Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Özet

Bu çalışmada temel amaç, karbon nanotüplerin (CNT'ler) hücresel alımını ve nihai ekzositozunu izlemekti. Bu perspektiften bakıldığında, burada multispektral görüntüleme akış sitometrisini kullanan, istatistiksel olarak anlamlı sayıda hücrede CNT'lerin nicelleştirilmesine ve lokalizasyonuna izin veren benzersiz bir yöntem önerdik.

Özet

Karbon nanotüpler (CNT'ler) gibi karbon bazlı nanomalzemeler, karbon bakımından zengin hücre yapılarından ayırt edilmesi çok zor olan bu tür nanopartiküllere aittir ve fiili olarak hücre ve doku seviyelerindeki dağılımlarını değerlendirmek için hala nicel bir yöntem yoktur. Burada önerdiğimiz şey, bir multispektral görüntüleme akış sitometresi (ImageStream, Amnis) kullanarak hücrelerdeki CNT'lerin saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren yenilikçi bir yöntemdir. Bu yeni geliştirilen cihaz, hem yüksek verimli hücreleri hem de yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi entegre ederek, böylece doğrudan akıştaki her hücre için görüntüler ve dolayısıyla istatistiksel olarak ilgili görüntü analizi sağlar. Her hücre görüntüsü, parlak alan (BF), karanlık alan (DF) ve floresan kanallarda elde edilir ve her hücre için sırasıyla ışık absorpsiyonu, ışık saçılımı ve floresan seviyesine ve dağılımına erişim sağlar. Analiz daha sonra, deneyin her koşulu için elde edilen 7.000-10.000 hücrenin her bir görüntüsünün piksel piksel karşılaştırılmasından oluşur. CNT'lerin lokalizasyonu ve miktarının belirlenmesi, CNT'lerin bazı özel içsel özellikleri sayesinde mümkün olmaktadır: güçlü ışık emilimi ve saçılması; gerçekten de CNT'ler, BF'de güçlü bir şekilde emilen koyu noktalar ve DF'de hassas bir kolokalizasyonla parlak noktalar olarak görünür.

Bu metodoloji, nanomalzemeler ve hücreler arasındaki etkileşimler hakkındaki çalışmalar üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir, çünkü bu protokol, ışığı yeterince güçlü bir şekilde emme (ve/veya dağıtma) yeteneğine sahip oldukları sürece, çok çeşitli nanomalzemeler için uygulanabilir.

Giriş

Son on yıllarda, nanopartiküllerin yeri geniş bir uygulama yelpazesinde önem kazanmıştır. Özellikle, karbon nanotüpler (CNT'ler), çeşitli teşhis ve tedavi uygulamaları için nanoaraçlar olarak giderek daha fazla araştırılmaktadır; Özel elektriksel, termal ve spektroskopik özellikleri sayesinde, CNT'ler çeşitli ilaçlar veya kontrast maddeler için dağıtım araçları olarak işlev görebilir veya doku mühendisliğinde de yer alabilir¹.

Bununla birlikte, bu tür nanomalzemelerin potansiyel toksisitesi hakkındaki endişeler hala tartışılmaktadır, çünkü esas olarak CNT'lerin organizmadaki kaderi çok tartışmalı olmaya devam etmektedir. Gerçekten de canlı hücrelerde ve dokularda bunları tespit etmek ve ölçmek için uygun yöntemlerin eksikliği vardır: örneğin, Raman spektroskopisi, fotoakustik ve yakın kızılötesi fotolüminesans görüntüleme gibi teknikler önerilmiştir, ancak her yöntem nanotüplerin türüne ve / veya ortamlarına bağlı olarak sınırlamalar gösterir^2-8.

Burada, önerilen yöntem, hücrelerdeki nanopartiküllerin tespiti ve miktarının belirlenmesi için uygulanabilir olabilir. Bu, hem akış sitometrisini hem de yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi birleştiren bir cihaz olan ImageStream'in kullanılmasıyla mümkün oldu. Büyük bir hücre arasında (5000 olay/sn'ye kadar) elde etmenin avantajlarını ve aynı anda her hücrenin istatistiksel verilerinin ve yüksek çözünürlüklü görüntülerinin faydalarını (0,5 μm uzamsal çözünürlük) birleştirir. Genel olarak, görüntüler bir CCD kamera kullanılarak toplanır ve hücrenin iki boyutlu gri tonlamalı bir temsilidir. Işık, görüntüdeki her piksel için nicelleştirilir ve floresansın veya hücre altı boyuta sahip bileşenlerin (örneğin BF'de) hem yoğunluğunu hem de konumunu tanımlar, böylece hücreleri görünümlerine göre ayırt etmek için güçlü bir yetenek sağlar^9,10.

Buradaki amaç, hücrelerdeki CNT'lerin dağılımının ve davranışının nicel bir değerlendirmesini sağlayacak bir nanometroloji yöntemi tasarlamaktı. Özellikle, bu yöntem CNT'lerin hücreler tarafından hücresel alımını, işlenmesini ve ekzositozunu incelemek için geliştirilmiştir. İlk olarak CNT'lerin karmaşık hücresel trafiğini ve ikinci olarak bu nanomalzemelerin hücreler arasındaki transferini kanıtladık: hücre içselleştirilmiş CNT'ler strese girdiklerinde konakçı hücrelerinden kaçarlar, hücre dışı boşlukta yurtdışına yayılırlar ve ister homotipik ister heterotipik olsunlar, saf hücreler tarafından yeniden içselleştirilirler¹¹

'dir.

Önceki çalışma, CNT işlevselleştirmesine ve agregasyon durumuna bağlı olarak aktif veya pasif olmak üzere farklı hücre alım mekanizmalarının ortaya çıkabileceğini gösterdi¹². Burada çok duvarlı CNT'ler, 1,3-dipolar siklo ekleme ve midasyon yoluyla işlevselleştirildi ve daha sonra bir floresan probu, izotiyosiyanat içinde floresan (FITC) ile türetildi. Transmisyon elektron mikroskobunda, hücreler tarafından ya sitozolik lokalizasyonla ayrı ayrı ya da çoğunlukla endozomal ve lizozomal bölmelerde^{bulunan demetler halinde içselleştirilmiş} gibi görünmektedirler 11. ImageStream'de, kümelenmiş CNT'ler, BF'de koyu noktalar ve DF'de parlak noktalar olarak yüksek bir korelasyonla görünür ve CNT etiketli hücreler ile kontrol hücreleri arasında net bir ayrım sağlar. Öte yandan, CNT'lerle işlevselleştirilmiş floresan işaretleyici tarafından yayılan floresan sinyalinin dağılımı o kadar iyi bir şekilde kolokalize edilmedi: aslında, muhtemelen bir söndürme fenomeni nedeniyle, yeşil floresan noktalar BF ve DF üzerindeki noktalarla mutlaka eşleşmez. Bu, ilk olarak, ImageStream ile CNT'lerin tespiti için bir floresan probunun zorunlu olmadığını ve ikinci olarak - bir fortiori - CNT'lerin hem nicelleştirilmesi hem de lokalizasyonu için tam olarak temsil edilmediğini gösterir.

Nanopartiküllerin istatistiksel bir nispi nicelleştirmesini vermenin ötesinde, bu yöntem aynı zamanda hücrelerdeki CNT'lerin lokalizasyonu hakkında bilgi sağlar, yani örneğin hücrenin içindeki CNT'leri plazma zarına bağlı olanlarla ayırt eder. CNT'leri hücre görüntülerinde lokalize etme yeteneği, geleneksel akış sitometrisi analizinin^{sınırlamasının üstesinden gelir 13}. Prosedür burada, hücrenin belirli bölgelerine uyan maskelerin oluşturulması ve yüklü CNT'lere karşılık gelen koyu lekelerin seçilmesi yoluyla geliştirilmiştir.

Genel olarak konuşursak, bu yöntem, kullanılan nanopartiküllerin ışığı güçlü bir şekilde emebilmesi (ve/veya dağıtabilmesi) koşuluyla, hücrelerde görselleştirme veya niceleme ihtiyacını içeren çok çeşitli deneyler için uygulanabilir.

Protokol

1. Suda Dağılabilir Karbon Nanotüplerin (CNT'ler) Hazırlanması

1. İlk CNT'leri 20 ° C'de bir banyo suyu sonikatöründe 20 dakika boyunca sonikasyondan önce hücre kültürü suyunda dağıtın. CNT'ler bir floresan prob ile işlevselleştirilirse, deney boyunca onları mümkün olduğunca ışıktan koruyun.

2. Hücreleri CNT'lerle Etiketleme

1. % 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin içeren DMEM ortamında 25 cm² plakalar üzerinde insan göbek damarı endotel hücrelerini (HUVEC) (örneğin) büyütün.
2. Tam ortamda 0, 10, 20 ve 50 μg / ml konsantrasyonda CNT çözeltileri hazırlayın ve hücreleri 20 saat boyunca 37 ° C'de veya 20 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin (25 cm²'lik bir plaka için 2 ml CNT süspansiyonu).

3. Hücre Fiksasyonu

1. Daha sonra inkübasyon ortamını çıkarın; hücreleri PBS ile durulayın, tripsinize edin ve hücreleri tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin. 1.200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.
2. Ortamı önce 4 ° C'de 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile, ardından korumak için PBS ile değiştirin. Gerekirse, hücreler işlemin bu aşamasında sitometri analizine kadar birkaç gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
3. Her numune, 50 μl PBS'de konsantre edilmiş yaklaşık 10⁶ hücre içermelidir. Analiz sırasında agregaları önlemek için bunları doğru şekilde askıya alın ve 50 μm'lik bir gözenekli boyayıcıdan süzün.
   Not: Hücreleri korumak için her adımın çok nazik bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

4. ImageStream Alımı

Hücrelerin görüntülerini almak için multispektral görüntüleme akış sitometresi ImageStream'i kullanın.
Bazı noktalara saygı gösterilmelidir:

1. Uyarlanmış bir büyütme seçin (burada 40X objektif kullanılır).
2. Florokromlar kullanılıyorsa:
   - florokrom içermeyen bir kontrol numunesi hazırlayın.
   - Kullanılan her florokrom için tek renkli pozitif kontrollü hücreler hazırlayın
   Numunelerinize ek olarak.
3. FITC'yi uyarmak için lazer 488 nm'yi ve floresan emisyonunu toplamak için kanal 02'yi kullanın (bant geçişi 480-560 nm). Ek olarak, parlak alan (BF) ve karanlık alan (DF) için sırasıyla 01 ve 06 kanallarını da kullanın.

5. İşlem Sonrası - IDEAS Analiz Yazılımı (Versiyon 4.0)

1. Elde edilen tüm olaylar arasında, analiz öncelikle tek hücrelerin popülasyonu ile sınırlandırılmalıdır: 'en boy oranını' (yani genişlik/yükseklik) ve 'hücre alanı'nı (BF'deki hücrelere uygulanan parametreler) temsil eden biparametrik bir nokta grafiği kullanın (Şekil 1). Standart bir alana ve 1'e yakın en boy oranına sahip ilgili bölgeye dahil edilen tek hücreler daha sonra çok hücreli olaylardan (geniş alan ve küçük en-boy oranı) ve döküntülerden (son derece küçük alan) ayırt edilir.
2. Odaklanmış düzlemdeki hücreleri seçmek için, yüksek kontrastlı CNT'ler etiketli hücreler için uyarlanmış bir biparametrik nokta grafiği kullanın: BF görüntüsünde 'kontrast' ile 'RMS gradyanı' (bir görüntünün keskinlik kalitesini ölçer) arasında çizin - BF görüntülerinde hem düşük rms gradyanı hem de düşük kontrast gösteren odaklanmamış hücrelerin hariç tutulmasına izin verir (Şekil 1).
3. 1. "En iyi bul özelliğini" kullanarak etiketli ve etiketsiz hücreler arasında en iyi istatistiksel ayrımı sağlayan parametreyi belirleyin. Çalışmamızda ortalama piksel nesne özelliği en uygun olan parametredir (Şekil 2).
   2. Test edilen konsantrasyonlar için alınan CNT'lerin miktarını karşılaştırmak için normalleştirilmiş frekansa karşı bu parametreyi kullanarak bir histogram izleyin (Şekil 3).
   3. Bu iki parametre arasındaki korelasyonu incelemek için 'BF'deki ortalama piksel nesnesi' (Notasyon: Ortalama Pixel_Object (M01, Ch01, Tight)_Ch01) ve 'DF'deki yoğunluk' (Intensity_MC_Ch06) biparametrik grafiğini izleyin (Şekil 4).
4. Miktar tayini ayrıca maskeler aracılığıyla da değerlendirilir:
   1. CNT'ler BF üzerinde güçlü bir şekilde emici koyu noktalar olarak göründüğünden, önce bu çalışmada 0-533 arasında değişen düşük yoğunluklu sınırlı bir piksel aralığı seçerek onlara tam olarak uyan bir eşik maskesi oluşturun (Maske 1, notasyon: Yoğunluk (M01, BF, 0-533)) (Şekil 5). Eşik yoğunluğunun seçimi, kontrol hücrelerine kıyasla etiketli hücreler üzerinde yapılır.
   2. Tersine, DF'nin yüksek yoğunluklu piksellerine (bu durumda 150-4095) uyan bir maske de oluşturun (Maske 2, notasyon: Yoğunluk (M06, DF, 150-4095)) (Şekil 6).
   3. Maskenin alanını kullanarak bir grafik çizin (1 veya 2; (notasyon: maske 1 için Area_Intensity(M01, BF, 0-533)): farklı konsantrasyonlarda CNT'lerin içselleştirilmesinin göreceli bir nicelleştirmesini sağlayacaktır (Şekil 7).
   4. Bu iki maske arasındaki korelasyon derecesini kontrol edin ('Maske 1'in alanı' ve 'Maske 2'nin alanı' biparametrik grafiği sayesinde) (Şekil 7).
5. Hücrelerdeki CNT'leri lokalize etmek için başka maskeler oluşturun:
   1. Hücrenin iç kısmına uyan bir maske: Erode(M01, 7) - tüm hücrenin maskesine (M01) karşılık gelir (Şekil 8), bu da 7 piksel daha aşınmış (Şekil 9).
   2. Sadece Boole denklemini kullanarak zara uyan bir maske: M01 ve Erode(M01,7) değil - tüm hücrenin (M01) iç kısımdan çıkarılan maskesi (Erode(M01,7)) (Şekil 10).
   3. Membran üzerindeki koyu pikselleri (CNT'lere karşılık gelir) dikkate almak için maskeyi oluşturun: Yoğunluk (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533) (Şekil 11).
   4. Etiketli ve etiketsiz hücreler için alaka düzeylerini kontrol etmek için bir hücre koleksiyonuna uygulanan farklı maskeleri görselleştirin (Şekil 12).
   5. Siyah alan olarak adlandırılan 'Area_Yoğunluk (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533)' membran üzerindeki siyah pikselleri seçerek özellik alanını maskeye uygulayın. Membran üzerindeki CNT'lerin miktar tayinine izin verecektir.
      
      Son olarak, içselleştirilmiş CNT'leri sadece zar üzerinde adsorbe edilenlerden ayırt etmek için, zar üzerindeki siyah alanı tüm hücre üzerindeki siyah alana karşı çizin (yani, 'Area_ Yoğunluğu (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533' ve 'Area_ Yoğunluğu (M01, BF, 0-533)').
      
      not: Aynı prosedür FITC-floresan sinyali için de uygulanır: FITC floresan yoğunluğunun artışını BF üzerindeki ortalama piksel sinyalinin azalmasıyla karşılaştırın veya BF üzerindeki koyu noktalar ile FITC floresan yoğunluğu arasındaki kolokalizasyonu karşılaştırın. Bizim durumumuzda, bu tür bir analiz ilgili değildir, çünkü floresan sinyali bir yandan BF'deki karanlık noktalarla ve diğer yandan DF'deki parlak alanla doğru bir şekilde eşleşmez, bu da CNT'lerin içsel özelliklerinin (ışık emiciliği ve saçılması) floresan probu ile ilgili sinyalden daha uygun olduğunu gösterir.
6. Tüm çizimler tek bir deneysel koşulda oluşturulduktan sonra, bir "istatistiksel rapor şablonu" oluşturun, şablonu .ast dosyası olarak kaydedin ve tüm veri dosyalarını toplu hale getirin.

Sonuçlar

ImageStream cihazının çalışma prensibine genel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir. Cihaz, Şekil 2'de CNT'lerle işaretlenmiş üç farklı hücre örneğinde gösterildiği gibi, akış halindeki her bir hücrenin aydınlık alan (BF), karanlık alan (DF veya yan saçılım ışığı) ve floresan kanallarını içeren birden fazla yüksek çözünürlüklü görüntüsünü üretir. Bu kanalların üst üste bindirilmiş görüntüleri de gösterilmekte olup, ilk bakışta korelasyonu örneklendirmektedir.

Tüm işlem sonrası analizlerin hücre görüntülemesine dayandığı göz önüne alındığında, odaklanmış hücrelerin seçimi çalışma için kritik öneme sahiptir (Şekil 3). Aslında, CNT'lerin varlığı, etiketlenmemiş hücrelere kıyasla hem kontrastta hem de gradyanda değişikliklere yol açar: önemli miktarda CNT internalize etmiş olan odaklanmış hücreler, düşük rms gradyanına (ki bu genellikle odaklanmış karşı odaklanmamış hücrelerin ayırt edilmesinde kullanılan tek parametredir) ancak aynı zamanda yüksek kontrasta sahip olma eğilimindedirler; bu durum, iki parametreli bir grafiğin neden temel teşkil ettiğini açıklar. Şekil 3'te odaklanmamış (sarı alan) karşı odaklanmış hücrelerin (mavi alan) ayrımı gösterilmektedir.

Hücre içine alınmış CNT'ler net bir şekilde ayırt edilebilmektedir - özellikle BF görüntülerinde güçlü emilimli koyu noktalar olarak görünürler (farklı etiketleme konsantrasyonlarının etkisini görmek için Şekil 4'e bakınız). Ayrıca, BF üzerindeki ortalama piksel sinyali analiz edilerek alımın göreceli bir nicelendirmesi yapılmıştır: Şekil 5'teki grafikler, CNT etiketleme konsantrasyonu ile beraber bu sinyalin önemli ölçüde arttığını göstermektedir (deney koşulu başına yaklaşık 7.000 hücre için sonuçlar).

İkinci olarak, CNT'lerin kantifikasyonu, BF'nin kısıtlı bir koyu piksel aralığına veya CNT varlığından kaynaklanan lekelere karşılık gelen DF'nin yüksek yoğunluklu piksellerine uygulanan maskeler aracılığıyla da gerçekleştirilebilir (Şekil 6'daki örneklere bakınız). Böylece, bu maskelerin alanının grafiğe dökülmesi, alımın artışını vurgulamaya olanak tanır (BF üzerindeki maske alanı ile örneklendirilmiş olan Şekil 7'de 0-533 aralığındaki pikseller seçilmiştir).

Ayrıca, BF ve DF üzerindeki lekeler arasındaki korelasyon, DF yoğunluğuna karşı BF ortalama piksel sinyali (Şekil 8'de olduğu gibi) (maskeden bağımsız analiz) veya BF üzerindeki maske alanı (Maske 1) ile DF üzerindeki alan (Maske 2) grafiğe dökülerek değerlendirilebilir.

Hücre içindeki CNT'lerin lokalizasyonu için oluşturulan prosedüre ilişkin olarak, Şekil 9A oluşturulan farklı maskeleri göstermektedir. Lokalizasyon maskelerinin sağlamlığının (varsayılan hücre maskesinin erozyonuna dayalı olarak), etiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücre koleksiyonu üzerinde görsel olarak kontrol edilmesi gerektiğini unutmayın. Tüm örnekler için aynı maskeler kullanılır.

Hücre membranındaki siyah lekelerin toplam alanının tüm hücredeki alana karşı grafiğe dökülmesi, 37 °C'de 20 sa boyunca inkübe edilen hücrelerin 4 °C'de 2 sa inkübasyon ile karşılaştırıldığında internalizasyon skorunu verir (bkz. Şekil 9B); bu durum, 4 °C'de CNT'lerin çoğunlukla membranda yer aldığını, 37 °C'de ise CNT'lerin hücrelerin %90'ından fazlasında internalize olduğunu göstermektedir.

Son olarak floresansla ilgili olarak, floresan lekeler ile BF (ve DF) üzerindeki lekeler arasındaki korelasyonun çok düşük olması nedeniyle bu parametre CNT'lerin kantifikasyonu için bir gösterge olarak kullanılmamıştır. Nitekim, FITC yoğunluğu ile parlak alan ortalama pikseli arasındaki korelasyon, -0,2'lik bir Pearson korelasyon katsayısını göstermektedir. Şekil 10'da, floresans sinyalinin parlak alan siyah lekesiyle uygun şekilde eşleştiği veya eşleşmediği iki durum örneklendirilmiştir.

Şekil 1. ImageStream'in genel çalışma prensibine genel bakış.Multispektral görüntüleme sistemi; brightfield, darkfield ve floresan olmak üzere üç farklı modda hücre başına 12 görüntüye kadar elde eder. Kurulum; 405, 488, 560 ve 658 nm dahil olmak üzere 5 uyarım lazerinden oluşur. Işık, küvetten akan hücrelerden farklı objektif lensleri (bu çalışmada 40X objektif lens kullanılmıştır) ile toplanır ve açısal bir dizilimdeki longpass filtre setinden oluşan spektral ayrıştırma elemanına aktarılır. Hücre görüntülerinden sorumlu CCD kamera, görüntüde iz oluşmasını önlemek için time-delay-integration adı verilen bir teknikle çalıştırılır. Genişletilmiş alan derinliği (EDF) bir seçenektir.

Şekil 2. Karbon nanotüplerle (50 μg/mL) işaretlenmiş hücrelerin ImageStream ile farklı kanallar (Parlak Alan (BF), Karanlık Alan (DF), floresan (FITC) ve bunların üst üste bindirmeleri) üzerinden yakalanmış görüntü galerisi. Hücre içi lizozomlar içinde hapsolmuş CNT'ler, parlak alan görüntülerinde büyük siyah lekeler olarak görünür. Buna karşılık, karanlık alan ve floresan görüntülerinde parlak lekeler oluştururlar.

Şekil 3. Odak noktasındaki hücrelerin seçimi. BF görüntülerinde karekök ortalama (rms) gradyanına karşı kontrastı temsil eden iki değişkenli nokta grafiği, odak dışı hücrelerin elenmesini sağlar. Burada sarı alan odak dışı hücreleri, mavi alan ise odaklanmış hücreleri temsil eder. Odak dışı hücreler, parlak alan görüntüsünde hem düşük kontrast hem de düşük gradyan rms ile karakterize edilir. Odaklanmış hücrelerin CNT'ler ile etiketlendikten sonra ayırt edilebilmesi için rms gradyanına ek olarak kontrast özelliğine de ihtiyaç duyulur.

Şekil 4. ImageStream ile görselleştirilen CNT'lerin doz bağımlı alımı. Hücrelerle inkübasyon sırasında (0-50 µg/ml aralığında), CNT dozuna paralel olarak aydınlık alan görüntülerindeki siyah noktaların sayısı ve alanı artmaktadır. Kontrol hücrelerinde siyah noktaların bulunmadığına dikkat ediniz.

Şekil 5. Aydınlık alan görüntülerine dayalı CNT alımının göreceli kantifikasyonu. Tüm hücreyi içeren "nesne" maskesine uygulanan ortalama piksel özelliğinin histogramları, kantifikasyon için kullanılabilecek doz bağımlı bir davranışı açıkça göstermektedir. R9 aralığı, CNT-pozitif hücreleri kapsamaktadır.

Şekil 6. BF görüntülerindeki siyah noktaları ve DF görüntülerindeki parlak noktaları seçen maskelerin oluşturulması. CNT'ler BF görüntüsünde güçlü absorbsiyon gösteren koyu noktalar olarak göründüğünden, bu çalışmada 0-533 arasında düşük yoğunluğa sahip sınırlı bir piksel aralığını seçmek için bir eşik maskesi oluşturulmuştur (Mask 1, notasyon: Intensity(M01, BF, 0-533)). Buna karşılık, yüksek saçılma alanlarına karşılık gelen DF'deki parlak noktaları seçmek için DF görüntüsündeki yüksek yoğunluklu piksellere (bu durumda 150-4095) uygun bir maske (Mask 2, notasyon: Intensity (M06, DF, 150-4095)) kullanılmıştır.

Şekil 7. CNT'lerin doz bağımlı alımı, BF görüntülerindeki siyah nokta alanının nicelleştirilmesiyle gösterilmiştir. BF'ye uygulanan eşik maskesi (mask 1) kullanılarak, her bir hücre için siyah noktaların alanı nicelleştirilebilir ve doz bağımlı bir dağılım sergilendiği görülebilir.

Şekil 8. BF (absorpsiyon) ve DF (saçılma) görüntülerine dayalı CNT miktar belirleme yöntemleri koreledir. Solda, BF görüntüsündeki ortalama piksel karşı DF görüntüsündeki yoğunluk, CNT'ler ile işaretlenmiş hücreler için iyi bir korelasyon göstermektedir (50 µg/ml) (Pearson korelasyon katsayısı r = -0,68). Sağda, BF üzerindeki koyu lekeleri kapatan maske alanı karşı CNT'ler ile etiketlenmiş hücreler için DF'de maske uyumunun parlak noktalarının alanı (50 µg/ml). Pearson korelasyon katsayısı r = -0,83'tür. 7.000 hücreden elde edilen değerler grafiklenmiştir.

Şekil 9. Spesifik maskeler kullanılarak hücrelerdeki CNT lokalizasyonu. (A) Hücrenin belirli bir konumuna uygun maskeler oluşturulmuştur; soldan sağa doğru - tüm hücre, sadece membran ve hücre içi. Bir başka maske, eşik yoğunluğu sayesinde siyah noktalara uyum sağlar (Maske 1, notasyon: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) CNT'lerin lokalizasyon değerlendirmesi, A'da açıklanan lokalizasyon maskeleri kullanılarak hücrelerin farklı bölgelerindeki siyah noktaların alanı ölçülerek elde edilebilir. İçselleştirme yolunu inhibe etmek için inkübasyon, CNT'ler (50 µg/ml) ile hem 37 °C'de hem de 4 °C'de gerçekleştirilmiştir. Membrandaki siyah alanın tüm hücredeki siyah alana oranını temsil eden grafik, 4 °C'de membranda CNT'lerin doza bağlı bir absorbsiyonunu gösterirken, CNT'lerin tam içselleştirilmesi 37 °C'de etkilidir.

Şekil 10. BF üzerindeki CNT kaynaklı siyah noktaların FITC görüntüsündeki floresan parlak noktalarla kolokalizasyonu. Floresan parlak noktalar, BF üzerindeki siyah noktalarla her zaman aynı konumda değildir. Görüntülenen ilk iki hücre için düzgün bir eşleşme görülmekteyken, son iki hücre için görülmemektedir.

Tartışma

1. Değişiklik ve Sorun Giderme

Bu çalışmada ilk amaç, hücrelerdeki CNT'lerin miktarını ve lokalizasyonunu değerlendirmekti. Konfokal mikroskopi, floresan işaretleyici FITC^8,14 ile işlevselleştirilmiş CNT'lerin hücre içi dağılımını değerlendirmek için a priori altın yöntem olabilirdi. Bununla birlikte, ana dezavantaj, tek hücreli görüntüleme ile sınırlı olması ve bu nedenle istatistiksel olarak anlamlı verilerin olmamasıdır. ImageStream, bu engellerin ötesinde çalışmaya izin verir: aslında, çok sayıda hücreyi (5.000-10.000) kısa sürede (

Geleneksel akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında, ImageStream'in benzersiz avantajı, her hücrenin multispektral görüntülerini ve sinyal yoğunluğunun piksel piksel karşılaştırmasını sağlamaktır. Böylece ImageStream, yüksek verimli akış sitometrisinin istatistiksel gücünü, analiz edilen her hücre için konfokal görüntülemenin analitik avantajlarıyla birleştirir. Hücrelerde CNT'lerin etiketsiz nispi nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu için çok önemlidir.

2. Protokol İçindeki Kritik Adımlar

Kritik adım, her çalışmaya en uygun parametrelerin seçiminden oluşur. Bizim durumumuzda en iyi yol, analizi nanotüplerin absorpsiyon ve saçılma özelliklerine dayandırmaktı: BF'deki koyu lekelerin lokalizasyonu ile DF'deki parlak noktaların lokalizasyonu arasındaki iyi korelasyon, geliştirilen yöntemin ilgili ve güvenilir olduğunu desteklemektedir - ve hücre görüntüleme olmadan mümkün olmayabilirdi.

3. Tekniğin Sınırlamaları

CNT'lerin hücrelerde görselleştirilmesinin, yalnızca endozomal hücre içi veziküllerde birikme eğiliminde oldukları ve daha sonra güçlü emici ve saçılan noktalar olarak göründükleri için mümkün olduğu vurgulanmalıdır. Tek tek nanotüpler bu yönteme dayalı olarak tespit edilmemelidir, ancak sonunda açık bir sınırlama oluşturan floresan üzerinde tespit edilebilir. İkincisi, niceleme 'mutlak' değil, farklı etiketleme konsantrasyonları için ve kontrol etiketsiz hücrelerle karşılaştırıldığında görecelidir. Bazı nicel özellikler (ortalama piksel, yoğunluk vb.) mutlak parametrelerdir, diğerleri ise maske seçimine (eşik maskesi, yerelleştirme maskeleri) bağlıdır.

4. Mevcut Yöntemlere Göre Önemi

Floresan ile ilgili olarak, ImageStream analizi, FITC parlak sinyali ile diğer kanallardaki noktalar arasındaki CNT kümelerinin zayıf kolokalizasyonunu vurgular. Bu nedenle, floresansın CNT'lerin nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu için güvenilir bir gösterge olmadığı görülmektedir. Bununla birlikte, esas olarak floresan ölçümüne dayanan geleneksel akış sitometrisinin sınırlamasının üstesinden gelen multispektral yüksek verimli ImageStream, karbon nanotüplerin hücreler içinde lokalizasyonunu sağlarken, istatistiksel etiketsiz bir nicelemenin yolunu açar.

5. Gelecekteki Uygulamalar

Bu yüksek verimli istatistiksel nanometroloji yöntemi, hücrelerle etkileşime girdiğinde ışığın yüksek emilimini ve saçılımını gösteren herhangi bir nanomalzemeye genelleştirilebilir. Bu nedenle, nano-biyo-arayüz, nanotoksikoloji ve nanotıp araştırmaları için önemli uygulamalara sahip olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ImageStream	Amnis