Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Gelişimsel nörobiyoloji seçkin sorulardan biri sinaptik olgunlaşması sırasında sinaptik plastisite olayların rolü ile ilgilidir. Bizim araştırma sinaptik gelişme bağlamında hayvan davranışlarını anlamanın bir genel hedefi ile sinaptik gelişmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak plastisite üzerinde duruluyor. Bunu yapmak için, biz 1990'ların sonlarında gelişimsel çalışmalar için önemli bir çekiş kazanmış bir organizmanın (Zebra balığı, Br.rerio) bir ölçüde sağlam hazırlık geliştirdi.

Zebra balığı nörogelişimsel çalışmalar için birçok avantaj sunar. Örneğin, genom dizilimi ve bir gen aktivite ve protein ifadesi susturulur morfolino knockdowns ve çinko-parmak tırnakları nükleaz gerçekleştirebilir. Bir de aşırı ekspresyonu çalışmalarını gerçekleştirmek ve transjenik ^7-9 yapılabilir. Embriyolar elde etmek nispeten kolay ve bol veembriyonun şeffaf doğası iyi görüntüleme ve opto-genetik çalışmaların kendisini ödünç. Ayrıca, davranış analizi yapılabilir, ve elektrofizyolojik deneyler, in vivo olarak bir hücre fonksiyonunu incelemek sağlayan, büyük ölçüde sağlam organizmalarda kas lifleri, omurilik nöronları ve arka beyin nöronları üzerinde yapılabilir. Daha da önemlisi, hazırlama hazırlanması için, hücrenin sadece aynı sınıfta sinaptik aktivitenin tetkiki, ancak nöronların aynı çift edebiliyoruz. Diğer bir deyişle, bu gelişimini incelemek için, yerinde, aynı nöron geri hangi nadir omurgalı hazırlıkları biridir.

Mümkün olduğu kadar canlı nöronal devre korumak için, biz, arka beyin ve omurilik değişmeden kalır edildiği bir preparasyon geliştirilen M-hücrelerinden yama sıkıştırma sırasında. Bu hazırlıkta, beyni kaplayan gözler, çene ve deri hafifçe kaldırılır ve arka beyin Peele olduğunu vardıruzaklıkta Notokordun D, ​​arka beyin ventral yüzeyine erişim sağlar. Reticulospinal nöronlar birkaç mikrometre derin bulunan ve nispeten kolay erişilebilir. 48 saat sonra döllenme (hpf; bazı kısaltmalar Tablo 1'de listelenen) de hücreleri elektrik kompakt ve bir sadakatle, (eksitatör ve inhibitör akımları hem de) onlardan voltaj-kapılı akımları ve aksiyon potansiyelleri, sinaptik aktivite kaydedebilirsiniz.

Bulgularımız sinaptik gelişme ve olgunlaşma birçok yönleri önce kuluçka için 24 saat içinde meydana düşündürmektedir ve dikkatimizi bu nedenle kadar 72 hpf 24 hpf yaş arasında değişen organizmalar odaklanmıştır. Bununla birlikte, 72 ile HPF, M-hücreleri daha az elektrik kompakt ve uygun şekilde yer kelepçe zordur. Bu teknik, M-hücreleri, aynı zamanda onun homologları, Ort2 cm ve MiD3 cm sadece kaydetmek için kullanılabilir. Teorik olarak, bir de sp, çift kayıtları yapabilirinal kord böyle bir primer motor nöron olarak ve M-hücreden nöron, ama bu zor ve böyle bir zor tekniği elde faydaları gerekli olağanüstü çabaya değer olmayabilir savundu olabilir.

1.. Hazırlık ve Diseksiyon

1. Sylgard ile kaplı diseksiyon çanak hazırlayın. TEFE (Sarasota, Florida, ABD; Tedarikçiler Tablo 2'de listelenmiştir) itibaren kayıt odaları (Şekil 1) yemekleri diseksiyon olarak kullanılır. Odaları cam slaytlar barındıracak şekilde tasarlanmıştır ve küçük plastik pullar Sylgard için kalıp olarak kullanılır. Birinci çamaşır yağ ve sıvı Sylgard yıkama merkezine eklenir ile slayt sabitlenir. Sylgard gecede tedavi edecek ve bunu yaptığı gibi, bu diseksiyon çanak taban olur cam slayt, küçük, yuvarlak bir yatak oluşturur. Kayıcı kayıt odasına yerleştirilir ve preparat yapıştırılmış olduğu için bölmenin (Şekil 1) temel olarak hizmet vermektedir.
2. Tablo 3'te listelenen çözümler hazırlayın. Hücre içi çözeltiler steril tutulması gereken süre Hücre dışı çözelti oda sıcaklığında bırakılmalıdır. Bir de Lu ekleyebilirsinizM-hücre morfolojisi bu görselleştirme Deneyin sonunda gerçekleştirilebilir, böylece, hücre içi çözeltisine Cifer sarı (% 0.1). Bu hücre kimliğini (Şekil 2) onaylamak için hizmet vermektedir.
3. 28.5 ° C'de yumurta su yabani tip Zebra balığı embriyolar yükseltmek ve Kimmel ve ark. ^10'a göre toplamak ve sahne. Disseksiyonlarıyla için ayrıca kayıt odası olarak hizmet vermektedir diseksiyon çanak embriyolar transfer. Yakın fizyolojik tuzlu yaklaşmaktadır; bir anestezi tuz çözeltisi (çözelti 1, Tablo 3% 0.02 tricaine) içinde 7-10 dakika boyunca anestezisi. Yeterince hafif bir kuyruk tutam yanıt inceleyerek anestezi ise bir belirleyebilirsiniz.
4. Notokordun boyunca ve 0.001 "bir mikroskop (Şekil 1) 25X büyütme kullanarak tungsten tel (Bilimsel Instrument Services. A.Ş., Ringoes, NJ, ABD). Tungsten tel rahatlıkla kesim ile Sylgard kaplı çanak üzerine embriyolar Pin içindeince diseksiyon makas ile küçük segmentlere.
5. Diseksiyon 40-50X diseksiyon kapsamı üzerinde büyütmeyi ayarlayın. Embriyo çanak, çene, göz ve ön beyin tutturulmuş sonra forseps iyi bir çift (Dumont # 5) kullanılarak kaldırılır.
6. Beyin hafifçe dikkatle notokord ve beyin arasındaki forseps çalışarak uzakta yatan Notokordun soyulur. Ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde arka beyin yavaşça ters çevrilir. Bu konumlandırma yaşlı larva 20-50 mikron (Şekil 2A) genç embriyoların ventral yüzeyinin 5-10 mikron içinde genellikle ve ~ M-hücreleri, iyi erişim sağlar.
7. Dikkatlice yama kelepçe deney yapılabilir kayıt kurulum için hazırlık hareket ettirin. M-hücreleri, Nomarski Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) ile görüntülendi rağmen görüntüleme diğer modları (yani Hoffman modülasyon kontrast veya Dodt Degrade Kontrast Görüntüleme itibarenLuigs ve Neumann, Almanya) de kullanılabilir.

2. Patch Kelepçe Kaydı (Tüm Hücre Modu)

1. Tüm kayıtlar Tam hücre yama kenetleme modunda ¹¹ yapılmaktadır. Kayıt odaları elektrofizyoloji kurulumunda bir mikroskop sahneye yerleştirilir. Bizim aşamaları sabit ve dik yama kelepçe mikroskop hareketli bir mikroskop platform ya da bir mikroskop çevirmen cıvatalı.
2. TEFE elde edilen ince duvarlı, borosilikat cam, yama kelepçe pipetlerinin yatay çektirmesi (Sutter Instruments Co P-97) üzerinde çekilir. Pipet ucu çapları pürüzsüz bir kenarına alev parlatma sonra 0,2-0,4 mikron mertebesindedir, ve sap konik uzunluğunda ~ 4 mm.
3. Elektrofizyoloji kurulumunda amplifikatör kafa aşamasına pipet takın. Bu conta, yüksek direnç oluşumu için uygun olan bir pipet için bir giriş açısı sağlar olarak yatay eksene yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile baş sahne tutmak için önemlidirMauthner hücre üzerine s.
4. Sadece banyo çözümü girmeden önce, ucu kirletme olasılığını azaltmak için pipet pozitif basınç küçük bir miktar uygulanır. MEPSCs kaydederken, banyo çözümleri glisin reseptörleri ve 10 mcM Bicuculline veya GABA _A reseptörleri bloke etmek için 100 mcM pikrotoksin engellemek için aksiyon potansiyelleri, 5 mcM striknin engellemek için 1 mcM TTX içerir. MIPSCs kaydederken, banyo çözümleri 1 mcM TTX, Kynurenic asit ve ilgi reseptör aktivitesine bağlı Bicuculline ya zehir ya içerir.
5. Pipet pozitif basınç küçük bir miktar ile M-hücre Yaklaşım. Pozitif basınç yavaşça bir taraftan diğer tarafa iter hücre ve hücre hemen üzerinde yer alan zaman, hücre zarı üzerinde küçük bir çukur meydana getirir. Pipet ile membran arasında güçlü bir sızdırmazlık meydana getirilebilir, böylece hafifçe hücre yüzeyi temizlemek için birkaç saniye yerinde pipet bırakın. Pipet pozitif basıncı serbest bırakmakConta başlatılabilir ve negatif pipet potansiyelleri ile birlikte bir negatif basınç küçük bir miktar birkaç saniye içinde oluşan GigaΩ mühürler ile sonuçlanır sağlar.
6. -60 MV amplifikatör tutma potansiyeli değiştirin. Emme kısa bir pals serisi ile hücre zarı yırtılabilir. Hemen membran potansiyelleri kayıt ve kapasitans eserler en aza indirmek. % 70-85, hücre kapasitansı (C _m) ve erişimi (serisi) direnç (R _a) dengeleyin. _Ra, rutin, bir dakika 30 saniye izlenir ve% 20 veya daha fazla bir değişiklik varsa, deney iptal edilmelidir.
7. Deney sona erdi ve yeterli veri elde edildikten sonra, preparat forseps bir çift arka beyin kaldırarak feda edilmektedir. Bu noktada, veri analizi başlayabilir.

Bu yazıda biz özellikle M-hücre odaklanarak, zebrabalıkları reticulospinal nöronlardan gelen bütün hücre modunda yama kelepçe kayıt için bir yöntem mevcut. Tabii ki, bu tür dışarı dışarıda hücre bağlı, iç-out ve diğer yama kelepçe modlarda kaydetmek de mümkün. Bir elde bir veri tipi burada sunduğumuz ne sınırlı, ama biz de sinaptik gerilim-kelepçe modunda aktivite (eksitatör ve inhibitör) yanı sıra güncel kelepçe aksiyon potansiyelleri bir örnek vermeye çalışacağız değildir. Organizma yaş ve M-hücreleri daha kapsamlı ve ayrıntılı dendrite geliştirmek gibi, yeterli hücre kelepçe kelepçe ve uzay voltaj yeteneği tehlikeye ve güncel kelepçe modu tercih kayıt haline gelir.

Şekil 3, (1 uM) ve farmakolojik maddeler için TTX mevcudiyetinde 48 HPF embriyolardan elde uyarıcı AMPA ve NMDA reseptörü akımları için temsili kayıtlarını gösterirGABA ve glisin reseptörleri bloke eder. M-hücreler -60 mV'de voltaj kenetlenmiş olduğunda, akımları sinaptik AMPA reseptörlerinin aktivasyonu (Şekil 3A) kaynaklanmaktadır. Toplama ve bu olayların analizi, böyle bir yükselme zamanı, çürüme zaman, genlik ve frekans gibi parametreleri kaydetmenize olanak verir. AMPA olaylar genelde bir hızlı yükselme zamanı (~ 0.1 msn% 20-80 yükselme zamanı) ve çürüme süresi (~ 0.5 msn), ve yaklaşık 25 PA ortalama genliği sergilerler. M-hücreleri 40 mV'de tespit edildiği zaman, elde edilen dışa doğru akımlar ve AMPA NMDA reseptör aktivitesi (Şekil 3C ve 3D) kaynaklanmaktadır. NMDA reseptör akımları AMPA alıcısı akımlarının daha uzun zaman süreçleri gösterirler ve 2,6 reseptörleri NMDA Mg blok çıkarmak için pozitif potansiyel ya da Mg içermeyen solüsyon içinde kayıtlı olması gerekir. Şekil 3D gösterilen ortalama mEPSC +40 mV kaydedildi karışık AMPA ve NMDA akımları temsil eder.

FiMauthner hücrelerden mIPSCs kaydederken Güre 4 temsilci sonuçlarını gösterir. Bu olaylar, AMPA ve NMDA reseptörlerini bloke etmek için TTX mevcudiyetinde (1 uM) ve Kynurenic asit (1 mM) oluştu. Bu olaylar 48 hpf göre oldukça hızlı artış ve eksilme kinetiği gösterirler ve 2-3 dk kayıt üzerinde 3 çoğu elde etmek için yeterince sık. Hücreye depolarize akımını enjekte sonucunda kaydedilen 5 gösterileri aksiyon potansiyelleri Şekil. Suprathreshold uyaranlara (Şekil 5A) ile birlikte enjekte edildiği zaman, bazen çok AP ateş, ancak 48 HPF embriyoların M-hücreleri, genellikle, tek bir eylem potansiyeli (Şekil 5B) yangın.

Tablo 1.

Tablo 2.

Tablo 3. Tüm hücre dışı çözeltiler 290 mOsm ve pH 7.8 'e ayarlanır. Tüm hücre içi çözeltiler 280 mOsm ile pH 7.4' e ayarlanır.

Şekil 1. Çanak ve sağlam arka beyin-omurilik hazırlık Diseksiyon. (A) TEFE elde edilen çanak Diseksiyon ve kayıt. Ince bir yıkama dikkatle t üzerine kapatılıro yemeğin altındaki cam slayt ve Slygard iyi uygulanır. (B) 48 hpf Beyin-omurilik hazırlık. Arka beyin ve ventral yüzeyi yukarı bakacak ve M-hücresi sadece bir ok ucu seviyesinde doku yüzeyinin altında yer almaktadır.

Şekil 2. Kısa bir süre sonra, kuluçka 2 dpf embriyo elde edilen M-hücrenin (A) Nomarski, farklılık belirleyici kontrast image. Görüntü M-hücreden spontan harekete geçiren sinaptik etkinliği kayıt sonra çekilmiştir. (B), hücre boyunca Lucifer sarı ile dolduruldu deney. Izni ile 12 uyarlanmıştır.

Şekil 3,. (A) Kendiliğinden AMPA mEPSCs bir M-hücresinden kaydedilen -60 mV bir tutma potansiyelinde. (B) (A) kayıt elde edilen ortalama mEPSCs. (C) Kendiliğinden AMPA ve NMDA (ok uçları) +40 mV bir tutma potansiyelinden bir M-hücresinden kaydedilen mEPSCs. (D) 'de elde edilen kayıt Ortalama mEPSCs (C). Glutamat mEPSCs glisin ve GABA akımları engellemek için TTX varlığında aksiyon potansiyelleri engellemek için (1 uM), striknin (5 uM) ve pikrotoksin (100 uM) kaydedildi.

Şekil 4. (A) -60 mV bir tutma potansiyelinden bir M-hücresinden kaydedilen spontan mIPSCs. (B) (A) kayıt elde edilen ortalama mEPSCs. mIPSCs GABA akımları engellemek için glutamat reseptör aktivitesi ve Bicuculline (10 uM) engellemeye aksiyon potansiyelleri, Kynurenic asit (1 mM) engellemek için TTX mevcudiyetinde (1 uM) kaydedildi.

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.