Method Article

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin içinde protein-protein etkileşimleri incelemek için yöntemler arasında, Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) oldukça basit ve hassastır. BiFC bir floresan protein olmayan iki floresan parçalarının (venüs, bir sarı floresan protein varyantı, burada kullanılan) kullanılarak floresan üretimi esas alınmaktadır. Floresan olmayan Venüs parçaları (VN ve VC) bağlı VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 etkileşim ve fonksiyonel bir floresan protein oluşumu için floresan verecek şekilde iki etkileşen proteinleri (bu durumda, AKAP-Lbc ve PDE4D3) kaynaşmıştır hücrelerin içinde.

BiFC protein komplekslerinin hücre altı konumlanması ve floresan yoğunluğuna dayalı protein etkileşimleri gücü hakkında bilgi sağlar. Bununla birlikte, protein-protein etkileşimi kuvvetini ölçmek için mikroskopi kullanılarak BiFC analizi zaman alıcı ve protein ekspresyonu ve etkileşim içinde heterojenite nedeniyle biraz görecelidir. Sitometrik akış kaplinBiFC metodolojisi ile analizi, floresan BiFC protein-protein etkileşimi sinyalini doğru olarak kısa bir süre içinde hücrelerin büyük bir miktar için ölçülebilir. Burada, AKAP-Lbc ile etkileşim için gerekli olan PDE4D3 bölgeleri eşleştirmek için bu metodolojinin bir uygulama göstermektedir. Bu yüksek kapasiteli yöntem, protein-protein etkileşimleri düzenleyen tarama faktörlere uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

650.000 protein-protein etkileşimleri, normal hücre fonksiyonlarını 1,2 korunmasında kritik rol oynayan, insan interactome var olduğu tahmin edilmektedir. Ortak immunoprecipitation yanı sıra (eş-IP), altın standart (PCA) hücreleri 3 içinde protein-protein etkileşimleri tespit duyarlılığını artırmak için geliştirilmiştir, hücre lizat birkaç protein parçası tamamlama deneyleri protein-protein etkileşimleri incelemek için. Teknikleri Förster rezonans enerji transferi (FRET), Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (BRET) ve Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) 4,5 içerir. Her potansiyel bir etkileşim protein ortağı (bu örnekte biz AKAP-Lbc ve PDE4D3 kullanın) sigortalarla, BiFC bir floresan protein iki parça (bir YFP varyant burada Venüs kullanın) kolaylaştırdı dernek dayanmaktadır. F tarafından görüntülenmiştir olabilir fonksiyonel floresan hücreleri sonuçları içinde ilgi iki protein, etkileşimiCanlı veya sabit hücreleri 6,7,8 kullanarak luorescence mikroskobu. Diğer PCA ile karşılaştırıldığında, BiFC canlı hücrelerde hücresel yerleşimi çalışma potansiyeli olan, duyarlı ve daha az teknik zordur. Bu tekniğin büyük bir dezavantajı, ancak bir kere oluştuktan sonra, floresan protein kompleksi geri alınamaz olmasıdır. Bu nedenle dinamik protein-protein etkileşimleri incelemek için iyi bir yöntem değildir. Bu yazıda, Venüs floresan yoğunlukları izleyerek AKAP-Lbc ile PDE4D3 etkileşimi siteleri eşleştirmek için BiFC kullanın. (Otomatik yüksek kapasiteli makineler kullanılarak gerçekleştirilmiştir değilse) zaman alıcı ve emek-yoğun floresan mikroskobu kullanarak geleneksel analizi ile karşılaştırıldığında, akım sitometri, kısa bir süre 9 üzerinde heterojen nüfus hücrelerin binlerce basit bir kantitatif analiz sağlar 10. Burada, akış sitometrik-BiFC analizi ve ortak IP geleneksel bir yan-yana karşılaştırma yaparak, biz göstermek bu iki methods karşılaştırılabilir veri sağlamak, ancak, akış sitometrik BiFC analizi zaman alıcı az ve ilgi hücreleri sınırlı zaman daha yararlı olabilir daha az malzeme kullanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre transfeksiyonu

  1. Transfeksiyon önce plaka hücreleri gün, immünofloresan için daha az hücre kaplama.
    1. Immunofloresan için: 6-plaka, kat cam kapak fişleri içinde (1 de başına) en az 4 saat süreyle 37 ° C de% 0.02 jelatin ile, orta ile bir kez yıkayın ve her bir kuyu için, plaka 1 x 10 5 HEK 293T 2 ml tam Hücreler büyüme ortamı içinde [Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) artı% 10 FBS].
    2. Akış sitometrik ve Western blot analizi için: levha 1,2 5 HEK 293T hücre / oyuk 6-plaka (24-çukurlu plaka başına 0,5 ml tam büyüme ortamı içinde 0.3 x 10 5 HEK 293T hücreleri içinde 2 ml tam büyüme ortamı x 10 .)
  2. Imalatçının protokolüne göre transfeksiyon için DNA hazırlayın: Effectene (Qiagen) immünofloresan için kullanılır. Transit-LT1 (Mirus) akım sitometrik ve Western Blot analizleri için kullanılır. Kullanılan DNA miktarı aşağıda listelenmiştir.
    24 oyuklu plaka (ng) 6-plaka (ng)
    CFP-vektör 10 50
    VN N-AKAP-Lbc 200 1.000
    VC N-PDE4D3-FL (tam boy PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC N-PDE4D3-UCR1 (UCR1 etki alanı içeren bir PDE4D3 N-terminal parçası) 100
    VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (UCR2 ve katalitik etki içeren bir PDE4D3 C-terminal parçası) 100
    Transfeksiyon Effectene (6-de) kullanılarak:
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca belirtilen plazmid DNA + miktarı 4 ul artırıcı 100 ul tampon EM için, karışım, ve inkübe ekleyin.
    2. 10 dakika boyunca 5 ul Effectene, karışım, ve inkübe eklemeoda sıcaklığı. Ekle hücrelere bırak-bilge.
    : Transit-LT1 (6-well/24-well) kullanarak transfeksiyon
    1. Bir steril tüp içine Opti-MEM I serumsuz ortamda 250 μl/50 ul plasmid DNA Belirtilen miktarlarda ekleyin.
    2. Seyreltilmiş DNA karışıma Transit-LT1 reaktif ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetle. (Transit-LT1 Reaktif: DNA oranı DNA 1 mikrogram başına Transit-LT1 reaktif 3 ul).
    3. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir ve hücreleri damla damla ilave edin.

2. Sitometrisi, Western Blot, ve İmmünofloresan için Hücre Hazırlık

  1. 24 saat sonrası transfeksiyon, hücreler hasat öncesi Epifloresans mikroskop altında floresan kontrol edin.
  2. Akım sitometri analizi için hücre hazırlama:
    1. 24-well/6-well plakaları ile, 0.5 ml / 2 ml buz gibi soğuk PBS ile bir hücreleri yıkayın.
    2. 50 μl/250 ul% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak.
    3. 200 ul / 1 ml DMEM ortamı ile nötralize tripsin.
    4. Co5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile llect 250 ul hücreleri (her ikisi de 24 oyuklu ve 6-delikli plaka için), Western blot analizi için geriye kalan hücreler (1 mi) kullanın.
    5. 250 ul FACS buffer içinde yeniden süspanse hücreleri [PBS +% 0.5 (w / v) BSA, 2 mM EDTA +] akış sitometri analizi için buz üzerinde depolar. Akım sitometri analizi hemen olmayacak eğer hücreler (PBS içinde)% 1 paraformaldehid sabitlenebilir.
  3. Western Blot analizi için hücre hazırlama: akım sitometri analizi için hücre hazırlama paralel olarak gerçekleştirdi.
    1. 2 ml buz gibi soğuk PBS ile yıkayın 1x hücreleri, hücre parçalama tamponu 100 ul [10 mM sodyum fosfat tamponu, pH 6.95, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA,% 1 Triton X-100] eklenerek hücre parçalandığı .
    2. 4 de 21.000 xg'de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücre lizatı toplamak ° C
    3. , Bradford protein testi ile protein konsantrasyonu ölçmek SDS-PAGE için şerit başına protein eşit miktarda yük ve immün için nitroselüloz transfer.
  4. Immünofloresan için hücre hazırlama.
    1. 2 ml PBS ile durulayın 3x hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehid (PBS) 1 ml hücre düzeltmek için, daha sonra 5 dakika boyunca 2 ml PBS ile 3 kez yıka.
    2. Montaj orta kullanarak, bir cam slayt üzerinde kayma kapağı monte edin. Gerekirse oje kullanarak lamel kenarları mühür.
    3. Muayene ° C önce 4 de slaytlar saklayın.

3. Akım Sitometri ve İmmünofloresan Mikroskopi

  1. Flow sitometri bir Beckman Coulter Mavi 488 nm ile donatılmış ADP, 405 nm ve 642 nm katı hal lazerleri kullanılarak yapılır. Zirve yazılım satın alma ve analiz için kullanılır.
    1. Standart boncuklar kullanarak akış sitometresinin kalibre.
    2. Yolluk canlı hücre popülasyonu için doğrusal bir ölçekte Arsa İleri dağılım (FSC) / yana dağılım (SSC).
    3. Yolluk olmayan toplu canlı hücre popülasyonu için arsa gerilim / FSC darbe genişliği.
    4. Arsa count/FL6 (OBP fluorescencyolluk olmayan toplu canlı CFP-pozitif hücreler için bir günlük ölçekte e, 405 nm).
    5. BiFC yoğunluğu için bir günlük ölçekte Arsa count/FL1 (YFP floresan, 488 nm).
    6. FSC, SSC, FL1 ve FL6 fotoğraf çoğaltıcı tüp (PMT) Her bir sinyal için eşik ayarlamak için voltaj ayarlamak, YFP-CFP-çift negatif örnekleri çalıştırın.
    7. Run (hem YFP + ve CFP +) için örnekler gelecek off-line tazminat pozitif ve tek
    8. Analiz için en azından 10,000 kapılı olayları (olmayan toplanan canlı CFP + hücreleri) elde edin.
  2. . İmmünofloresan mikroskobu bir Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop Not kullanılarak yapılır: tüm ayarlar arasında tutarlı (örneğin, zum, iğne deliği, dedektör kazanç, amplifikatör ofset, çerçeve boyutu, tarama hızı, tarama ortalama ve lazer güç olarak) tutmak önemlidir tüm verilerin uygun bir karşılaştırma için örnekler.

4. Veri Analizi (Summit Yazılımı kullanarak Yapılan)

  1. Acquisit için olana benzer bir analiz protokolü ayarlamauygun yolluk ile iyon:
    Canlı hücreler için FSC / SSC nokta arsa Gate 1.
    Olmayan toplu canlı hücreler için Gate 1 FSC / darbe genişliği Kapısı 2.
    Olmayan toplu OBP + canlı hücreler için Gate 3 sayısı / CFP Gate 3.
  2. YFP ve YFP + ve OBP + tek pozitif hücreleri kullanarak OBP sinyal telafi.
  3. CFP / YFP pozitif hücreler için yeniden belirlemek kesme hatları.
  4. İhracat YFP CFP floresan yoğunluğu (MFI) + veri komplo için Excel'e hücreler anlamına gelir.
  5. AKAP-Lbc, PDE4D3 ifade seviyelerine YFP MFI Normale ve Western blot tarafından belirlenen, α-tubulin yükleme kontrolü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AKAP-Lbc ve PDE4D3 yapıları (Şekil 1B) sırasıyla, VN ve VC parçaları erimiş edildi. AKAP-Lbc ve fonksiyonel YFP floresan (Şekil 1A) içinde PDE4D3 sonuç etkileşimi. Burada PDE4D3 içinde haritası AKAP-Lbc bağlayıcı sitelere BiFC yöntemini kullanın. Memba korunmuş bölge 1 (UCR1), yukarı korunmuş bölge 2 (UCR2) ve katalitik bölgesi (CAT) PDE4D3 bağlama sitesi tarama için kullanılan bu nedenle, tam boy (FL), UCR1 ve UCR2 artı CAT, PDE4 aile proteinler arasında korunur AKAP-Lbc için. Farklı y...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC protein-protein etkileşimleri incelemek için basit ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, yeni bir protein-protein etkileşimleri tanımlamak için kullanılamaz, ancak, bu hücre içinde, protein-protein etkileşimi teyit etmek için ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için özellikle uygundur, örneğin protein-protein etkileşimi siteleri eşleme protein kompleksleri hücre altı konumlanması olarak, ve protein-protein etkileşimi modüle eden küçük moleküller / peptitlerin taranması için. VN ve VC parçaları floresan olmayan old...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz eleştirel deneysel değerlendirme ve tartışma için UIC de O'Bryan laboratuvar teşekkür ederim. Klinik ve Translasyonel Bilimler Hibe UL1TR000050 için UIC Merkezi - Bu çalışma Translational Bilim ilerlemek için GKC ve Ulusal Merkezi Amerikan Kalp Derneği Hibe 11SDG5230003 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Dulbecco’ s modifiye Eagle’ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomisin (pen/strep), 100xInvitrogen15070-063
Fetal Sığır Serumu (FBS)İnvitrogen16000-044
Anti-Flag antikoruSigmaM2, F1804
Anti-HA antikoruCovance16B12, MMS-101R
α-tubulinSigmaDM1A, T9026
Anti-GFP antikoruClontech632569
Hücre kültürü plakaları, 6 oyuklu doku kültürü ile tedavi edilmişThermo Fisher Scientific130184
HEK 293T hücreleriATCCCRL-11268
Maxiprep plazmit saflaştırma kiti, yüksek hızlıQiagen12663
Dulbecco’ s Fosfat tamponlu salin (DPBS), steril 1xInvitrogen14190-144
Tripsin-EDTA,% 0.05 (a / h)Gibco25300
FACS boyama için polistiren yuvarlak tabanlı tüplerBD Biosciences352052
ParaformaldehitFisher ScientificS74337MF
InvitrogenP-36931ile altın antifade reaktifini uzatın
Superfrost plus Mikroskop slaytlarıFisher Scientific12-550-15
Fisherfinest premium kapak camıFisher Scientific12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 hava ceketli İnkübatörNuAIR DH otomatik akışlı
Konfokal mikroskop LSM510 METACarl Zeiss, Inc
Elektroforez ve transfer ünitesiBiorad
Cyan ADP Akış SitometresiBeckman Coulter
DAPI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

Related Articles