Yöntem makalesi

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

DOI:

10.3791/50566

⸱

12 Aralık 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), CNRS/Université Paris Diderot, 2ImagoSeine BioImaging Core Facility, Institut Jacques Monod, CNRS/Université Paris Diderot, 3Laboratoire d'Immunopathologie et Chimie Thérapeutique, CNRS/Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada temel amaç, karbon nanotüplerin (CNT'ler) hücresel alımını ve nihai ekzositozunu izlemekti. Bu perspektiften bakıldığında, burada multispektral görüntüleme akış sitometrisini kullanan, istatistiksel olarak anlamlı sayıda hücrede CNT'lerin nicelleştirilmesine ve lokalizasyonuna izin veren benzersiz bir yöntem önerdik.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karbon nanotüpler (CNT'ler) gibi karbon bazlı nanomalzemeler, karbon bakımından zengin hücre yapılarından ayırt edilmesi çok zor olan bu tür nanopartiküllere aittir ve fiili olarak hücre ve doku seviyelerindeki dağılımlarını değerlendirmek için hala nicel bir yöntem yoktur. Burada önerdiğimiz şey, bir multispektral görüntüleme akış sitometresi (ImageStream, Amnis) kullanarak hücrelerdeki CNT'lerin saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren yenilikçi bir yöntemdir. Bu yeni geliştirilen cihaz, hem yüksek verimli hücreleri hem de yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi entegre ederek, böylece doğrudan akıştaki her hücre için görüntüler ve dolayısıyla istatistiksel olarak ilgili görüntü analizi sağlar. Her hücre görüntüsü, parlak alan (BF), karanlık alan (DF) ve floresan kanallarda elde edilir ve her hücre için sırasıyla ışık absorpsiyonu, ışık saçılımı ve floresan seviyesine ve dağılımına erişim sağlar. Analiz daha sonra, deneyin her koşulu için elde edilen 7.000-10.000 hücrenin her bir görüntüsünün piksel piksel karşılaştırılmasından oluşur. CNT'lerin lokalizasyonu ve miktarının belirlenmesi, CNT'lerin bazı özel içsel özellikleri sayesinde mümkün olmaktadır: güçlü ışık emilimi ve saçılması; gerçekten de CNT'ler, BF'de güçlü bir şekilde emilen koyu noktalar ve DF'de hassas bir kolokalizasyonla parlak noktalar olarak görünür.

Bu metodoloji, nanomalzemeler ve hücreler arasındaki etkileşimler hakkındaki çalışmalar üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir, çünkü bu protokol, ışığı yeterince güçlü bir şekilde emme (ve/veya dağıtma) yeteneğine sahip oldukları sürece, çok çeşitli nanomalzemeler için uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yıllarda, nanopartiküllerin yeri geniş bir uygulama yelpazesinde önem kazanmıştır. Özellikle, karbon nanotüpler (CNT'ler), çeşitli teşhis ve tedavi uygulamaları için nanoaraçlar olarak giderek daha fazla araştırılmaktadır; Özel elektriksel, termal ve spektroskopik özellikleri sayesinde, CNT'ler çeşitli ilaçlar veya kontrast maddeler için dağıtım araçları olarak işlev görebilir veya doku mühendisliğinde de yer alabilir1.

Bununla birlikte, bu tür nanomalzemelerin potansiyel toksisitesi hakkındaki endişeler hala tartışılmaktadır, çünkü esas olarak CNT'lerin organizmadaki kaderi çok tartışmalı olmaya devam etmektedir. Gerçekten de canlı hücrelerde ve dokularda bunları tespit etmek ve ölçmek için uygun yöntemlerin eksikliği vardır: örneğin, Raman spektroskopisi, fotoakustik ve yakın kızılötesi fotolüminesans görüntüleme gibi teknikler önerilmiştir, ancak her yöntem nanotüplerin türüne ve / veya ortamlarına bağlı olarak sınırlamalar gösterir2-8.

Burada, önerilen yöntem, hücrelerdeki nanopartiküllerin tespiti ve miktarının belirlenmesi için uygulanabilir olabilir. Bu, hem akış sitometrisini hem de yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi birleştiren bir cihaz olan ImageStream'in kullanılmasıyla mümkün oldu. Büyük bir hücre arasında (5000 olay/sn'ye kadar) elde etmenin avantajlarını ve aynı anda her hücrenin istatistiksel verilerinin ve yüksek çözünürlüklü görüntülerinin faydalarını (0,5 μm uzamsal çözünürlük) birleştirir. Genel olarak, görüntüler bir CCD kamera kullanılarak toplanır ve hücrenin iki boyutlu gri tonlamalı bir temsilidir. Işık, görüntüdeki her piksel için nicelleştirilir ve floresansın veya hücre altı boyuta sahip bileşenlerin (örneğin BF'de) hem yoğunluğunu hem de konumunu tanımlar, böylece hücreleri görünümlerine göre ayırt etmek için güçlü bir yetenek sağlar9,10.

Buradaki amaç, hücrelerdeki CNT'lerin dağılımının ve davranışının nicel bir değerlendirmesini sağlayacak bir nanometroloji yöntemi tasarlamaktı. Özellikle, bu yöntem CNT'lerin hücreler tarafından hücresel alımını, işlenmesini ve ekzositozunu incelemek için geliştirilmiştir. İlk olarak CNT'lerin karmaşık hücresel trafiğini ve ikinci olarak bu nanomalzemelerin hücreler arasındaki transferini kanıtladık: hücre içselleştirilmiş CNT'ler strese girdiklerinde konakçı hücrelerinden kaçarlar, hücre dışı boşlukta yurtdışına yayılırlar ve ister homotipik ister heterotipik olsunlar, saf hücreler tarafından yeniden içselleştirilirler11

'dir.

Önceki çalışma, CNT işlevselleştirmesine ve agregasyon durumuna bağlı olarak aktif veya pasif olmak üzere farklı hücre alım mekanizmalarının ortaya çıkabileceğini gösterdi12. Burada çok duvarlı CNT'ler, 1,3-dipolar siklo ekleme ve midasyon yoluyla işlevselleştirildi ve daha sonra bir floresan probu, izotiyosiyanat içinde floresan (FITC) ile türetildi. Transmisyon elektron mikroskobunda, hücreler tarafından ya sitozolik lokalizasyonla ayrı ayrı ya da çoğunlukla endozomal ve lizozomal bölmelerdebulunan demetler halinde içselleştirilmiş gibi görünmektedirler 11. ImageStream'de, kümelenmiş CNT'ler, BF'de koyu noktalar ve DF'de parlak noktalar olarak yüksek bir korelasyonla görünür ve CNT etiketli hücreler ile kontrol hücreleri arasında net bir ayrım sağlar. Öte yandan, CNT'lerle işlevselleştirilmiş floresan işaretleyici tarafından yayılan floresan sinyalinin dağılımı o kadar iyi bir şekilde kolokalize edilmedi: aslında, muhtemelen bir söndürme fenomeni nedeniyle, yeşil floresan noktalar BF ve DF üzerindeki noktalarla mutlaka eşleşmez. Bu, ilk olarak, ImageStream ile CNT'lerin tespiti için bir floresan probunun zorunlu olmadığını ve ikinci olarak - bir fortiori - CNT'lerin hem nicelleştirilmesi hem de lokalizasyonu için tam olarak temsil edilmediğini gösterir.

Nanopartiküllerin istatistiksel bir nispi nicelleştirmesini vermenin ötesinde, bu yöntem aynı zamanda hücrelerdeki CNT'lerin lokalizasyonu hakkında bilgi sağlar, yani örneğin hücrenin içindeki CNT'leri plazma zarına bağlı olanlarla ayırt eder. CNT'leri hücre görüntülerinde lokalize etme yeteneği, geleneksel akış sitometrisi analizininsınırlamasının üstesinden gelir 13. Prosedür burada, hücrenin belirli bölgelerine uyan maskelerin oluşturulması ve yüklü CNT'lere karşılık gelen koyu lekelerin seçilmesi yoluyla geliştirilmiştir.

Genel olarak konuşursak, bu yöntem, kullanılan nanopartiküllerin ışığı güçlü bir şekilde emebilmesi (ve/veya dağıtabilmesi) koşuluyla, hücrelerde görselleştirme veya niceleme ihtiyacını içeren çok çeşitli deneyler için uygulanabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Suda Dağılabilir Karbon Nanotüplerin (CNT'ler) Hazırlanması

  1. İlk CNT'leri 20 ° C'de bir banyo suyu sonikatöründe 20 dakika boyunca sonikasyondan önce hücre kültürü suyunda dağıtın. CNT'ler bir floresan prob ile işlevselleştirilirse, deney boyunca onları mümkün olduğunca ışıktan koruyun.

2. Hücreleri CNT'lerle Etiketleme

  1. % 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin içeren DMEM ortamında 25 cm² plakalar üzerinde insan göbek damarı endotel hücrelerini (HUVEC) (örneğin) büyütün.
  2. Tam ortamda 0, 10, 20 ve 50 μg / ml konsantrasyonda CNT çözeltileri hazırlayın ve hücreleri 20 saat boyunca 37 ° C'de veya 20 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin (25 cm²'lik bir plaka için 2 ml CNT süspansiyonu).

3. Hücre Fiksasyonu

  1. Daha sonra inkübasyon ortamını çıkarın; hücreleri PBS ile durulayın, tripsinize edin ve hücreleri tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin. 1.200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.
  2. Ortamı önce 4 ° C'de 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile, ardından korumak için PBS ile değiştirin. Gerekirse, hücreler işlemin bu aşamasında sitometri analizine kadar birkaç gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  3. Her numune, 50 μl PBS'de konsantre edilmiş yaklaşık 106 hücre içermelidir. Analiz sırasında agregaları önlemek için bunları doğru şekilde askıya alın ve 50 μm'lik bir gözenekli boyayıcıdan süzün.
    Not: Hücreleri korumak için her adımın çok nazik bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

4. ImageStream Alımı

Hücrelerin görüntülerini almak için multispektral görüntüleme akış sitometresi ImageStream'i kullanın.
Bazı noktalara saygı gösterilmelidir:

  1. Uyarlanmış bir büyütme seçin (burada 40X objektif kullanılır).
  2. Florokromlar kullanılıyorsa:
    - florokrom içermeyen bir kontrol numunesi hazırlayın.
    - Kullanılan her florokrom için tek renkli pozitif kontrollü hücreler hazırlayın
    Numunelerinize ek olarak.
  3. FITC'yi uyarmak için lazer 488 nm'yi ve floresan emisyonunu toplamak için kanal 02'yi kullanın (bant geçişi 480-560 nm). Ek olarak, parlak alan (BF) ve karanlık alan (DF) için sırasıyla 01 ve 06 kanallarını da kullanın.

5. İşlem Sonrası - IDEAS Analiz Yazılımı (Versiyon 4.0)

  1. Elde edilen tüm olaylar arasında, analiz öncelikle tek hücrelerin popülasyonu ile sınırlandırılmalıdır: 'en boy oranını' (yani genişlik/yükseklik) ve 'hücre alanı'nı (BF'deki hücrelere uygulanan parametreler) temsil eden biparametrik bir nokta grafiği kullanın (Şekil 1). Standart bir alana ve 1'e yakın en boy oranına sahip ilgili bölgeye dahil edilen tek hücreler daha sonra çok hücreli olaylardan (geniş alan ve küçük en-boy oranı) ve döküntülerden (son derece küçük alan) ayırt edilir.
  2. Odaklanmış düzlemdeki hücreleri seçmek için, yüksek kontrastlı CNT'ler etiketli hücreler için uyarlanmış bir biparametrik nokta grafiği kullanın: BF görüntüsünde 'kontrast' ile 'RMS gradyanı' (bir görüntünün keskinlik kalitesini ölçer) arasında çizin - BF görüntülerinde hem düşük rms gradyanı hem de düşük kontrast gösteren odaklanmamış hücrelerin hariç tutulmasına izin verir (Şekil 1).
    1. "En iyi bul özelliğini" kullanarak etiketli ve etiketsiz hücreler arasında en iyi istatistiksel ayrımı sağlayan parametreyi belirleyin. Çalışmamızda ortalama piksel nesne özelliği en uygun olan parametredir (Şekil 2).
    2. Test edilen konsantrasyonlar için alınan CNT'lerin miktarını karşılaştırmak için normalleştirilmiş frekansa karşı bu parametreyi kullanarak bir histogram izleyin (Şekil 3).
    3. Bu iki parametre arasındaki korelasyonu incelemek için 'BF'deki ortalama piksel nesnesi' (Notasyon: Ortalama Pixel_Object (M01, Ch01, Tight)_Ch01) ve 'DF'deki yoğunluk' (Intensity_MC_Ch06) biparametrik grafiğini izleyin (Şekil 4).
  4. Miktar tayini ayrıca maskeler aracılığıyla da değerlendirilir:
    1. CNT'ler BF üzerinde güçlü bir şekilde emici koyu noktalar olarak göründüğünden, önce bu çalışmada 0-533 arasında değişen düşük yoğunluklu sınırlı bir piksel aralığı seçerek onlara tam olarak uyan bir eşik maskesi oluşturun (Maske 1, notasyon: Yoğunluk (M01, BF, 0-533)) (Şekil 5). Eşik yoğunluğunun seçimi, kontrol hücrelerine kıyasla etiketli hücreler üzerinde yapılır.
    2. Tersine, DF'nin yüksek yoğunluklu piksellerine (bu durumda 150-4095) uyan bir maske de oluşturun (Maske 2, notasyon: Yoğunluk (M06, DF, 150-4095)) (Şekil 6).
    3. Maskenin alanını kullanarak bir grafik çizin (1 veya 2; (notasyon: maske 1 için Area_Intensity(M01, BF, 0-533)): farklı konsantrasyonlarda CNT'lerin içselleştirilmesinin göreceli bir nicelleştirmesini sağlayacaktır (Şekil 7).
    4. Bu iki maske arasındaki korelasyon derecesini kontrol edin ('Maske 1'in alanı' ve 'Maske 2'nin alanı' biparametrik grafiği sayesinde) (Şekil 7).
  5. Hücrelerdeki CNT'leri lokalize etmek için başka maskeler oluşturun:
    1. Hücrenin iç kısmına uyan bir maske: Erode(M01, 7) - tüm hücrenin maskesine (M01) karşılık gelir (Şekil 8), bu da 7 piksel daha aşınmış (Şekil 9).
    2. Sadece Boole denklemini kullanarak zara uyan bir maske: M01 ve Erode(M01,7) değil - tüm hücrenin (M01) iç kısımdan çıkarılan maskesi (Erode(M01,7)) (Şekil 10).
    3. Membran üzerindeki koyu pikselleri (CNT'lere karşılık gelir) dikkate almak için maskeyi oluşturun: Yoğunluk (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533) (Şekil 11).
    4. Etiketli ve etiketsiz hücreler için alaka düzeylerini kontrol etmek için bir hücre koleksiyonuna uygulanan farklı maskeleri görselleştirin (Şekil 12).
    5. Siyah alan olarak adlandırılan 'Area_Yoğunluk (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533)' membran üzerindeki siyah pikselleri seçerek özellik alanını maskeye uygulayın. Membran üzerindeki CNT'lerin miktar tayinine izin verecektir.

      Son olarak, içselleştirilmiş CNT'leri sadece zar üzerinde adsorbe edilenlerden ayırt etmek için, zar üzerindeki siyah alanı tüm hücre üzerindeki siyah alana karşı çizin (yani, 'Area_ Yoğunluğu (M01 ve Erode değil (M01, 7), BF, 0-533' ve 'Area_ Yoğunluğu (M01, BF, 0-533)').

      not: Aynı prosedür FITC-floresan sinyali için de uygulanır: FITC floresan yoğunluğunun artışını BF üzerindeki ortalama piksel sinyalinin azalmasıyla karşılaştırın veya BF üzerindeki koyu noktalar ile FITC floresan yoğunluğu arasındaki kolokalizasyonu karşılaştırın. Bizim durumumuzda, bu tür bir analiz ilgili değildir, çünkü floresan sinyali bir yandan BF'deki karanlık noktalarla ve diğer yandan DF'deki parlak alanla doğru bir şekilde eşleşmez, bu da CNT'lerin içsel özelliklerinin (ışık emiciliği ve saçılması) floresan probu ile ilgili sinyalden daha uygun olduğunu gösterir.
  6. Tüm çizimler tek bir deneysel koşulda oluşturulduktan sonra, bir "istatistiksel rapor şablonu" oluşturun, şablonu .ast dosyası olarak kaydedin ve tüm veri dosyalarını toplu hale getirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ImageStream cihazının çalışma prensibine genel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 2'de CNT'lerle etiketlenmiş üç farklı hücre ile örneklendiği gibi, parlak alan (BF), karanlık alan (DF veya yandan dağınık ışık) ve floresan kanal(lar) dahil olmak üzere akıştaki her hücrenin birden fazla yüksek çözünürlüklü görüntüsünü üretir. Bu kanalların kaplamaları da ilk bakışta korelasyonu gösteren şekilde gösterilir.

Tüm işlem sonrası analizlerin hücre görüntülemeye dayandığı göz önüne alındığında, odaklanmış hücrelerin seçimi çalışma için çok önemlidir (Şekil 3). Aslında, CNT'lerin varlığı, etiketlenmemiş hücrelere kıyasla hem kontrast hem de gradyan üzerinde değişikliklere neden olur: CNT'lerin önemli bir miktarını içselleştiren odaklanmış hücreler, düşük bir rms gradyanına sahip olma eğilimindedir (bu genellikle odaklanmış ve odaklanmamış hücrelerin ayrımı için kullanılan benzersiz parametredir) ama aynı zamanda biparametrik bir grafiğin neden gerekli olduğunu açıklayan önemli bir kontrasttır. Şekil 3'te odaklanmamış (sarı alan) ile odaklanmış hücreler (mavi alan) arasındaki ayrım gösterilmektedir.

Hücre içselleştirilmiş CNT'ler açıkça ayırt edilebilir - özellikle BF'nin güçlü bir şekilde emen koyu lekeler olarak görünmesi durumunda (çeşitli etiketleme konsantrasyonunun etkisine bakınız, Şekil 4). Ayrıca, BF üzerindeki ortalama piksel sinyali analiz edildi ve alımın göreceli bir niceliği verildi: Şekil 5'teki grafikler, CNT etiketleme konsantrasyonu ile önemli bir artış olduğunu göstermektedir (deneysel koşul başına yaklaşık 7.000 hücre için sonuçlar).

İkinci olarak, CNT'lerin nicelleştirilmesi, BF'nin sınırlı bir koyu piksel aralığına veya DF'nin yüksek yoğunluklu pikseline (Şekil 6'daki örneklere bakın), CNT'lerin varlığından kaynaklanan noktalara karşılık gelen maskelerin kullanılmasıyla da mümkündür. Bu nedenle, bu maskelerin alanının çizilmesi, alımın artmasının yanı sıra vurgulamaya da izin verir (Şekil 7'de, BF üzerindeki maske alanıyla, 0-533 arasında değişen pikseller seçilerek örneklenmiştir).

Ek olarak, BF ve DF üzerindeki noktalar arasındaki korelasyon, DF yoğunluğu ile BF ortalama piksel sinyaline karşı (Şekil 8'deki gibi) (maskeden bağımsız analiz) veya BF üzerindeki maske alanı (Maske 1) ile DF üzerindeki alan (Maske 2) çizilerek değerlendirilebilir.

Hücrelerin içindeki CNT'lerin lokalizasyonu için oluşturulan prosedürle ilgili olarak, Şekil 9A, oluşturulan farklı maskeleri gösterir. Yerelleştirme maskelerinin sağlamlığının (varsayılan hücre maskesinin aşınmasına bağlı olarak) etiketli ve etiketsiz hücrelerden oluşan bir koleksiyonda görsel olarak kontrol edilmesi gerektiğini unutmayın. Tüm numuneler için aynı maskeler kullanılır.

Hücre zarındaki siyah noktaların toplam alanını tüm hücredeki alana karşı çizmek, 4 °C'de 2 saatlik inkübasyona kıyasla 37 °C'de 20 saat inkübe edilen hücreler için bir içselleştirme puanı sağlar (bkz. Şekil 9B

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

figure-results-7

figure-results-8

figure-results-9

figure-results-10

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Değişiklik ve Sorun Giderme

Bu çalışmada ilk amaç, hücrelerdeki CNT'lerin miktarını ve lokalizasyonunu değerlendirmekti. Konfokal mikroskopi, floresan işaretleyici FITC8,14 ile işlevselleştirilmiş CNT'lerin hücre içi dağılımını değerlendirmek için a priori altın yöntem olabilirdi. Bununla birlikte, ana dezavantaj, tek hücreli görüntüleme ile sınırlı olması ve bu nedenle istatistiksel olarak anlamlı verilerin olmamasıdır. ImageStream, bu engellerin ötesinde çalışmaya izin verir: aslında, çok sayıda hücreyi (5.000-10.000) kısa sürede (

Geleneksel akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında, ImageStream'in benzersiz avantajı, her hücrenin multispektral görüntülerini ve sinyal yoğunluğunun piksel piksel karşılaştırmasını sağlamaktır. Böylece ImageStream, yüksek verimli akış sitometrisinin istatistiksel gücünü, analiz edilen her hücre için konfokal görüntülemenin analitik avantajlarıyla birleştirir. Hücrelerde CNT'lerin etiketsiz nispi nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu için çok önemlidir.

2. Protokol İçindeki Kritik Adımlar

Kritik adım, her çalışmaya en uygun parametrelerin seçiminden oluşur. Bizim durumumuzda en iyi yol, analizi nanotüplerin absorpsiyon ve saçılma özelliklerine dayandırmaktı: BF'deki koyu lekelerin lokalizasyonu ile DF'deki parlak noktaların lokalizasyonu arasındaki iyi korelasyon, geliştirilen yöntemin ilgili ve güvenilir olduğunu desteklemektedir - ve hücre görüntüleme olmadan mümkün olmayabilirdi.

3. Tekniğin Sınırlamaları

CNT'lerin hücrelerde görselleştirilmesinin, yalnızca endozomal hücre içi veziküllerde birikme eğiliminde oldukları ve daha sonra güçlü emici ve saçılan noktalar olarak göründükleri için mümkün olduğu vurgulanmalıdır. Tek tek nanotüpler bu yönteme dayalı olarak tespit edilmemelidir, ancak sonunda açık bir sınırlama oluşturan floresan üzerinde tespit edilebilir. İkincisi, niceleme 'mutlak' değil, farklı etiketleme konsantrasyonları için ve kontrol etiketsiz hücrelerle karşılaştırıldığında görecelidir. Bazı nicel özellikler (ortalama piksel, yoğunluk vb.) mutlak parametrelerdir, diğerleri ise maske seçimine (eşik maskesi, yerelleştirme maskeleri) bağlıdır.

4. Mevcut Yöntemlere Göre Önemi

Floresan ile ilgili olarak, ImageStream analizi, FITC parlak sinyali ile diğer kanallardaki noktalar arasındaki CNT kümelerinin zayıf kolokalizasyonunu vurgular. Bu nedenle, floresansın CNT'lerin nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu için güvenilir bir gösterge olmadığı görülmektedir. Bununla birlikte, esas olarak floresan ölçümüne dayanan geleneksel akış sitometrisinin sınırlamasının üstesinden gelen multispektral yüksek verimli ImageStream, karbon nanotüplerin hücreler içinde lokalizasyonunu sağlarken, istatistiksel etiketsiz bir nicelemenin yolunu açar.

5. Gelecekteki Uygulamalar

Bu yüksek verimli istatistiksel nanometroloji yöntemi, hücrelerle etkileşime girdiğinde ışığın yüksek emilimini ve saçılımını gösteren herhangi bir nanomalzemeye genelleştirilebilir. Bu nedenle, nano-biyo-arayüz, nanotoksikoloji ve nanotıp araştırmaları için önemli uygulamalara sahip olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), Region Ile de France (sözleşme no E539) ve CNRS tarafından desteklenmiştir. Açık Erişim için EMD Milipore tarafından ödeme yapıldı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ImageStreamfigure-materials-1 Amnis

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics. Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).
  2. De La Zerda, A., et al. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice. Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).
  3. Zavaleta, C., et al. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes. Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).
  4. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).
  5. Welsher, K., et al. A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice. Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).
  6. Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3, 149-158 (2009).
  7. Al-Jamal, K. T., et al. Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging. Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).
  8. Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells. ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).
  9. Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).
  10. Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).
  11. Marangon, I., et al. Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging. Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).
  12. Lacerda, L., et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes. Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).
  13. Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Methods in Molecular Biology. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).
  14. Zhou, F., et al. New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ayd n Alan G r nt lemeKaranl k Alan G r nt lemeFloresan EtiketlemePiksel Piksel AnalizH cresel Al m NicelendirmesiNanomalzeme TespitiImageStream SitometresiNanotoksikoloji De erlendirmesi

İlgili makaleler