzerine solucanlar aşağı itmek için almak bir solucan kullanıny agaroz uygun. Worms aynı yöne bakacak şekilde ventral taraf ile satır odaklı olmalıdır. Solucan kafası dokunmaktan kaçının. Solucanlar ped uymak için başarısız birkaç denemeden sonra ise, yeni bir ped ile değiştirin veya agaroz kalınlığı ve / veya konsantrasyonu artırır.
   7. Solucan içine pipet takın. Sahne hareket ettirerek, pipet altında solucan yerleştirin. Sitoplazma birçok germ hücre çekirdekleri tarafından paylaşıldığı için gonadın merkezi bir çekirdek pipet yerleştirin. Bu birçok döl enjekte DNA teslim olasılığını artırır. Pipet solucan (~ 15 ° -25 ° açı) neredeyse paralel durmalıdır. Cilt basılana kadar dikey olarak solucan vücudunun aşağı pipet ucu itin. Sonra yavaşça ucu en ekleme ikna etmek için manipülatör dokunun. En iyi sonuç için her iki gonadlar enjekte.
   8. DNA çözüm enjekte edilir. Gonad şişer kadar pipet basınç uygulayın. Akışını durdurmak ve pipet kapalı solucan çekin. Taşıyın akışı için iğne Test vebir sonraki solucan ve tekrar enjeksiyon adımlar.
   9. Solucanlar kurtarmak: solucanlar kurtarma tampon bir damla (~ 10 ul) ekleyin ve solucanlar yüzme başlayana kadar kuluçkaya yatmaktadır. Çözüm çok M9 kadar solucan yüzme devam ve birkaç kez tekrar kadar M9 eşit miktarda ekleyin, bekleyin. Bireysel numaralı seribaşı plakaları için solucanlar aktarın.
2. Entegrasyon.
   1. Taze bir tabak içine 40 sağlıklı, iyi beslenmiş, L4 solucanlar yerleştirin
   2. 40 dakika 4.000 rad ile γ-ışını ile saçmak. Taze, OP50 numaralı seribaşı plakaları (4 solucanlar / plaka) ışınlanmış solucanlar (P0) aktarın. Worms alternatif olarak 300 J / m ² UV'lerinizi bir doz ile ışınlanmış olabilir.
   3. Bireysel plakalar her plaka 10-20 F1 transformantlar aktarmak, ilgili P0 kökenli levhalar etiket.
   4. Ayrı levhalar her F1 için 2-4 F2 transformantlar tek tek. Dönüşüm marker 100% iletimi için F3 döl kontrol edin. Tipik olarak, bir ışınlanmış solucan wil gelen döl% 1-3l bir entegrasyon olay var.
   5. Üç veya daha fazla bağımsız transformant hatları stokları olun.

2. Davranış Tahliller

1. Yaş-senkronizasyon.
   1. Standart 10 cm NGM plakalar + OP50 E'de solucanlar büyütün gebe yetişkinlerin büyük bir nüfus kadar coli (3-5 gün) ulaşılır.
   2. 1 mi M9 tampon bunları süspansiyona, 50 ml Falcon tüpleri solucanları toplayın.
   3. 3 dakika boyunca 450 x g, 5 ml M9 tampon ve santrifüj ekleyin. Süpernatant atın. 3-4x tekrarlayın.
   4. Son santrifüj sonunda, süpernatan kaldırmak ve pelet solucanlar temel hipoklorit çözeltisi (0.5 M NaOH ve taze karışık% 1 hipoklorit), 10 hacim ekleyin. ~ 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Lizis Reaksiyon bir lamel üzerine parçalama reaksiyonu bir damla yerleştirme ve bir mikroskop altında incelenmesi ile solucanlar izlenebilir. Solucanların yaklaşık% 80 kırıldığı zaman, reaksiyon durdurulmalıdır.
   5. Eklenti tarafından parçalama reaksiyonu durdurmaksteril yumurta tampon g aynı hacimde.
   6. 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ile yumurta (ve karkas) toplayın.
   7. Steril yumurta tampon 2-3x ile yumurta yıkayın.
   8. M9 tampon ve tohum onları standart NGM plakalar üzerinde yumurta O / N inkübe edin.
2. Kemotaksis testi.
   1. Agar kabaca 0.5x0.5x0.5 cm birkaç adet hazırlayın. Biz 10 cm plaka agar yatırmak ve biz oradan agar parçalar kesti.
   2. 2 saat boyunca arzu edilen cezbedici (doyurur civarındaki doyurulması konsantrasyonlarda) ihtiva eden bir çözelti içinde, agar parça bekletin. Tipik Cezbedici lisin (0.5 M), biyotin (0.2 M) 'dir.
   3. Bir test spot yerini ve kontrol nokta (Şekil 1A) işaretlenmiş edildiği bir 10 cm testi plaka bir agar yığın Depozito. Dengeleme ve degrade O / N (Şekil 1B) oluşumunu sağlar. Tek bir deneme için 5 tabak hazırlayın.
   4. Önce deneme 20 mM NaN ₃ (Anest 10 ul ekleyinHer noktaya) infographie.
   5. Plakasının merkezinde 20 yaş senkronize solucanlar yerleştirin. 20 ° C'de inkübatör plaka koyun
   6. 1 saat sonra, test / kontrol noktaları üzerinde hayvanların sayısı ve aşağıdaki gibi kemotaksis indeksi (CI) hesaplanır: N, _N-testi ve N _Mrk., hayvanların toplam sayısı, test yerinde hayvan sayısı ve kontrol nokta hayvanların sayısını göstermektedir burada.

3. Temel embriyonik Hücre Kültürü

1. Yaşa senkronizasyon açıklandığı gibi solucanlar eritilir.
2. 5 dakika boyunca 450 x g hızında steril yumurta tampon ve santrifüj ile aynı hacim ekleyerek parçalama reaksiyonu durdurun. Yavaşça pelet yumurta kaybetmemek için dikkatli olmak süpernatant atın. 2-3x tekrarlayın veya süpernatant açıktır kadar.
3. Pelet yumurta (ve karkas tekrar süspansiyon) 2 ml steril yumurta tamponu içinde ve yumurta tamponu içinde steril% 60 sukroz, 2 ml ekleyin. Yumurta tamamen elle veya vorteks (onlar santrifüj altında kümeleri oluşturmak eğilimi gibi) yeniden süspanse kadar bu çözüm karıştırın.
4. 15 dakika 450 x g'de santrifüj.
5. Dikkatli bir şekilde steril tüpe süpernatant (yumurta içeren) aktarın. Karkas ve parçalama yan ürünleri diğer içeren pelet atın.
6. Yumurta tamponunda yeniden süspansiyon haline getirilmesini yumurta ve 5 dakika boyunca 450 xg santrifüj kalıntı sukroz çıkarın. Yavaşça toplamak ve süpernatant atın. 3x tekrarlayın.
7. Bir laminer başlık altında yumurta kabuğu sindirmek için oda sıcaklığında 1 U / ml kitinaz içeren steril yumurta tampon pelet yumurta tekrar süspansiyon. 30 dakika bu durumda reaksiyon (ters bir hücre kültürü mikroskop altında) izlemek için başlatmak. Çitinaz Her parti, biraz farklı bir aktiviteye sahiptir. Genellikle sindirim 1 saat içinde tamamlanır.
8. Yaklaşık% 70-80 yumurta kabuğu kitinaz CM-15 eklenti (L-15 hücre kültürü med sindirilir zamaniyum,% 10 fetal sığır serumu, 50 U / ml penisilin ve 50 ug / ml streptomisin) 'tür. Bir 27 göstergesi ile bir şırınga kullanarak hücreleri ayırmak. Sağlam embriyolar kaldırmak için filtre 5.0 mikron, hücre ve larva kümeleri ile hücre süspansiyonu filtre.
9. Pelet 450 santrifüjleme ile ayrışmış hücre süspansiyonu, 15 dakika boyunca xg. Süpernatantı ve CM-15 hücre kültürü ortamında pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
10. . Cam kapak Plaka ayrışmış hücreleri daha önce su Not çözünmüş fıstık lektin (0.1 mg / ml) ile kaplı fişleri: hücreleri ayırt etmek için yüzeye uygun olmalıdır.
11. Hücreler, 2 haftadan daha uzun için hava içinde oda sıcaklığına (16-20 ° C) muhafaza edilebilir.

Sonuçlar

Bizim protokolleri ile, nöronal fonksiyonu ⁸ insan Aβ ₄₂ oligomer etkilerini incelemek. Bir fragmanını kodlayan insan Aβ ₄₂ ve yangın vektör pPD50.52 yapay olarak sinyal peptidi kodlama sekansı ucunda bir Sma 1 kısıtlama endonükleaz sitesini ortaya primerler kullanılarak yapı PCL12 ⁹ ile amplifiye edildi. Bu kısım daha sonra özel Sma 1 Alanı ¹⁰ arasındaki pPD95.75 Acil vektörü içinde bir 2.481-bp FLP-6 promotör sekansı ihtiva eden bir yapıya eklenir. Protok...

Tartışma

Burada C. kullanarak amylopathies hücresel ve moleküler yönlerini incelemek için, kombine yaklaşım tarif elegans. Bu yaklaşımın avantajları şunlardır:. 1) düşük maliyetli C.elegans oda sıcaklığında, bakterilerle numaralı seribaşı normal bir Petri kabı korunur. 2) Güçlü genetik. Transgenik hayvanlar birkaç ay içinde elde edilen promotör sekansları ve geniş bir dizi spesifik nöronlarda istenen genin ekspresyonunu yürütmek için kullanılabilir edilebilir. 3) Basit, iyi karakterize, sinir sistemi. ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1. NGM
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Bakteriyolojik agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2,5 g
Damıtılmış Su			975 ml
Otoklavlama ile sterilize edin, ardından aşağıdaki öğeleri ekleyin ve iyice karıştırın
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml 1 M stok
Kalsiyum Klorür	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml 1 M stok
Kolesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml 5 mg/ml stok (etanol içinde)
Potasyum fosfat tamponu			25 ml 1M stok
2. Potasyum fosfat tamponu
Potasyum fosfat monobazik	Sigma-Aldrich	P5655	108.3 g
Potasyum fosfat dibazik	Sigma-Aldrich	P3786	35.6 g
Damıtılmış Su			1 L
Otoklavlama ile sterilize edilmiştir
3'e getirin. M9 tampon
>Potasyum fosfat monobazik	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Sodyum fosfat dibazik	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml 1 M stok
Damıtılmış Su			1 L'ye getirin
Otoklavlama ile sterilize edilmiştir
4. Yumurta tamponu (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Potasyum Klorür	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Kalsiyum Klorür	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Magnezyum Klorür	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Damıtılmış Su			1 L
Otoklavlama ile sterilize edilmiş<
L-15 kültür ortamı	Gibco	11415	450 ml
Fetal Sığır Serumu	Gibco	10437-028	50 ml
Penisilin	Gibco	15140	50 birim/ml
Streptomisin	Gibco	15140	50 g/ml<
6. Diğer Reaktifler
Halokarbon 700 yağı	Halokarbon Ürünleri	9002-83-9
5 & mu; m Akrodisk Şırınga Filtre	PALL Co.	4199
Kitinaz	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lektin (yer fıstığı)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Sodyum hidroksit	Fisher Scientific	S320
Lizin	Sigma-Aldrich	L5501
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Sodyum hipoklorit çözeltisi	Sigma-Aldrich	425044
Sodyum azid	Sigma-Aldrich	71289
Sükroz	Sigma-Aldrich	S0389