Burada in vitro glikojen titrasyonu için bir doğru, tekrarlanabilir ve uygun biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik Abcam Glikojen deney kiti kullanır ve floresan ile titrasyon glikoz ve glikoz glikojen ardışık hidrolizi dayanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Glikojen omurgalı hayvanlarda glikoz ana enerjik polimerdir ve önemli bir tüm vücut metabolizmasında rol hem de hücresel metabolizmada oynar. Glikojen tespit etmek için birçok yöntem zaten var ama sadece birkaç nicel vardır. Burada glikoamilaz glukoza glikojen özel bozulması dayanır Abcam Glikojen deney takımı kullanılarak bir metodu tarif etmektedir. Glukoz sonra özellikle floresan üretmek için OxiRed prob ile reaksiyona giren bir ürün için oksitlenir. Titrasyon doğru, hassas ve hücre ekstreleri veya doku bölümleri üzerinde elde edilebilir. Bununla birlikte, diğer tekniklerin aksine, bu hücrede glikojen dağılımı hakkında bilgi vermemektedir. Bu tekniğin bir örneği olarak, normoksiyada kuluçkaya iki hücre hatları, Çin hamsteri akciğer fibroblast CCL39 ve insan kolon karsinoma LS174, hipoksi karşı (% 21 O 2) (1% 2 O) burada glikojen titrasyonu açıklar. Biz hipoksi bir sig olduğunu varsaydıknal o hücreleri 1, hayatta kalmak için sentez ve mağaza glikojen hazırlar.
Giriş
Glikojen pek çok hücre sitoplazması içinde mevcut olan glikoz kalıntısının bir multibranched polimerdir. Bu hücrelerde enerji depolama ana biçimlerinden biridir ve glikoz metabolizmasında önemli bir rol oynar. Çoğu memeli hücreleri hızla metabolik stres sırasında glikoliz ve ATP üretimini teşvik etmek için glikoz içine bozulmuş olabilir ve mağaza glikojen, üretebiliriz. Hepatositler böylece vücuda glikoz sürekli tedarik sağlayan kan şekeri seviyesini düzenlemek için glikojen büyük miktarda üretir. Bunun aksine, diğer hücreler (kas, kırmızı kan hücreleri, vs) glikojen konsantrasyonu, nispeten düşüktür. Bununla birlikte, lokal olarak, bu miktarlar hücreler birden besin yoksun bir ortama maruz kaldıklarında kısa vadede enerji sağlamak için yeterlidir.
Glikojen sentezi ve glikojen dökümü tüm dokularda aynı adımlar (Şekil 1) takip eder. İlk olarak, glikozglikoz taşıyıcılannın (gluts) ile hücrelere girer ve hızla fosfoglukomutaz glikoz-1-fosfat (G1P) glukoz-6-fosfat (G6P) dönüştürülür. G1P sonra UDP-glikoza modifiye edilir ve UDP-glikoz karbon C1 glycogenin, glikojen ankraj protein tirosin artığı bağlanmıştır. Bu molekül, bir glikojen primer olarak, glikojen sentaz üzerinden bir α (1 → 4) bağı ile terminal glikoz için UDP-glikoz eki ile uzatılır. 11 den fazla glikoz kalıntısının doğrusal bir zincir meydana getirildiği zaman, son olarak, dallanma enzimi, bir at α (1 → 6) bağı vasıtasıyla bir zincirin glikoz 6 glikoz kalıntısı, en az oluşan bir terminal oligosakkarit aktarır. Bu işlemin tekrarlanması tur başına 6.5 glükoz ile bir sarmal oluşturmak dalları ihtiva eden büyük bir fraktal bir yapı verir. Glikojen uyumlu eylem glukoza ters hidrolize olabilirBir dalın glikoz son artık ile glikojen molekülü arasındaki sınır glikosidik α (1 → 4) hidrolize α (1 → 6) bağlı ve glikojen fosforilaz hidrolize eden enzimler dallara ayrılmayı giderme bölgesinin. Glikojenolizin olarak bilinen bu reaksiyon, (ATP tüketimine yansıtan) AMP seviyelerinin arttırılması ile aktive ve glikoz ve ATP 2,3 ile inhibe edilir.
Elektron mikroskobu ile, glikojen molekülü bir çok hücre tipinde çapı 15-30 nm olarak β serbest parçacıklar (ya da glikojen monopartıcles) 'de tarif edilmiştir. Hepatositler gibi özel hücre tiplerinde, β parçacıklar 80 nm ila 200 nm, 4, maksimum çapı da değişebilir α partiküller olarak bilinen rozetler, oluşturulması için bir kompleksi içine monte edilebilir . Bu parçacıklar β α parçacıkların büyük kümeler oluşturmak için bağlı oldukları şekilde hala tam olarak aydınlatılamamıştır. Bazı kanıtlar β parçacıklar kovalent bağlama 5, hidrojen bağlanması, ya da protein-protein etkileşimleri yoluyla 6 ile bağlanmış olabilir kanıtlamak eğilimindedir. Hücrelerinde depolanmış olan glikojen miktarı, bir çok parametreye bağlıdır: (I) glikojen sentezini başlatır hücrede glycogenin miktarı, protein fosforilasyon / defosforilasyon düzenlenir glikojen sentaz ve fosforilazın (II) aktivitesi, (III) konsantrasyonu örneğin damar sistemi glukoz kaynağı ve hücreleri tarafından glikoz alımının gibi çeşitli parametrelere bağlıdır hücrelerin, glikoz. Glikojen depoları sıkı enerji metabolizmasını düzenleyen hormonlar tarafından, ara metabolitleri yoluyla biyosentetik hormonların allosterik yönetmelikle düzenlenir ve besin algılama sinyal yollarının 7 tarafından edilir.
Bu olmak önemlidirdaha tüm vücut ve hücresel düzeyde glikojen metabolizmasının önemini anlamak için biyolojik numunelerde glikojen ölçmek mümkün. Biz burada glikojen için in vitro deneyinde bir hassas, yeniden üretilebilir ve uygun biyokimyasal açıklar. Bu teknik, glikojen özel hidroliz öncesi ve sonrası glikoz miktar floresan dayanmaktadır.
Diğer yöntemler hücrelerde glikojen seviyesini tahmin etmek vardır, ama bunların çoğu kantitatif değildir. Hücrelerde glikojen ölçümü için tarif edilen birinci tekniklerden biri glikojen 8,9 halinde [14C]-glükoz dahil ölçümüne dayanıyordu. Radyoaktivite kullanılması işlemek için bu işlem daha zor hale getirir ama glikojen içine ve dış dallarına ve molekülün çekirdek glikoz kalıntısının dağılımı arasında ayırt glikoz dahil oranını temin etme avantajına sahiptir (aynı zamanda bir gerektirir Ek β-amylolysis ve kromatografik adım). Başka bir teknik, daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve 2-NBDG eklenmesi dayanır (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oksa-1 ,3-diazol-4-il] amino}-2-deoksiglukoz), bir glikojen 10 içine 2-deoksiglukoz floresan türevi. Ölçülen floresans yoğunluğu üretilen glikojen miktarını yansıtır ve bir floresan okuyucu ile ölçülebilir. Hücredeki floresan dağılımı da konfokal mikroskopi ile değerlendirilebilir.
Diğer nonquantitative teknikler arasında, Periyodik asit-Schiff boyama (PAS) belki de en yaygın olanıdır. Bu, sabit hücrelerde, parafin içinde doku bölümleri ya da dondurulmuş olarak glikojen tespiti için de kullanılabilir. Mor Bu histolojik teknik renkler olmayan özel polisakkaritler, glikolipitler, glikoproteinler, selüloz ve nötr müsinler. Bu testin özgüllüğü özel olarak glikojen digests diastaz, sabit hücre veya doku kesitlerinin tedavisi ile arttırılabilir. Daha sonra,glikojen nitel düzeyi (karbonhidrat dışında glikojen makro molekülleri modifiye edilmiş) hidrolize örnekler hidrolize olmamış örnekleri (her karbonhidrat değiştirilmiş makro moleküller) karşılaştırılması ile tahmin edilebilir. Glikojen biyokimyasal deneylerde farklı PAS boyanması ve mikroskopik analizleri, dağınık ya da hücrenin belirli bir kısmı içinde konsantre edilebilir hücrede glikojen dağılımı hakkında bilgi sağlar. Hatta farklı koşullar arasında glikojen birikiminin PAS boyama tahminler farklar da, ancak, bu 11 kantitatif değildir.
Bir monoklonal fare antikoru başlangıçta in vitro antijen 12 hücrelerinde glikojen ve saflaştırılmış glikojen ile tepkimeye gösterildiği gibi çene kondiler kıkırdak kullanılarak yapılır. Bu antikor özel olarak glikojen ilgili şeker zincirleri kabul ettiği gibi, bu PAS boyanması daha özel bir şekilde immünohistokimya ile glikojen tespiti için yararlı bir araçtır.
Elektron mikroskopisi hücreleri ve glikojen depolama derecesinin değerlendirilmesinde glikojen tanelerinin görüntülenmesini sağlayan bir başka tekniktir. Aslında, glikojen β parçacıkların elektron yoğun granüller 1 gibi bir elektron mikroskobu ile kolayca tanınabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu
1.. Cell Lysis
- 100 mm çaplı tabak başına 0.5-2 x 10 6 konsantrasyonunda tohum hücreleri.
- Tedavi: hücreleri inkübe 24,% 1 veya% 0.1 O 2,% 94 ya da ayarlanmış bir Bug-Box anaerobik çalışma istasyonu (Ruskinn Teknoloji Biotrace International Plc, Bridgend, UK) düşük oksijen konsantrasyonu (hipoksi) 48 ya da 72 saat % 94.9 N 2 ve% 5 CO 2. Buna paralel olarak, (% 21 O 2,% 5 CO2) normoksiyada hücreleri inkübe edin. Deney zamanında glikoz konsantrasyonundaki değişimleri en aza indirmek için, her 24 saat (25 mM glikoz-içeren ortam) ortam değiştirin.
- Tedaviden sonra hücreler, yıkama kültür ortamından glukoz izlerini çıkarmak için PBS ile 2 kat. Soğuk PBS hücreleri kazıyın.
- 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüje çözeltisi, süpernatantı atmak ve bir kez PBS ile pelet yıkayın. Pelet fazla ilerlemeden önce -20 ° C'de dondurulmuş olabilir.
- Damıtılmış su, 100 ul pelet tekrar. Glikojen Assay Kit (Abcam) ile sağlanan glikojen Hidroliz Tampon 100 ul ekleyin. Enzimleri inaktive etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C 'de lizat kaynatın.
- Çözünmeyen ürünleri çıkarmak için 10 dakika boyunca 13,000 rpm'de Vorteks ve santrifüj lizat. Süpernatant tutun.
- Örnekler arasındaki protein içeriğine glikojen seviyeleri normalleştirmek için, proteinlerin ölçümü bisinkoninik asit yöntemi (BCA-Interchim) kullanılarak 25-35 ul süpernatan ile yapılabilir.
Lizat bazı hücrelerin içinde serbest glükoz konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir.
2. Glikojen hidrolizi
- Hidroliz Enzim Karışımı 1 ul süpernatan (aşama 1) 50 ul karıştırın. Bu karışım glukoamilazı içerir. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Standart glikojen seyrelterek, kalibrasyon eğrisinin hazırlanması (2 mg / ml) shidroliz tamponu içinde 10 ug / ml 'lik bir solüsyonuna kiti ile upplied. Daha sonra, altı ayrı 0 ile tüpler, 4, 8, 12, 16, ve 10 ug / ml bir standart 20 ul hazırlamak ve 0 glikojen bir konsantrasyon vermek üzere hidroliz tampon maddesi ile 50 ul'lik nihai bir hacme kadar her bir tüp ayarlamak 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16 ve 0.2 ug / ml. Standartlarda hidrolizi Enzim Karışımı 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
Serbest glukoz konsantrasyonu için değer ile verilen hücre çizgisinin arka glikoz konsantrasyonu, hücre glikojen seviyesini belirlemek için toplam glikoz konsantrasyonu (glikojen hidroliz + serbest-glikozdan, glikoz) için değerden çıkartılır gerekir.
3. Kalkınma ve Floresans Okuma
- Her bir durumda, serbest glükoz konsantrasyonu ve iki boruyu ölçmek için (boru 1) bir tüp hazırlanması (boru 2 ve 3), toplam glikoz konsantrasyonunu (her boru wit ölçmekhidrolize glikojen ha farklı ses).
- Borunun 1 içinde 1 aşamasının sonunda ekstre süpernatan 15 ul ekle. 50 ul bir son hacme tamamlamak için hidroliz tamponu 35 ul ekle. Elde edilen floresan, serbest glükoz konsantrasyonunu verir.
- Tüp 2 (adım 2'de elde edilmiştir) hidroliz glikojen X ul ekleyin. 50 ul bir son hacme kadar ayarlayın. Numune hacmi (X ul) kalibrasyon eğrisinin konsantrasyonları dışında değildir floresans değerler elde etmek amacıyla hücre yoğunluğu ve / veya hücre tipine göre ayarlanmalıdır.
- Borunun 3 içinde hidrolize glikojen 2 X ul ekleyin. 50 ul bir son hacme kadar ayarlayın.
- Her tüp için Kalkınma Tampon 48.7 ul, Kalkınma Enzim Mix 1 ul ve (Glikojen Assay Kit verilen) OxiRed Probe 0.3 ul karıştırılarak numuneler ve standartlar için bir geliştirme çözüm hazırlayın. Örneğin, 2 koşullar için, 12 borusu için bir karışımını hazırlamaks (standartları 6, serbest glükoz 2 ve toplam glikoz floresan 4).
- Her tüpe bu karışımı 50 ul eklenir ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Tavsiye edildiği gibi 535 nm, 587 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir uyarma dalga boyunda floresan ve bir eksitasyon ve emisyon için 3 nm'lik bir yarık ölçün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tümör hücrelerine karşı tümörler sinyaller oksijen (hipoksi) hayatta kalmak üzere, daha sonra besin tüketimi işlemek için enerji depolamak için ihtiyaç bir düşük düzeyde. Glikojen memeli hücrelerinde glikoz ana enerji polimer olduğu için, hipoksi glikojen depolama düzenleme incelenmiştir. Tablolar 1, 2 ve 3 'de gösterildiği gibi, hücre lizatları içinde glikojen konsantrasyonunun hesaplanması ve standardizasyon floresans ham veriler üzerinde gerçekleştirilmelidir. Glikojen için biyok...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
In vitro olarak glikojen biyokimyasal titrasyon hücreleri glikojen içerik doğru bir ölçümü sağlar. Diğer bazı teknikler (bir glikojen antikor ile PAS, immunofloresans, vb.) Ile karşılaştırıldığında, bu titrasyon çok özel, hassas ve tekrarlanabilir. Bu radyoaktivite, ancak florasan spektrometre gerektirdiğinden Ayrıca, yöntem uygundur. Ancak, bu teknik, nicel ve hücre içinde glikojen dağılımı hakkında bilgi sağlamaz.
Bu yazıda tarif edilen teknik, hücre ekstreleri üzerinde e...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.
Teşekkürler
Biz bize florasan spektrometre kullanmak için izin verdiği için ve onun yardım için Dr Thierry Pourcher minnettarız. Laboratuvar Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée) tarafından finanse edilen, Dernek la Recherche contre le Kanser, Institut National du Yengeç (Inca) dökmek, Agence Nationale la Recherche, METOXIA (AB programı FP7), Centre dökmek A. Lacassagne, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale ve Nice Üniversitesi ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Biz eleştirel okuma ve editoryal düzeltme için Dr M Christiane Brahimi-Horn teşekkür ederim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glikojen Test Kiti | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Floresan Spektrometresi | PerkinElmer | LS 50B |
Kaynaklar
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
