Translational Vaskülarize Kompozit allotransplantasyon (VCA) Araştırma için Modifiye heterotopik Domuz Hind Ekstremite nakli Modeli

Özet

Vaskülarize Kompozit allotrans (VCA) klinik bir gerçeklik haline gelmiştir. Bununla birlikte, VCA geniş klinik uygulama kronik çoklu ilaç bağışıklık bastırılması ile sınırlıdır. Yazarlar, en aza indirmek veya potansiyel olarak VCA bağışıklık ihtiyacı ortadan kaldırabilir, yeni bağışıklık stratejileri çevirmek için güvenilir ve yeniden üretilebilir bir büyük hayvan modeli sunar.

Özet

El ve yüz nakli gibi Vaskülarize Kompozit doku yaması (VCA) kompleks iskelet travma ve yıkıcı doku kaybı için uygun bir tedavi seçeneği temsil eder. Olumlu ve son derece cesaret verici erken ve orta fonksiyonel sonuçlara rağmen, bir VCA son derece immünojenik cilt bileşeni ve kronik çoklu ilaç immünosupresyonun potansiyel yan etkileri reddi VCA yaygın klinik uygulama engellemeye devam. Bu nedenle, bu yeni alandaki araştırmalar VCA benzersiz immünolojik özellikleri ile ilgili öteleme çalışmalara odaklanmak ve uzun süreli bağışıklık için gerek kalmadan VCA aşağıdaki immünomodülasyon ve toleransın için yeni immunomodulator stratejiler geliştirmek gerekiyor.

Bu makalede, bir MHC-tanımlı domuz heterotopik arka uzuv doku yamasında bir osteomyocutaneous kanat oluşur VCA güvenilir ve yeniden üretilebilir bir translasyon büyük bir hayvan modeli açıklar. BriEFLY, iyi vaskülarize cilt kürek yakın kızılötesi lazer anjiyografi kullanılarak anteromedialinde uyluk bölgesinde tanımlanır. Altta yatan kasları, diz eklemi, distal femur ve proksimal tibia femoral vasküler pedikül üzerinde hasat edilir. Bu, allograft bir VCA ve kendine özgü bir bağışıklık imtiyazlı özelliklere sahip bir vaskülarize kemik iliği nakli hem de kabul edilebilir. Greft bağışıklık takibi için dorsolateral bölgeye ucu dışarıya bir deri bileşeni ile alıcı hayvanda bir deri altı cep abdominal transplante edilir.

Üç cerrahi ekipler, böylece bu modelin etkinliğinin artırılmasında ve deneysel protokolleri potansiyel zorlukları azaltarak, anestezi ve iskemi süresini azaltmak için iyi koordineli bir şekilde aynı anda çalışır. Bu model potansiyel olarak azaltmak ve VCA kronik çoklu ilaç bağışıklık ihtiyacını ortadan kaldırmayı amaçlayan gelecekte tedavi stratejileri için zemin olarak hizmet etmektedir.

Giriş

El ve yüz nakli gibi Vaskülarize Kompozit doku yaması (VCA) artık dünya çapında ^{12 Gerçekleştirilen} sayıda el ve yüz nakli ile klinik bir gerçeklik vardır. Erken ve ara sonuçlar uygun ve son derece ² teşvik olduğu gerçeğine rağmen, birden fazla ilaca kronik bağışıklık gereksinimi yaygın klinik uygulama sınırlamaya devam etmektedir. Süper mikrocerrahi anastomoz ve nonsuture manşet teknikleri ¹³ dahil VCA kemirgen modellerinde ^{gelişmeler, 3} VCA alloimmun yanıtları daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. Immunomodülatör protokolleri onbinlerce VCA immün mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına dayalı klinik uygulamalar için önerilmiştir ancak insanlarda ⁷ performansları oldukça öngörü olurdu bir büyük hayvan modelinde doğrulanmış olması gerekir. Insan ve domuz organ sistemleri arasındaki fizyolojik ve immünolojik benzerlikler dayalı ^{6, domuz VCA modelleri 9 Canin güvenilir ve maliyet-etkin alternatifler olarak kabul edilir ve insan olmayan primat modelleri 1. edilebilir.}

Bu makale VCA immün toleransını uyaran ve dolayısıyla klinik uygulamayı genişletmeyi amaçlayan mevcut ve gelecekteki immünomodülatör stratejileri için zemin olarak hizmet eden MHC-tanımlı domuz heterotopik arka bacak nakli modelinde, kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir bakış sağlar. Biz özellikle transplant ile ilgili araştırma ¹¹ kendi kullanımı için domuz lökosit antijen lokusuna homozigosite için yetiştirilen iyi karakterize edilmiş inbred domuz kullanmaktadır. Biz femoral damarlar dayalı bir vaskülarize osteomyocutaneous flep yükseltmek. Flep distal femur ve proksimal tibia bozulmamış vaskülarize kemik iliği içerir. Anteromedial uyluk deri de greft dahildir ve en immünojenik bileşen, O bağışıklık takibi için alıcı hayvanın dorsolateral yönüne dışarıya alınırf VCA. Dorsolateral konumlandırma pozisyonları ayakta ve otururken klinik muayene kolaylaştırır ve ayrıca nispeten temiz allogreft cildi tutar.

Ustener vd. Outbred çiftlik domuzlarda ¹⁵ radyal ön ayakları osteomyocutaneous flep nakli ile VCA ilk büyük hayvan öteleme modellerinden birini tanıttı. Grup, bağışıklık kazandırma özelliği yüksek cilt bileşen dahil VCA akut reddi önemli ilaca özgü komplikasyonlar ve yan etkiler olmaksızın gecikmeli ve klinik olarak anlamlı bir strateji ile tedavi edilebilir ki ilk kez göstermek için bu modeli kullanılmıştır. Bu çalışmada elde edilen olumlu sonuçlar sonradan insan rekonstrüktif nakli için ilaç rejimlerinin tasarımında temel bir adım inşa etti. Bu erken domuz VCA modelleri deri, kas, kemik, sinir ve bu tür eklem cartilag gibi özel yapıları yoksun damarlarının reddini önlemek için protokol geliştirmek için de uygun olmasına rağmene ve eklem sinovyal zarlar. Daha sonraki çabaları greft çıkmasını önlemek için ¹⁴ tam uzunlukta döküm yerleştirme gerektirdiği hayvanın medial hanesi dahil üzerinde duruldu. Uzuv nakli tüm önemli bileşenler reddini araştırmak için uygun olsa da, bu modelin önemli sınırlamalar bir yerleşim döküm nedeniyle nakil sonrası ayaktan zorluk oldu. Böylece, heterotopik domuz uzuv alotransplantasyon modelleri, tibia oluşan, fibula, diz eklemi, distal femur, çevresindeki kas ve deri kürek, hayvan serbestçe minimal morbidit ⁸ ile postoperatif yürümelerine izin verirken öncelikle VCA immünolojik yönlerini incelemek için oluşturulan .

Dr David H. Sachs öncü çalışmaları ile iyi karakterize SLA-tanımlı kendilenmiş domuz gelişmesi öteleme VCA araştırma yeni bir çığır açmıştır. Küçük bir antijen uyumsuzluğu ortamda, Mat bir heterotopik arka bacak nakli modeli kullanılarakhes ve diğ. ^10. siklosporin tedavisinin kısa bir ders ile kas iskelet bileşenlerin belirsiz sağkalım göstermiştir. Hiçbir tedavi kontroller ile karşılaştırıldığında hayatta kalma Cilt bileşeni, ancak, sadece uzun süreli edildi. Greft cilt bileşeninin kaybı epidermise, özellikle bir izole edilmiş ve son derece güçlü bir immün yanıt, atfedilmiştir. Benzer şekilde, T-hücresi azalması, siklosporin ve sadece kas-iskelet sistemi bileşenlerinin ve deri bileşene tolerans sebep olduğu sitokin harekete donor periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin kısa süreli tamamen uyumsuz domuzlar kullanılarak hala ⁵ reddedildi. 'Split hoşgörü' olarak adlandırılan bu olgu, bugüne kadar yapılan rekonstrüktif nakli çoğunluğunun ayrılmaz bir bileşeni olan yüksek immünojenik cilt bileşen, üzerinde daha büyük bir odaklanma ile VCA araştırma bir paradigma değişikliği getirdi.

Bu şekilde değiştirilmiş bir modelde, ligatin ile uç-uca anastomoz kullanmaktadırg alıcı femoral arter ve dönen o (Şekil 1) sefalad. Bu, geleneksel bir birleştirme cihazının kullanımına izin vererek, iskemi süresini kısaltır hem de anastomoz başarısızlık şansını azaltır değil. Biz, kollateral dolaşım yerel bacak damarlanma sağlamak için yeterli olduğunu göstermektedir bizim alıcılarında femoral arter ligasyonu, aşağıdaki herhangi bir iskemik olay görülmez. Buna ek olarak, bu değiştirilmiş yöntemde, dışa deri bileşeni temel gemiler delme göre harekete ve geleneksel modeli ¹⁰ içinde bir kasık ventral pozisyonda aksine (Şekil 1) yanal olarak yerleştirilir. Bu, ayakta veya hayvanın oturma pozisyonunda bağışıklık takibi için greft kolayca görüntülenmesini sağlar.

Bu nedenle, güvenilir ve yeniden üretilebilir bir hayvan modeli büyük VCA cilt bileşeni karşı tolerans indüksiyonu stratejiler araştırmak ve yeni N geliştirmek için gereklidirgreft sağ kalımı daha iyi tahmininde oninvasive bağışıklık izleme stratejileri.

Protokol

Bu Video yayında, tüm hayvan prosedürleri Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış bir hayvan protokolüne uygun olarak yapılmıştır.

1.. Preoperatif Planlama

1. Biz MGH bir erkek donör iki bayan alıcılar için uzuvları (Şekil 1) temin eder uzuv allotransplantasyon için çeviri çalışmalarında minyatür domuz (15-20 kg) akrabası MHC-tanımlı kullanmaktadır. Ameliyat öncesinde, verici ve alıcı hayvanlar bir veteriner hekim tarafından ayrıntılı bir klinik değerlendirme.
2. Anestezi ve iskemi süresini en aza indirmek amacıyla, donör ve alıcı prosedürleri, bir adanmış büyük hayvan ameliyathanede üç faaliyet masalarda aynı anda yapılmaktadır. Cerrahi ekibin yanı sıra veteriner personel arasında ekip çalışması ve koordinasyon bu prosedürün genel başarısı için kritik öneme sahiptir. Cerrahi planı resmi bir toplantıda 1 veteriner ekibi ile tartışılacakÖnce cerrahi güne -2 hafta.
3. Bir tünelli santral venöz kateter (7 Fr çift lümen Hickman kateter) önce immünsüpresif ilaç düzeyi izleme ve immunsupresif ve / veya bağışıklık ilaçların intravenöz uygulama için nakli için alıcı her hayvanın bir harici veya dahili jugular ven yerleştirilir. Bu kateterler venöz cut-down tekniği ile direkt görüş altında yerleştirilir ve dorsal boyun ve yüksek çıkmak için posterior tünelli olan monofilament emilemeyen sütürler ve boynuna yapışkanlı bandaj sargı kullanarak güvenli.
4. Ameliyattan önce en az 12 saat NPO (hiçbir katı gıda ama su reklam lib izin verilir) hayvanları tutun.
5. Ameliyat gününde, ketamin 20 mg / kg ksilazin ve 2 mg / kg ile IM oturaklı hayvanlar.
6. Uygun büyüklükte bir endotrakeal tüp yerleştirin ve anestezi makine ve ventilatöre bağlamak (izofluran% 0.5-3 üzerinde muhafaza)
7. Marjinal kulak damar damardan kateter koyun ve yönetmekağırlığı prosedür süresince% 0.9 salin göre.
8. Rüçhan analjezi (buprenorfin 0.02 mg / kg IV) yönetmek.
9. Öncesinde donör ve alıcı hayvanların hem ilk kesi profilaktik antibiyotik (sefazolin 20-25 mg / kg IV) yönetmek.
10. Alıcıların ve donörlerin hem de tüm işlemlerde steril tekniği kullanın. Bu otoklava veya gaz steril aletleri, maskeler, baş kapaklar, steril cerrahi önlük ve steril eldiven kullanımını içerir. Rp ile kesi alanı tıraş ve Betadinede çözüm ve alkol alternatif ile dezenfekte edin.

İntraoperatif İzleme:

1. Indüksiyon ve entübasyon sonrası, oksijen bir soluma karışımı% 0.5-3 izofluran ile anestezi korumak.
2. Kalp hızı, pulse oksimetre, EKG, end-tidal CO ₂ ve devamlı rektal sıcaklığını izlemek ve her 15 dakika kayıt.
3. Bir Bair Hugger sıcak zorla hava battaniye ile hipotermi önlemek.

Osteomyocutaneous Ekstremite Alogreft Hasat Donör Pig:

1. Ameliyat masası üzerine sırt üstü yatırıldı, donör hayvan koyun ve steril bir şekilde asmak.
2. Anteromedial cilde delme gemileri belirlemek için yakın-kızılötesi lazer anjiyografi kullanın. Periferal vasküler erişim yoluyla normal tuzlu su içinde 2-5 ml seyreltilmiş indosiyanin yeşili, yaklaşık 0.06 mg / kg enjekte edilir. Yaklaşık 10 saniye sonra, kızıl ötesine yakın kayıtların 30 sec-2 dk gerçekleştirin. Delgi tanımlamak için bu kayıtlar videoyu kullanın. Deliciler göre, izleme için bir deri alanına (yaklaşık 100 ^cm2) işaretleyin.
3. Cilt kürek için işaretler ile süreklilik içinde bir kasık cilt kesisi (Şekil 2) yapmak için bir neşter kullanın.
4. Femoral damarları belirlemek ve suprageniculate şube seviyesine ve proksimalde inguinal ligament seviyesinde distaline onları tecrit.
5. Preservin ise deri ve deri altı dokusu dissekeg deri raket alanı. Flep hasat sırasında kasılmasını önlemek için kasları altta yatan derinin kenarlarını dikin.
6. Sadece bir pistonlu testere (Elektrik Pen Drive, Synthes, West Chester PA) kullanarak tarsus üzerinde bir osteotomi gerçekleştirin.
7. Elektrokoter kullanarak uyluk proksimal kasları bölün.
8. Vasküler pedikül üzerinde bir osteomyocutaneous kanadı bırakarak orta şaftının femur bölün. Flep cilt kürek, altta yatan uyluk kasları, diz eklemi, distal femur ve eşsiz immünolojik özellikleri ile sağlam vaskülarize kemik iliği içeren proksimal tibia içerir.
9. Kemik iliği mekanlarda Hemostaz sağlamak için, kemik mumu kullanın. Düzgün kemik alıcı için hazırlık ronjeurs kullanarak kenarları.
10. Alıcının femoral damarlar (Şekil 3) hazırlanıncaya kadar kendi vasküler pedikül perfüzyon greft tutun.
11. Alıcı diseksiyon tamamlandıktan sonra, mümkün olduğu kadar proksimal verici femoral damarları ligatend transplantasyon öncesinde histidin-triptofan-ketoglutarat (HTK, Custodiol, Newtown PA) ile greft demlenmeye.
    NOT: donör ekstremite alıcının sol tarafı için alıcı ve verici sağ bacak) sağ tarafı için sol bacak donör yani alıcının karşı tarafta naklediliyor.
12. Şimdi 100 mg / kg IV sodyum pentobarbital kullanılarak ikinci arka uzuv hasat sonrasında donör domuz Euthanize. Ölüm kurulan protokol başına veteriner personeli tarafından teyit edilir.

4. Alıcı Prosedürü (Hind Ekstremite doku yaması)

1. Donör uzuv hasat edilirken alıcı damar hazırlanmasını sağlamak için hemen ilk verici insizyon sonra alıcı uyarılmasını ve entübasyon başlatın. Bu gereksiz bekleme süresini ortadan kaldırır ve donör ve alıcılar için toplam anestezi süresini azaltır.
2. Allo işletim tarafında 30 ° rotasyon ile hayvan sırtüstü pozisyondadorsolateral tarafında w maruz kalma.
3. Bir kasık kesi yapmak ve femoral damarların ortaya çıkarılması; suprageniculate şube seviyesine ve proksimalde inguinal ligament seviyesinde distaline onları tecrit.
4. Greft içerlek için dorsolateral karın duvarı (Şekil 4) kasık bir deri altı cebe oluşturun.
5. Donör damarları bağlanır ve HTK ile greft yıkayın.
6. Ters bir şekilde greft iç metnini gerçekleştirin: cilt kürek kolay bağışıklık ayakta pozisyonda izleme ve (damarlarda herhangi bir gerginlik olmadan uçtan uca vasküler anastomoz izin caudally bakan femoral damarların kesilmiş uçlara izin dorsolateral bakan mı Şekil 5).
7. Varsa, (boyutu 2.5-3.5 10-20 kg hayvanlar için uygun) venöz anastomoz için bir damar bağlama cihazı (Synovis, St Paul, MN) kullanın. Geleneksel yöntemler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde bu iskemi süresini azaltır.
8. Arteriyel ANAST gerçekleştirin9-0 sütür (Synovis, St Paul, MN) ile geleneksel bir dikiş tekniği kullanılarak omoses
9. Damar açıklığı onaylandıktan sonra, 3-0 PDS sütür (Şekil 5) ile yerde greft sabitleyin. Greft kasları karın duvarı kaslarının dikilir. Bu zararlı olabilir çünkü zaman kafesin etrafında hayvan hareket. Greft kaslar alıcı uyluk kasları dikildi edilmemelidir
10. Bağışıklık takibi için dorsolateral tarafına (Şekil 6) üzerinde deri kürek Exteriorize ve 3-0 Vicryl deri altı ve 4-0 monofilament dikiş emilebilir sütürler kesintiye uğramış deri ile bitişik deri için dikiş.
11. 3-0 Vicryl deri altı sütür ve 4-0 monofilament emilebilir kesintiye cilt suturlerle katmanları kasık cilt kapatın.
12. Post-operatif analjezi için bir 50-100 mcg / saat fentanil yama yerleştirin.
13. Arka bacak organ transplantasyonu sonra, onun kalem kez uyanık ve kendi rahatça nefes için hayvan dönün.

Sonuçlar

Yirmi dört SLA tanımlanmış domuz heterotopik arka uzuv transplantasyonu 78 dakika boyunca (: 62-94 dakika Kademe) bir ortalama iskemi süresi ile modifiye edilmiş tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Greft İçerlek ve dorsolateral cilt kürek pozisyonu tüm hayvanlarda zorlanmadan elde edildi. Yakın kızılötesi lazer anjiyografi tüm alıcılara mükemmel greft perfüzyon gösterdi. Son on iki venöz anastomoz vasküler bir birleştirme cihazı kullanılarak yapıldı ise ilk oniki venöz anastomoz konvansiyonel dikiş teknikleri kul...

Tartışma

Tarihsel, heterotopik arka bacak nakli protokol ventral karın duvarına bir cilt raket dışsallaştırdığını dahil ve damarları uç-yan bir şekilde (Hettiarachty 2004) anastomoz edildi. Ancak, modifiye edilmiş bir yöntemde, bir ters kanat insetting ve uç-uca anastomoz daha fazla yanal olarak cilt kürek getirmek ve dolayısıyla hayvanın bir ayakta durma konumunda bağışıklık izlenmesini kolaylaştırır. Daha yakın kızılötesi lazer anjiyografi ile sural arter belirlenmesi ve en yüksek perfüzyon bölgeleri cilt kürek güvenilirliğini...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
REAGENTS
HTK	Custodial	N/A
EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Pistonlu testere
Vasküler Bağlantı cihazı	Synovis, Newtown PA	21003B