Yöntem makalesi

Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling'den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü

13.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50439

⸱

10 Eylül 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe Institute of Technology - Campus North, 2Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology - Campus North, 3Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology - Campus South

Bu makalede

Özet

Zebra balığı larvalarını kullanarak glukokortikoid stres hormonu sinyali için bir kimyasal tarama sisteminin prosedürünü ve veri analizini açıklıyoruz: Glukokortikoid Duyarlı İn vivo Zebra Balığı Luciferaz Aktivitesi (GRIZLY) testi. Test, metabolizasyon gerektiren veya endojen glukokortikoid üretimini etkileyen bileşikler tarafından glukokortikoid sinyalizasyonu üzerindeki etkileri hassas ve spesifik olarak tespit eder.

Özet

Glukokortikoid stres hormonları ve bunların yapay türevleri, iltihabı tedavi etmek için yaygın olarak kullanılan ilaçlardır, ancak glukokortikoidlerle uzun süreli tedavi ciddi yan etkilere yol açabilir. İn vivo olarak glukokortikoid sinyallemesini etkileyen yeni bileşikleri aramak veya bileşiklerin glukokortikoid sinyal yolu üzerindeki istenmeyen etkilerini belirlemek için test sistemlerine ihtiyaç vardır. Glukokortikoid sinyal aktivitesinin in vivo ve gerçek zamanlı olarak ölçülmesine izin veren bir transgenik zebra balığı testi olan GRIZLY testi (Glukokortikoid Duyarlı In vivo Zebra Balığı Luciferase aktivitesi) oluşturduk. Lusiferaz bazlı test, metabolizasyon gerektiren veya endojen glukokortikoid üretimini etkileyen bileşiklerin etkileri de dahil olmak üzere, yüksek duyarlılık ve özgüllük ile glukokortikoid sinyali üzerindeki etkileri tespit eder. Burada, bu tahlil ile kimyasal taramaların yürütülmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kalite kontrol ve veri görselleştirmeye odaklanarak veri toplama, normalleştirme ve analizi açıklıyoruz. Tahlil, basit, zaman çözümlü ve kantitatif bir okuma sağlar. Bağımsız bir platform olarak çalıştırılabilir, ancak aynı zamanda yüksek verimli tarama iş akışlarına kolayca entegre edilebilir. Ayrıca, endokrin bozucuların çevresel izlemesi veya stres araştırması gibi kimyasal taramanın ötesinde birçok uygulamaya izin verir.

Giriş

Glukokortikoidler (GC'ler), adrenal bez tarafından üretilen, stres yanıtı sırasında ve metabolizmanın düzenlenmesinde önemli rol oynayan steroid hormonlardır1. GC'ler, nükleer reseptör süper ailesinin sitoplazmik glukokortikoid reseptörlerini (GR'ler) bağlar ve bağlandıktan sonra çekirdek2'ye translokasyon yapar. Burada, örneğin, diğer transkripsiyon faktörlerine müdahale ederek (transrepresyon) transkripsiyonu baskılayabilir veya glukokortikoid yanıt elemanları (GRE'ler, transaktivasyon) yoluyla gen transkripsiyonunu aktive edebilirler. Anti-enflamatuar özellikleri nedeniyle, hem doğal hem de yapay GC'ler, astım veya artrit gibi bir dizi hastalığın tedavisinde yaygın olarak kullanılan ilaçlardır3. Bununla birlikte, özellikle GC'lerin uzun süreli kullanımı, diyabet ve glokom dahil olmak üzere ciddi yan etkilere yol açabilir4. Bu nedenle, potansiyel olarak daha faydalı tedavi verimliliği ve tolere edilebilirliği ile GC sinyalini hedefleyen yeni bileşikler çok rağbet görmektedir. Daha da önemlisi, kültürlenmiş hücrelerde gözlenen ligand etkileri, in vivo5'te görülenlerden farklı olabilir. Bu tür etkiler, konvansiyonel hücre kültürü bazlı farmasötik tarama testleriyle elde edilen sonuçları yanlılığa düşürebilir. Zebra balığı modeli tarafından sağlanan kimyasal in vivo tarama, hücre kültüründe tespit edilemeyen etkilerin belirlenmesine izin verdiği için son zamanlarda odak noktası haline gelmiştir6,7.

Hormonal sinyal yolları da çevresel kirleticilerden etkilenebilir. Endokrin bozucu kimyasallar (EDC'ler) olarak adlandırılan çeşitli hormon düzenleyici süreçleri etkiler8. Böylece, suda yaşayan organizmaların üremesi ve cinsel farklılaşması, östrojen benzeri aktivitelere sahip maddeler tarafından modüle edilebilir. Son zamanlarda, metabolik bozuklukların çevredeki EDC'lerle bağlantılı olabileceğine dair endişeler dile getirilmiştir9. Bu tür bir "metabolik bozulma" tarafından hedeflenen bir yol, ksenobiyotiklerin gelişim ve bağışıklık fonksiyonu üzerindeki etkilerinde de rol oynayan glukokortikoid yoludur10,11. Bununla birlikte, seks steroid hormonu etkisine müdahale eden bileşikler hakkında mevcut olan büyük miktarda bilgi ile karşılaştırıldığında, GR yoluyla aracılık edilen endokrin bozulma etkileri hakkında nispeten az şey bilinmektedir. Bu nedenle, GC sinyalizasyonu üzerindeki kirletici etkilerin in vivo olarak izlenmesine izin veren araçlara ihtiyaç vardır.

Zebra balığı, gelişim biyolojisinde uzun zamandır popüler bir model olmuştur ve son zamanlarda endokrinoloji12 de dahil olmak üzere diğer alanlardan araştırmacıları da cezbetmiştir. Diğer teleostlarla karşılaştırıldığında, zebra balığının GC sinyal sistemi memelilerinkine daha benzerdir, çünkü zebra balığı genomu, diğer birçok balık türündeki kopyalanmış reseptörlerin aksine yalnızca bir GR geni içerir13-15. Ek olarak, hipotalamik-hipofiz-adrenal eksen, 5 günlük zebra balığı larvalarında zaten işlevseldir ve bu da stresörlere yanıt olarak endojen GC üretimini arttırır14,16-18.

Yakın zamanda, GC sinyalizasyon aktivitesinin in vivo ve gerçek zamanlıolarak izlenmesine olanak tanıyan bir transgenik zebra balığı hattı olan GRE:Luc'u oluşturduk 18. Hat, minimal bir TATA kutu promotörü ve dört birleştirilmiş GRE'nin kontrolü altında bir lusiferaz raportör gen yapısı taşır (Şekil 1a). GC'nin neden olduğu biyolüminesans, uzun süreler boyunca in vivo olarak 96 kuyulu mikrotitre plakadaki tek GRE:Luc larvalarından ölçülebilir. Bu GRIZLY testi ("Glukokortikoid Duyarlı In vivo Zebra Balığı Luciferase aktivitesi için") stres araştırması, çevresel izleme ve farmakolojik taramalar gibi bir dizi farklı araştırma alanında kullanılabilir18. Tek larvalardan gelen ozmotik stresten sonra kortizoldeki endojen artışı tespit edebildik ve gelişim sırasında yanıtın olgunlaşmasını takip edebildik. Ayrıca, larva tarafından metabolize edilmesi gereken organotinlerin GC sinyalizasyonu üzerindeki etkilerini izleyebiliriz. Daha da önemlisi, hat bu etkileri çevresel olarak ilgili konsantrasyonlarda tespit edebildi. Son olarak, bir pilot taramada, tahlil, larvalarda endojen kortizol üretimini uyaran bir bileşik de dahil olmak üzere, bir kimyasal kütüphaneden GC aktivitesine sahip bileşikleri hassas ve spesifik olarak tespit etti. Burada, GRIZLY testini kullanarak kimyasal ekranlar için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Protokol

1. Kimyasal Kitaplığın Çalışma Seyreltmesini Hazırlayın

Test edilecek ilaç kütüphanesinin bileşiklerini (örneğin FDA onaylı ilaçlar, ENZO Life Science) robotik bir sıvı işleme istasyonu (örneğin Multiprobe II, atık uç adaptörlü 8 iğne, PerkinElmer) ile E3'e (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2) önceden seyreltin. Uygun konsantrasyonlar, örneğin% 3 DMSO'da 40 μg / ml'dir, ancak bu, kullanılan kütüphane tipine bağlı olacaktır. Aşağıda açıklanan adımlara karşılık gelen Multiprobe II ayarları Tablo 1'de belirtilmiştir. Tabloda açıklanan protokol, paralel olarak dört alikot plakasının hazırlanmasına izin verir.

  1. Stok kütüphanesinin 10 μl'lik alikotlarını (DMSO'da 2 mg / ml) derin kuyu plakalarına (örn. 96 Kuyulu Depolama Plakası, Yuvarlak Kuyu, 0.8 ml, ABgene) pipetleyin. Sütun 1 ve 12 boş bırakılmalıdır - bunlar plaka içi pozitif ve negatif kontrolleri alacaktır.
  2. 490 μl E3'ü %1 DMSO ile Multiprobe II ile kütüphanenin hazırlanan alikotlarına dağıtın. Seyreltme, atma uçları olmayan sabit iğnelerle yapılır.
  3. Plaka içi kontroller olarak sütun 1'e 10 μl DMSO ve sütun 12'ye 10 μl 5 mM deksametazon çözeltisi (DMSO'da) ekleyin. Tüm kuyucuklardaki DMSO konsantrasyonu şu anda %3'tür, pozitif kontrol kuyularındaki deksametazon konsantrasyonu E3/3% DMSO'da 100 μM'dir.
  4. Plakayı DMSO'ya dayanıklı yapışkan sızdırmazlık levhaları ile kapatın. Plakaları kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.

2. Muhabir Balıklarının Yetiştirilmesi

GRE:Luc transgenik balıklar arasındaki grup çiftleşmelerinin doğal yumurtlamasından embriyoları toplayın. Embriyoları (60'tan fazla olmayan) 9 cm'lik Petri kaplarında, 1 mg / ml mantar ilacı metilen mavisi ile desteklenmiş 1 mg / ml mantar ilacı metilen mavisi ile desteklenmiş 28 ° C'de bir inkübatörde bir inkübatörde yükseltin. E3 ortamını düzenli olarak değiştirin.

3. Lusiferaz Ortamının (E3L) Hazırlanması

Lusiferin tozu içeren şişeye dH2O ekleyerek 50 mM'lik sulu bir lusiferin stok çözeltisi hazırlayın. Bu stok çözeltisi -80 °C'de birkaç ay saklanabilir. E3L ortamı elde etmek için lusiferin stoğunu E3 ortamına 0,5 mM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.

4. Larvaları 96 Kuyu Plakasına Dağıtın

  1. Geniş delikli 1 ml pipet ucunu, ucun yaklaşık 5 mm'sini keserek ve keskin kenarları kısa bir süre alevlendirerek hazırlayın.
  2. Birkaç haçtan larvaları Petri kaplarından dikkatlice bir behere dökerek havuzlayın. Bir seferde yaklaşık 50 larvayı bir elek üzerine (gözenek boyutu 0,25 mm çapında) nazikçe dökerek hasat edin ve eleği hemen E3L ortamı ile doldurulmuş küçük bir Petri kabına (çap 5,5 cm) yerleştirin.
  3. Geniş delikli bir pipet ucuyla, her biri bir larva içeren 225 μl besiyerini 96 oyuklu beyaz bir plakanın (OptiPlate, PerkinElmer) kuyucuklarına aktarın.
  4. Plakaları yapışkan sızdırmazlık levhaları (örneğin TopSeal-A, PerkinElmer) ile kapatın ve gece boyunca 28 °C'de inkübe edin. Bu ön inkübasyon, kültürlenmiş hücrelerde de meydana gelen bir fenomen olan lusiferin ilavesinden hemen sonra biyolüminesanstaki geçici değişikliklerin kaydedilmesini önler19.

5. İlaç Tedavisi

  1. Kütüphanenin çalışma seyreltmesini içeren plakayı kullanmadan yaklaşık 80 saat önce -4 °C dondurucudan çıkarın. Plakayı hafifçe girdaplayın ve plakanın altındaki sıvıyı toplamak için bir santrifüjde kısa bir süre döndürün.
  2. Yapışkan sızdırmazlık tabakalarını larva plakalarından çıkarın.
  3. Elle çalıştırılan 96 kanallı bir pipetleme cihazı (örn. Liquidator, Steinbrenner) ile ilaç solüsyonunu 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, kimyasal kütüphanenin çalışma seyreltmesinin 25 μl'sini larvaları içeren kuyucuklara alikotlayın (yukarıdaki örnekte, bu,% 0.3 DMSO ile E3'te 4 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyon ile sonuçlanır). Kütüphane plakası başına larva içeren 10 (minimum: 5) replika plaka hazırlayın.
  4. Plakaları yapışkan sızdırmazlık levhalarıyla kapatın ve her plakayı bir barkod etiketi ile etiketleyin.

6. Lüminesans Kaydı

  1. Larvaları içeren plakaları, gelişmiş lüminesans hassasiyetine sahip bir EnVision biyolüminesans okuyucunun (PerkinElmer) istifleme ünitelerine yerleştirin. Alternatif olarak, okuyucu ile birlikte memeli hücre kültürü tarama sistemleri için kullanılanlar gibi robotize bir inkübatör sistemi kullanın.
  2. EnVision okuyucu için Tablo 2'de açıklananlara benzer okuyucu ayarlarını kullanarak iki gün boyunca biyolüminesans kaydedin. Gerekli çalışma süresine uyması için tahlil tekrarlarının sayısını, çalışmadaki plaka sayısına uyarlayın.
  3. Çalışmanın bitiminden sonra, bileşiklerin genel toksisitesini değerlendirmek için plakaları ölü larvaların varlığı açısından kontrol edin.

7. Veri Analizi

Tüm veri analizleri, özel komut dosyaları kullanılarak istatistiksel programlama ortamı R'de gerçekleştirilir.

  1. AUC hesaplaması
    Kinetik özelliklerinden bağımsız olarak GC sinyalini aktive eden bileşikleri tanımlamak için, tarama parametresi olarak kaydedilen lüminesans izlerinin eğrisi (AUC) altındaki alanı (biyolüminesans ham sayımlarına karşı zaman) belirleyin. AUC'ler trapez kuralı ile yaklaştırılır (bkz. Şekil 2a ve a').
  2. Normalleştirme
    Log, verilerin daha yüksek bir normalliğini sağlamak için AUC değerlerini dönüştürür (Şekil 2b ve b'). Ardından, sağlam Z-skoru yöntemiyle her bir kitaplık plakası için günlük dönüştürülmüş AUC değerlerini normalleştirin (bkz. 20). Bu normalleştirme, tüm veri noktalarının medyanından standart sapma sayısını temsil eden değerlerle sonuçlanır. Bu şekilde, çalıştırmalar arası değişkenlik gibi sistematik hatalar verilerden kaldırılır. Veriler artık her bir kuyucuk için replikaların ortalama sağlam Z-skoru çizilerek görselleştirilebilir (Şekil 2c ve c').
  3. Kalite metrikleri
    1. Isı Haritası
      Plaka ile ilgili etkileri görselleştirmek için, örneğin gplot paketi21'in ısı haritası.2 işlevini kullanarak her bir plaka için verileri bir ısı haritası olarak çizin. Bu şekilde, kenar etkileri veya bileşik taşınma kolayca tespit edilebilir (örneğin, Şekil 3a ile 3b'yi karşılaştırın). Optimal olmayan plakaları daha fazla analizden hariç tutun.
    2. ROC eğrisi
      Testin duyarlılığını ve özgüllüğünü belirlemek için, örneğin 7.2'de belirlenen Z-skor değerlerini kullanarak ROC biyoiletken paketi22'nin yardımıyla bir alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrisi hesaplayın (Şekil 3c). Daha sonra, bu eğrinin AUC'sini belirleyin. 1'e yakın bir AUC değeri, testin yüksek hassasiyetini ve özgüllüğünü gösterir.
  4. Hit Identification
    Aktif bileşiklerin tanımlanması için kesme değerini optimize etmek için Youden Endeksini belirleyin. Endeksi hesaplamak için, sağlam Z-skoru kesme değerlerini artırmak için tahmini gerçek pozitif oranı (TPR) ROC eğrisinin yanlış pozitif oranından (FPR) çıkarın. Kesme noktası olarak en yüksek Youden Endeksine (TPR eksi FPR) sahip sağlam Z-skorunu alın. TPR/FPR, pozitif kontrol kuyularının veya kütüphane içindeki bilinen aktif bileşiklerin tespiti ile tahmin edilebilir. Pozitif kontrol kuyularını kullanırken, beklenen vuruş gücüyle eşleştiklerinden emin olun.

8. Yeniden test etme

  1. Yukarıda açıklanan aynı kayıt kurulumunu kullanarak, larvaları farklı bir tedarikçiden elde edilen bileşiklerin seri seyreltmeleriyle muamele ederek pozitif isabet bileşiklerini yeniden değerlendirin. Gerçek isabetler, ideal olarak doza bağlı bir şekilde, bu tahlilde de lüminesansı indüklemelidir.

Sonuçlar

Önceki bir yayında18, GRIZLY analizinin performansını değerlendirmek için pilot bir taramada FDA onaylı 640 ilaçtan oluşan bir kütüphaneyi taradık. Bu kütüphane 12 bona fide GC içeriyordu; bu da analizin duyarlılık ve özgüllük kalite ölçümlerini belirlememize olanak sağladı.

Şekil 2, bu ekrandan alınan ham veri analizi ve normalizasyonun tipik örneklerini göstermektedir. Deksametazon kontrol kuyucuğundan elde edilen tipik bir sonuç Şekil 2a'da betimlenmiş olup verilerin sunduğu zamansal bilgileri örneklendirmektedir. Tedaviden yaklaşık 12 saat sonra meydana gelen biyolüminesans piki, sonraki 36 saatlik ölçüm süresince yavaşça azalmaktadır. Şekil 2a', trapez yöntemi kullanılarak AUC değerinin yaklaşık hesaplamasını vurgulamaktadır. Bu hesaplama tüm kuyucuklar ve her bir teknik tekrar için gerçekleştirilir. Logaritmik dönüşümün sonucu Şekil 2b ve b''de gösterilmiştir. Burada pozitif kontrollerin ortalaması normal bir Q-Q grafiğine işlenmiştir. Logaritmik dönüşüm, veri noktalarının kırmızı diyagonallerle belirtilen teorik normal dağılımlı değerlere daha fazla yaklaşmasını sağlar. Verilerin normalliğini sağlamak için yapılan bir dönüşüm, sonraki analizlerin istatistiksel gücünü artırır. Son olarak, Şekil 2c ve 2c', robust Z-skoru normalizasyonunun plakalar arası değişkenlik üzerindeki etkisini göstermektedir: Farklı plakalarla elde edilen farklı bazal değerler (Şekil 2c), Şekil 2c''deki robust Z-skoru grafiğinde normalize edilmiştir.

Robust Z-skor değerleri, hitlerin plakalar üzerindeki dağılımı görselleştirilerek verilerdeki sistematik hataların belirlenmesinde kullanılabilir. Şekil 3a, robust Z-skor değerlerinin kuyu konumlarına göre renk kodlarıyla çizildiği bir kütüphane plağı ısı haritası örneğini göstermektedir. Plaka içi pozitif kontrollerin bulunduğu 12. sütun kolayca tanımlanabilir. Pozitif skorlu kütüphane bileşikleri F8 kuyusunda ve daha zayıf olmakla birlikte E2 kuyusunda görülmektedir. Şekil 3b, sistematik bir hatanın mevcut olduğu bir plağı göstermektedir. A ve E satırlarında, birkaç sütun boyunca azalan Z-skor değerlerine sahip bir dizi bileşik gözlemlenmektedir. Bu kuyulardaki bileşiklerin hiçbiri yeniden test edildiğinde pozitif sonuç vermemiştir. Azalan GRIZLY test aktivitesine sahip bu kuyuklar, pipetleme robotunun kütüphane plakalarını alikotlarken izlediği yol boyunca yer aldığından, bu patern otomatik pipetleme işlemi sırasında pozitif bir bileşiğin taşındığının (carry-over) göstergesidir.

Güçlü Z-skoru normalizasyonu ve kütüphanede bilinen GC'lerin bulunması, tarama için bir alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi hesaplamamıza da olanak sağlamıştır18. Şekil 3c, farklı güçlü Z-skoru kesme değerleri için tahmini gerçek pozitif oranının tahmini yanlış pozitif oranına karşı grafiğini göstermektedir. Tahmini gerçek pozitif oranı, belirli bir güçlü Z-skoru kesme değerinde bulunan gerçek pozitif vuruşların (burada, kütüphanede bulunan bilinen glukokortikoidler) yüzdesi olarak tanımlanır. Karşılık gelen tahmini yanlış pozitif oranı, bu kesme değerinde vuruş yapan pozitif olmayan bileşiklerin yüzdesini belirtir. Bu eğrinin AUC değeri 0,95'tir; bu da taramanın yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahip olduğunu ve assay performansının mükemmel olduğunu göstermektedir. AUC eğrisi, farklı güçlü Z-skorları için Youden indeksini hesaplayarak vuruş tanımlama için optimal kesme değerini tahmin etmek amacıyla da kullanılmıştır. 1,49'luk güçlü Z-skorunun en yüksek Youden indeksine sahip olduğunu belirledik. Bu kesme değeri, Şekil 2c''de vuruşları bileşiklerin geri kalanından ayıran siyah bir çizgi olarak gösterilmiştir.

Taramamızda18, kütüphanede bulunan bilinen GC'lerin neredeyse tamamını tanımlayabildik. 12 bona fide GC'den yalnızca üçü tespit edilemedi. Melengestrol asetat durumunda, bu bileşik kütüphanede kullanılandan daha yüksek bir konsantrasyonda yapılan yeniden testte pozitif sonuç verdiği için bu durum yalancı negatif bir bulguydu. Diğer iki GC, yeniden testte de negatif çıktı. Kortikosteron kemirgenlerdeki ana GC'dir, ancak balıklarda veya insanlarda değildir1; ön ilaç olan prednizon ise larva sistemi tarafından iyi metabolize edilememiş olabilir. İlginç bir şekilde, GC olarak işaretlenmemiş iki ilaç da taramada tanımlanmış olup, bunlardan biri yeniden testte doğrulanamamıştır (bir mineralokortikoid reseptör antagonisti olan spironolakton). Diğer bileşik olan pregnenolon, steroid biyosentezinde bir öncül olup böbrek üstü bezi tarafından kortizole dönüştürülür. Nitekim, pregnenolon ile tedavi larvalarda kortizol üretimini stimüle etmiştir18. Tüm bu sonuçlar, assay'in yüksek performansını doğrulamaktadır: birincil tarama sonuçları arasında yalnızca bir yalancı negatif ve bir yalancı pozitif bileşik yer almış ve GC sinyalini stimüle eden aktiviteye sahip olduğu doğrulanan 11 bileşiğin 10'u halihazırda birincil taramada tanımlanmıştır.

Lusiferaz assay süreci; ilaç taramasını, veri toplamayı ve analizi gösteren denklemler ve diyagramlar.
Şekil 1. Assay'in genel prensibi ve tarama prosedürünün iş akışı. a) GRIZLY assay raporlayıcı konstrükt şeması. Lusiferaz (sarı) ekspresyonu, minimal bir promotör (Pmin, turuncu) ve ligand ile aktive edilen GR homodimerleri (GR, mavi) tarafından bağlanan dört konkatemerize GRE elementi ((GRE)4, beyaz) tarafından kontrol edilir. Kırmızı kutular, konstrüktün genomla entegrasyonunu kolaylaştıran Tol2 transpozaz bölgelerini belirtir. Pembe kutu, bir poli-adenilasyon bölgesini (pA) temsil eder. Bu konstrükte sahip transgenik larvalar, biyolüminesans ölçümleri için opak 96 kuyucuklu mikrotitre plakalara yerleştirilir. b) Lusiferaz reaksiyon şeması. Lusiferaz, lusiferinin oksilusiferine oksidasyonunu katalize eder ve bu da ışık yayılımına (hν) yol açar. Reaksiyon ayrıca larva tarafından sağlanan ATP ve Mg2+ gerektirir. PPi, pirofosfat. c) Tarama iş akışı. FDA onaylı bir ilaç kütüphanesinden, bir sütunu plaka içi negatif kontrol (yalnızca DMSO, yeşil) ve bir sütunu pozitif kontrol (Deksametazon, kırmızı) içerecek şekilde 96 kuyucuklu plakalarda çalışma stok dilüsyonları hazırlanır (kütüphane tasarımı). GRE:Luc larvaları 96 kuyucuklu plakalara dağıtılır (5-11 tekerrür) ve kütüphane bileşikleri ile işleme tabi tutulur (ilaç uygulaması). Biyolüminesans izleri, bir biyolüminesans okuyucu ile iki gün boyunca kaydedilir (veri toplama). Biyolüminesans izleri entegre edilir (AUC hesaplamaları), logaritmik olarak dönüştürülür ve robust Z-skoru ile normalize edilir (normalizasyon). Normalize edilmiş veriler, kalite metriklerinin belirlenmesi ve hitlerin tanımlanması için kullanılır (veri analizi). Seçilen hitler, assay'de doz bağımlı aktivite açısından yeniden test edilir (yeniden test). Şeklin daha büyüğünü görüntülemek için buraya tıklayın.

Biyolüminesans analizi; Q-Q grafiği, log dönüşümü, z-skoru normalizasyonu; veri görselleştirme.
Şekil 2. FDA onaylı bir ilaç kütüphanesi taramasından elde edilen verilerle örneklendirilmiş veri analizi. a) Pozitif kontrol kuyucuğundan alınan temsili iz. a') Eğri altındaki alan (AUC), yamuk kuralı ile yaklaşık olarak hesaplanmıştır. Hesaplama için kullanılan yamuklar farklı kırmızı tonlarında gösterilmiştir. b) Log dönüşümü öncesinde, pozitif kontrol kuyucuklarının ham AUC değerlerinin (y-ekseni) standart normal bir popülasyona (x-ekseni) karşı normal Q-Q grafiği. b') Log dönüşümü sonrası AUC değerlerinin normal Q-Q grafiği. Normal dağılım, log dönüşümlü veri noktalarının doğrusallığı ile belirtilmiştir. c) Taramada test edilen tüm bileşiklerin log dönüşümlü ham verilerinin grafiği. Mavi, bona fide glukokortikoidler; gri, diğer tüm bileşikler. c') Robust Z-skoru normalizasyonu sonrası tarama verilerinin grafiği. Plaklar arası varyasyonlar gibi sistematik hatalar verilerden temizlenmiştir. Kırmızı çizgiler, plaka içi pozitif kontrollerin ortalama ± s.e.m. değerlerini göstermektedir. Siyah çizgi: Youden-İndeksi optimizasyonu (Şekil 3) ile belirlenen hit tanımlama eşik değeri. 2012 ACS'den14 izin alınarak yeniden üretilmiştir. Şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayın.

Glukokortikoid taraması; ısı haritası, öngörücü analizi gösteren ROC eğrisi; floresan analiz sonuçları.
Şekil 3. Tarama sonuçları. a) Tarama sonuçlarının ısı haritası. Kütüphane bileşiklerinin robust Z-skoru değerleri ilgili kuyucuk konumlarına işlenmiştir. 12. sütundaki pozitif kontroller ile F8 ve E2 kuyucuklarındaki iki pozitif hit bileşik görülmektedir. b) Bir pipetleme robotu ile kütüphane hazırlığı sırasında pozitif bir bileşiğin taşınmasını gösteren plaka ısı haritası. Robotun izlediği pipetleme yolu boyunca bir aktivite gradyanı görülmektedir. c) Tarama için alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrisi. Artan robust Z-skoru eşik değerleri için (renk kodlu, sağ y ekseni) tahmini gerçek pozitif oranlar (sol y ekseni) ve yanlış pozitif oranlar (x ekseni) işlenmiştir. Ortaya çıkan eğrinin AUC değeri 1'e yakındır ve bu durum iyi bir analiz performansına işaret eder. 14, 2012 ACS'den izinle yeniden üretilmiştir. d) Birincil taramada (prim.) veya yeniden testte aktif (sarı) veya inaktif (mavi) olan bileşikleri gösteren tablo. Bona fide glukokortikoidler her zaman yeniden test edilmemiştir (beyaz). 14, 2012 ACS'den izinle yeniden çizilmiştir. Daha büyük şekli görüntülemek için buraya tıklayın.

Genel ayarlar:
Adım 1.1
Prosedür tür:tekli sıvı
mod:boşaltma (blow out)
aspirasyon başına dağıtım:1
hız için optimize et:Evet
hava boşluğu sistemi:10 μl
taşıma:0
Yıkama/Durulama Hayır
Aspirasyon Ayar Türü Değer açıklamalar
PozisyonB7, B10, B13, B16
Aspirasyon Hacmi10 μl
Hız200 μl/sec
Sıvı takibi60%
Aspirasyon YüksekliğiLaboratuvar ekipmanı varsayılanı22.28
Dağıtım Ayar Türü Değer açıklamalar
PozisyonlarD7, D10, D13, D16
Dağıtım Hacmi10 μl
Hız200 μl/sec
Sıvı takibi100 μl
Dağıtım YüksekliğiLaboratuvar ekipmanı varsayılanı17.01
Adım 1.2
Prosedür tür: reaktif
mod:atık
aspirasyon başına dağıtım:3
hız için optimize et:Evet
hava boşluğu sistemi:15 μl
taşıma:0
Yıkama/Durulama Hayır
Aspirasyon Ayar Türü Değer açıklamalar
PozisyonA4
Aspirasyon Hacmi3 x 490 μl
Hava boşlukları15 ve 0
Hız200 μl/sec
Sıvı takibi400%
Aspirasyon YüksekliğiSıvı yüzeyi
Dağıtım Ayar Türü Değer açıklamalar
PozisyonD7, D10, D13, D16
Dağıtım Hacmi490 μl
Hava boşlukları15 ve 0
Hız200 μl/sec
Sıvı takibi100%
Dağıtım YüksekliğiLaboratuvar ekipmanı varsayılanı17.01

Tablo 1. Multiprobe II Ayarları. protokolü şöyledir Tablo 1 4 plakanın (her biri 96 kuyucuklu) hazırlanışını tanımlar. Plakalar, çalışma alanındaki plaka adaptörleri üzerinde, robot tarafından belirtilen konumlarda yer alır (ör. B7, B10, B13, B16).

Genel ayarlar:
Analiz tekrar sayısı çalışma süresine bağlıdır
Plaka sayısısınırsız
Sıcaklık kontrolü28 °C
Protokol Hesaplamalar
US Lum 96 (cps) okuması
Ölçüm süresi2.5 secÇapraz etkileşim (Crosstalk) düzeltmesi
Plaka ve dedektör arasındaki mesafe0 mm
Glow (CT2) düzeltme faktörü0 %

Tablo 2. Tarama için kullanılan EnVision ayarları.

Tartışma

Burada, GRIZLY tahlili18 kullanılarak in vivo GC aktivitesini ölçen bir kimyasal ekran için iş akışını ve veri analizini sunuyoruz. Test, geleneksel hücre tabanlı ekranlarla karşılaştırılabilir kalite kontrol özelliklerine ve performans ölçümlerine sahiptir, bu da yüksek verimli ortamlarda kullanımı için önemli bir avantajdır. Bununla birlikte, ek olarak, in vivo tahlil, in vitro taramalar tarafından erişilemeyen bileşikleri de tespit eder. Bu, isabetler arasında prohormon pregnenolonunun varlığı ile örneklendirilir. Böylece, GRIZLY testi, GC sinyal aktivitesine yönelik ekranların kapsamını genişletir.

Testimizle in vivo etkilerin tespitinin önemi, organotin kirleticileri DBT ve TBT18 ile elde ettiğimiz sonuçlarla da gösterilmektedir. DBT'nin, ancak TBT'nin memeli hücre kültüründe GC sinyalini inhibe ettiği gösterilmiştir ve aynısını GRE:Luc raportörünü eksprese eden zebra balığı hücre kültürlerinde de gözlemledik. Bununla birlikte, daha da önemlisi, GRIZLY tahlilinde, TBT, larva metabolizması tarafından DBT'ye dönüştürülebildiği için GC yolunda inhibitör aktivite gösterdi. Bu inhibisyon, çevresel olarak ilgili TBT konsantrasyonlarında zaten gözlendi. Bu sonuçlar ayrıca, canlı hayvandaki bileşiklerin organlar arası çapraz konuşma ve metabolik modifikasyonlarına dayalı bileşik etkilerini tespit etmede GRIZLY testinin potansiyelini göstermektedir. Ayrıca GRIZLY testinin çevresel izleme için uygulama potansiyelini de vurguluyorlar. Bu nedenle, endokrin bozucu etkiler, bozucunun deksametazon gibi bir GR agonisti tarafından indüklenen GC sinyal aktivitesine müdahale ettiği reseptör sinyalleme düzeyinde incelenebilir. Diğer bir olasılık, pregnenolon ile uyarılan GC sentezi üzerindeki bileşik etkileri incelemektir. Testin yüksek verim kalitesi, çevresel numune kitaplıklarının hızlı bir şekilde taranmasına izin vermelidir.

Lusiferazın bir raportör gen olarak kullanılması, sinyal aktivitesinin23 yüksek dinamik bir algılama aralığına izin verir. Gerçekten de, testin hassasiyeti, tek larvalardan18 ozmotik stres kaynaklı GC üretimini tespit etmeyi mümkün kılar. Lusiferaz raporlayıcı ile elde edilen yüksek zamansal çözünürlük, zaman içindeki sinyal aktivitelerini takip etmemizi sağlar ve bu da verilerin kinetiğini analiz etmeyi mümkün kılar.

Bazı uygulamalar için potansiyel bir dezavantaj, bu raportör sisteminin mekansal izlenmesi için sınırlı uygunluktur. Floresan raportör sistemleri, larvaların belirli alanlarının izlenmesini gerektiren analizler için daha uygun olabilir. Bununla birlikte, bu tür tahliller, uyarma ışığının neden olduğu arka plan etkileri nedeniyle daha düşük hassasiyetlere maruz kalabilir ve bu da floresan bileşiklerin tespitinde sınırlar oluşturur. Ek olarak, floresan proteinlerin23 genel olarak daha yüksek stabilitesi nedeniyle daha az kinetik çözünürlük sağlayabilirler. Ayrıca, görüntüleme ekipmanı, veri analizi ve veri depolama açısından daha küçük araştırma laboratuvarları için kullanımlarını sınırlayabilecek zorluklar sunarlar.

GRIZLY testinin mikrotitre plakası tabanlı bir test olarak kurulması, tipik tarama iş akışlarına kolay entegrasyon sağlar. Test, basit kullanımı ve veri analizi nedeniyle daha küçük araştırma laboratuvarlarında da kolayca uygulanabilir. Aynı zamanda, örneğin pipetleme robotları tarafından otomatik ilaç uygulaması veya embriyoların embriyo ayırma cihazları tarafından otomatik olarak dağıtılması gibi önemli derecede otomasyona izin verir24,25. Basit okuma, otomatik tarama mikroskopları veya gelişmiş görüntü analiz yazılımı gerektirmez, ancak incelenen sinyal yolunun zamansal ve nicel yönleri hakkında zengin bir veri seti sağlar.

Özetle, in vivo ve gerçek zamanlı olarak GC sinyal aktivitesi için nispeten ucuz, sağlam ve kullanımı kolay bir kimyasal tarama testi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Test, bileşiklerin hücre kültürüne dayalı deneylerde saptanamayan GC sinyali üzerindeki in vivo etkilerinin belirlenmesine izin verir. Test için birçok uygulama arasında, örneğin glukokortikoid sinyallemesi üzerindeki genetik etkilerin belirlenmesi, glukokortikoid sentezi ve sinyal aktivitesi üzerindeki endokrin bozucu etkilerin çevresel olarak izlenmesi ve GC sinyallemesi üzerindeki istenmeyen etkiler için bileşiklerin taranması veya bu önemli sinyal yolunun yeni in vivo modülatörleri yer alır.

Açıklamalar

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Teşekkürler

Mükemmel teknik yardım için S. Burkhart, C. Hofmann ve Simone Gräßle'ye teşekkür ederiz ve veri analizindeki yardımı için M. Ferg'e minnettarız. Ayrıca el yazması hakkındaki eleştirel yorumları için S. Rastegar'a teşekkür ederiz. Studienstiftung des deutschen Volkes (MW'ye), DFG (DI913/4-1) ve KIT'teki Helmholtz Programı BioInterfaces tarafından sağlanan finansmanı kabul ediyoruz.

Malzemeler

Instruments
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tampon bileşimi + reaktifler
Dimetil sülfoksit (DMSO)Carl Roth GmbH Co KGA994.2
FDA onaylı ilaç kütüphanesiEnzo Yaşam BilimleriBML-2841-0100
LuciferinBiosynthL-8220
DeksametazonSigma-AldrichD4902
Metilen BlueSigma-AldrichM9140
E3N/AN/A5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2<
Multiprobe IIPerkinElmer8 kanallı, tek kullanımlık uç adaptörü ile donatılmış
Liquidator 96Steinbrenner Laborsystemeelle çalıştırılan 96 kanallı pipet
EnVision XCite Çok Etiketli Plaka OkuyucuPerkinElmerİstifleyici otomasyonu, sıcaklık kontrolü, barkod okuyucu ve gelişmiş lüminesans dedektörü
Plasticware + sarf malzemeleri
>96 Kuyulu Depolama PlakasıABgeneAB-0765yuvarlak kuyu, 0.8 ml
Kapak filmleri,ratiolab6018412kendinden yapışkanlı, DMSO dirençli
Pipet uçlarıSteinbrenner LaborsystemeLRF-200Llikidatör 96, 200 & için; l, düşük tutma
TopSeal-APerkinElmer6005185
OptiPlate-96PerkinElmer6005299beyaz opak 96 kuyulu mikroplaka
Barkod EtiketleriPerkinElmer1608182
filtreli polipropilen IsoTip pipet uçlarıCorningS058.4809
Animals
GRE: Luc balığıN/AZDB-TGCONSTRCT-120920-1, Avrupa Zebra Balığı Kaynak Merkezi EZRC, Karlsruhe'de mevcuttur
td colspan="4"> ile donatılmıştır.

Kaynaklar

  1. Norris, D. O. Vertebrate Endocrinology. , 4, Elsevier Academic Press. (2007).
  2. Kassel, O., Herrlich, P. Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects. Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).
  3. Baschant, U., Tuckermann, J. The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).
  4. Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).
  5. De Bosscher, K. Selective Glucocorticoid Receptor modulators. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).
  6. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).
  7. Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).
  8. Casals-Casas, C., Desvergne, B. Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption. Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).
  9. Grun, F., Blumberg, B. Minireview: the case for obesogens. Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).
  10. Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance. J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).
  11. Odermatt, A., Gumy, C. Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals. Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).
  12. Lohr, H., Hammerschmidt, M. Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease. Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).
  13. Schaaf, M. J. Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish. Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).
  14. Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).
  15. Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).
  16. Alsop, D., Vijayan, M. M. Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).
  17. Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance. Steroids. 75, 918-925 (2010).
  18. Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate. ACS Chem Biol. 7, (2012).
  19. Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).
  20. Birmingham, A. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
  21. Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).
  22. Carey, V., Redestig, H. ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , Boston, MA, USA. (2013).
  23. Fan, F., Wood, K. V. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).
  24. Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates. J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).
  25. Letamendia, A. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS ONE. 7, e36690(2012).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

GRIZLY AnaliziTransgenik ZebrafishIn Vivo GörüntülemeVeri NormalizasyonuKalite KontrolYüksek Verimlilik
Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling'den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.