Yöntem makalesi

Tümör Hedefli ölçülmesi Büyüme ve Gen İfade Dynamics S. Typhimurium Bakteri

DOI:

10.3791/50540

⸱

6 Temmuz 2013

 ,  ,  , 
1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneylerin amacı, zayıflatılmış büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri üzerinde niceliksel zamana bağlı verilerini oluşturmak için bir S. typhimurium bakteri kolonileri. Bu video tümör hücre hazırlama ve implantasyonu, bakteri hazırlanması ve enjeksiyon, tam hayvan lüminesans görüntüleme, tümör eksizyonu ve bakteri kolonisi sayma kapsar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneylerin amacı, hafifletilmiş S. büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri üzerinde niceliksel zamana bağlı verilerini oluşturmak için bir tümörleri içinde büyüyen typhimurium bakteri kolonileri.

Bir insan yumurtalık kanseri hücre hattı deri altına enjeksiyon, OVCAR-8 (NCI DCTD Tümör Deposu'ndan, Frederick, MD). Farelerde modeli ksenograft tümörler oluşturulan

Biz, S. zayıflatılmış suş transforme görselleştirme 2 plazmid yapıcı şekilde tanımlanmış lusiferaz (luxCDABE) ile: typhimurium bakteriler (SL1344 phoPQ-1 ELH430). Fare 1, esas olarak non-virulent kalarak Bu suşlar, özellikle tümörler kolonize olur.

Ölçülebilir tümörler tesis edildiğinde, bakteri dozaj değişen kuyruk damarı yoluyla venöz içinden enjekte edildi. Tümör-lokalize, bakteri gen ekspresyonundaki kullanarak 60 saatlik bir süre boyunca gerçek zamanlı olarak izlenmiştirin vivo görüntüleme sistemi (IVIS) içinde. Her zaman noktasında, tümörler homojenize eksize ve gen ekspresyon verileri ile korelasyon için bakteri kolonileri ölçmek için kaplandı.

Birlikte, bu veriler tümörler içinde büyüyen bakterilerin in vivo büyüme ve gen dinamikleri içinde bir nicel ölçü verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sentetik biyoloji son on yılda hızla ilerlemiştir ve şimdi enerji ve sağlık önemli sorunları etkisi konumlandırılmış. Ancak, klinik alana genişleme güvenlik endişeleri ve in vivo genetik devrelerinde için tasarım kriterleri geliştirme bir yokluğu ile yavaşladı edilmiştir. Yüksek darbe tıbbi uygulamaları hızlandırılması tıbbi altyapı, kontrollü laboratuar ortamı dışında işlev genetik devreleri, ve güvenli ve klinik-kabul mikrobiyal bilgisayarlar ile doğrudan arabirim yöntemleri kullanarak gerektirecektir.

Suş tümörlerde tercihen büyümeye yeteneklerine bağlı olarak kanser tedavisi için incelenmiştir. Bu C eklemiş novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, ve S. typhimurium 3-8. S. onlar 9-12 insan klinik çalışmalarda bir dizi güvenlik ve hoşgörü sergilenen gibi typhimurium özel bir ilgi yarattı. Bu bakteri Bir ilk konak bağışıklık sisteminin uyarılması yoluyla ve kanser hücre metabolizması için gerekli besinlerin tükenmesi ile bir anti-tümör etkileri oluşturmak için gösterilmiştir. Tedavi kargo üretimi daha sonra genetik değişiklikler ile eklendi. Bu çalışmalar tümör tedavileri için bakteri kullanımı önemli ilerlemeler temsil ederken, mevcut çabalar çoğunluğu genellikle çok yüksek dozlarda, hedef dışı etkiler ve ana 13-16 direnç gelişimi teslimat ile sonuçlanan yüksek düzeyde ekspresyon yararlanmıştır .

Şimdi, sentetik biyoloji gelişmiş algılama ve dağıtım 17-20 gerçekleştirebilirsiniz hesaplama tasarlanmış genetik devreleri kullanarak programlanabilir yük üretim ekleyebilirsiniz. Bu devreler, tümör spesifik uyaran ve gerektiğinde kendi kendini düzenleyen kargo üretim anlamda dağıtım sistemleri olarak hareket için dizayn edilebilir. Ancak, in vivo olarak, bu devrelerin fonksiyonu çalışmalarında şimdiye kadar zor olmuştur.

plazmid sentetik devreleri için ortak bir çerçeve olan ve_content "> bu yana, bir fare modeli kullanılarak in vivo plazmid tabanlı gen ifadesinin dinamiklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemler zaman atlamalı lüminesans görüntüleme ve biodistribution kantitatif ölçümü kullanmaktadır. birlikte, Bu yaklaşımların klinik uygulamalar için in vivo plazmid tabanlı ağlar eğitim için bir çerçeve sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Hazırlanması

  1. Standart hücre kültürü teknikleri kullanılarak geçişi hücre çizgileri dahildir. Bu deneyde, OVCAR-8 hücreleri (NCI DCTD Tümör Deposu, Frederick, MD) kullanılır. 100% - 80 confluency bir hedef hücreleri büyütün.
  2. 5 dakika boyunca 5 ml tripsin ile inkübe hücreleri, ardından + FBS tripsin inaktive 5 ml RPMI ortamı ilave edin.
  3. Hemasitometre üzerinde hasat ve sayısı hücreleri. 5 x 10 7 hücre / ml ya da şişesi başına yaklaşık 200 ul bir hedef konsantrasyonunda kırmızı fenol içermeyen DMEM içinde süspanse edin.
  4. 15% daha az büyüme faktörü Matrigel (BD Biosciences) ekleyin ve implantasyon kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.

2. Tümör İmplantasyonu

  1. Izofluran% 3 ile 4 haftalık dişi NCR / Nu fareler anestezi ve derin anestezi sağlamak için yaklaşık 5 dakika bekleyin. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
  2. 1 ml şırınga içinde hücreleri (hem tümör başına 100 ul) yerleştirin ve 27 1 takmak/ 2 iğne.
  3. İki lider, karşılıklı arka yan enjeksiyon sitelerin her biri için, bir çadır yapmak ve tabanda hücreleri enjekte forseps ile cildi nazikçe kaldırın. Kan üreten, çok derin nüfuz dikkat edin. Hafifçe sıçrama olmadan şırınga kaldırmak için cımbız kullanın.
  4. 2 arasında bir tümör çapı kadar 20 gün - 4 - mm ulaşıldığında 10 günlük tümör büyümesini izlemek.

3. Bakteri Hazırlık

  1. Bir -80 C derin dondurucu hisse senedi veya soğutulmuş plaka 3 ml LB medya + ampisilin bakteri bir gecede kültürü başlatın. Bu deneyde, S. kullanılan typhimurium suşu ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
  2. Sabah, filtre LB içine kültür 1:100 sulandırmak ve OD600 0,4 büyümeye - 0.6.
  3. Aşağı Spin ve fosfat 3 kez yıkayın tuzlu su (PBS) tamponlu ve 0.1 bir son OD600 (1 x 10 7 hücre / ml) de tekrar süspansiyon.

4. Bakteri enjeksiyonu

  1. Bir hayvan anestezisikuyruk da dominant el doğru bakacak şekilde yan d konumu. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
  2. Ilık su veya ısı lambası kullanarak kuyruk ven dilate.
  3. 1 ml şırınga içinde bakteri (fare başına 100 ul) yükleyin ve 90 dereceden sadece daha az ucu bükün.
  4. Kuyruk ven ile şırınga ucu aynı hizaya getirin, sığ bir derinliğe (direnç hissetmelisiniz) de nüfuz ve bakteri enjekte. Başarılı bir enjeksiyon için kan akımını değiştirme dikkat edin.

5. Fare Görüntüleme

  1. Indüksiyon odasında hayvanların anestezisi sonra görüntüleme platformu üzerinde, her bir fare yerleştirin. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. Zaman noktaları arasında kantitatif sonuçları elde etmek için hassas konumlandırma koruyun.
  2. IVIS Spectrum görüntüleme sistemi (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanarak görüntü hayvanlar. Aralarında görüntüleme 1'den fazla hayvan, yer ışık bariyerleri çapraz illu önlemek için iseğerlendirmesi. Hayvanlar bakteri lokalizasyonu onaylamak için ventral tarafta ilk görüntülü olmalıdır.
  3. Görüntü hayvan dorsal deney (36 saat) süresince IVIS her 2 saat kullanarak. Belirli bir yatırım getirisi için bir süre ders oluşturun.

6. Bakteriyel biolojik dağılım miktarının

  1. Emici bebek bezi üzerinde arkasında CO 2 ve yer kullanarak hayvanlar euthanize.
  2. Iki arka yan subkutan tümörler ortaya çıkarmak için hayvan çevirin. Tümörler ayırmak ve kaldırmak için, etrafını saran dokulardan kesin. Cımbız ile tümör Holding, bir ters makas hareketi kullanarak cilt kaldırmak. Cilt çoğunluğu ayrılmış zaman, tam cımbız kullanarak tümör çıkarmak.
  3. Önceden tartılmış mikrosantrifüj tüpleri içinde organları. Bu tüplerin kitle önemli ölçüde değişebilir çünkü nicel sonuçlar için bunları önceden tartmak önemlidir.

7. Bakteriyel biolojik dağılım miktarının

  1. Her zaman noktası, tüketim ve tümörler tartın.
  2. 500 ul PBS +% 15 gliserol ekleyin ve bir Doku-Tearor (BioSpec) kullanarak homojenize. Örnekleri arasında etanol ile homojenleştirici 3 kez yıkayın.
  3. Seri seyreltme ve bakteri kolonisi sayımı için plaka oluşturun. Tek bir tabak kullanımı ön kesitli plakalar üzerinde plaka birden fazla seyreltme için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol kullanarak, tümör hedef bakteri in vivo büyüme ve gen dinamikleri veri elde edebiliyoruz. Genel akışı Şekil 1 'de özetlenmiştir.

İlk aşamada, biz lüminesans (mavi) bir muhabir olarak ile gen ekspresyon ölçmek için IVIS kullanarak hayvan bakteri enjekte (yeşil) ve görüntü.

Daha sonra, ikinci aşamada, biz tüketim, homojenize ve koloni sayımı için plaka tümörler tümör büyüyen bakteri sayısını belirlemek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür kullanılarak, böylece tümörü kolonize bakteri büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri için zaman içerisinde elde edebiliyoruz. Bu ölçümler rutin parti kültür ya da mikroflüidik cihazlar, in vitro olarak gerçekleştirilir olsa da, in vivo olarak gerçekleştirmek için çok daha zordur.

Bu yöntemler uygulanabilir çeşitli değişiklikler vardır. Bizim fare modelleri oluşturmak için OVCAR-8 hücre kullanılır iken, diğer hücre hatları, bir dizi eşit şekilde kullanılabilir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yazının eleştirel okuma ve düzenleme için H. Fleming teşekkür ederim. Bu çalışma Misrock Doktora Sonrası Bursu (TD) ve NDSEG yüksek lisans bursu (AP) tarafından desteklenmiştir. SNB bir HHMI Araştırmacı olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 ml şırıngaBD Biosciences309602
3/10 cc İnsülin ŞırıngasıBD Biosciences309301
PrecisionGlide İğnesi BD Biosciences301629
RPMI Ortamı 1640 (1X), sıvı, L-glutaminInvitrogen11875-119
AmpisilinSigma AldrichA0166-5G
LB Agar Etsuyu Sigma AldrichL2897
Luria-Bertani et suyuBD Biyobilimler244610

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511(2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T m r Hedefli BakterilerIn Vivo G r nt lemeBiyol minesans G r nt lemeKoloni Say mKsenogreft T m r ModeliIVIS G r nt leme SistemiBakteriyel Gen EkspresyonuT m r Kolonizasyonu

İlgili makaleler