Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

Summary

Biz üç test örneklerinin hazırlanması ve nasıl optimize etmek ve STORM mikroskoplar performansını değerlendirmek için kullanılır açıklar. Bu örnekleri kullanarak biz ham veri almak ve daha sonra yaklaşık 30-50 nm çözünürlükte hücrelerinde süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek işlemek için nasıl gösterir.

Abstract

FIRTINA standart floresan mikroskopi teknikleri en fazla 10 kat daha iyi çözünürlük ile yeni geliştirilen süper-çözünürlük mikroskopi tekniktir. Görüntü bir görüntü molekülü-by-molekülü oluşturarak, normalden çok farklı bir şekilde elde edilir Ancak, onların görüntü alımı optimize etmek için çalışırken kullanıcılar için bazı önemli sorunlar vardır. Bu süreci yardım ve FIRTINA biz 3 deney numunelerinin hazırlanması ve 30-50 nm arasında tipik çözünürlük ile süper çözünürlük görüntüleri edinme ve işleme fırtına metodoloji mevcut nasıl daha fazla fikir kazanmak için. Serbestçe kullanılabilir yağmur fırtınası işleme yazılımı kullanımı ile test örnekleri birleştirerek görüntü kalitesi ve çözünürlüğü hakkında bilgi büyük bir anlaşma elde etmek mümkündür. Bu ölçümleri kullanarak bu hazırlama, boya seçimi, tampon koşulları ve görüntü alma ayarları örnek, optik gelen görüntüleme işlemi optimize etmek mümkündür. BizBu tür görüntü alımı ve yoğunluğu sırasında numune hamle 'mislocalization' fenomen sonuçlanan ilgili sorunlar yanal sürüklenme, kötü görüntü kalitesine yol bazı ortak sorunlar, LSO örnekleri göstermektedir.

Introduction

Son zamanlarda optik mikroskopi teknikleri bir dizi tipik kırılma sınırını aşmak ve 100 nm veya ^1,2 daha iyi çözünürlükte görüntü üretebilir süper çözünürlüklü mikroskopi veya nanoscopy, olarak adlandırılan, geliştirilmiştir. 2008 yılında yılın Doğa Yöntemleri yöntem olarak süper çözünürlüklü mikroskopi açıklanmasından bu yana, lokalizasyon tabanlı mikroskoplar geliştirme büyük bir olmuştur. Örneğin, çok renkli uygulamalar ^3-6, 3D uygulamaları ^7-12 ve hatta canlı hücre uygulamaları ^5,13-17 vardır. Bu sistemler hücre biyologların eline optik laboratuvarları dışında ticari ediliyor ve artık kendi yolunu yapıyoruz Dahası, biyomedikal sorulara verdikleri kullanımı ve uygulama daha artış olması muhtemeldir.

Bu ailenin bir dal bir görüntü molekülü-by-molekülü oluşturarak işe yerelleştirme-tabanlı yöntemler olduğunu. Bensadece bir kaç uzamsal olarak ayrılmış moleküller herhangi bir zamanda aktif olan, böylece bu yapmak için n düzeni, numune içindeki floresan moleküller çoğunluğunun kapatılmalıdır. Bu moleküller daha sonra hızla açılıp kapatılır ve nüfusun önemli bir kısmı alt kırınım hassasiyetle temel yapısını yansıtacak şekilde görüntülü o kadar çok görüntü alınır. Yaklaşımlar bir dizi GSDIM ^18, PALM ^19, fPALM ^20, STORM ²¹ ve RESOLFT ²² dahil yayınlanmıştır. Tek bir molekül algılama konumunu ölçmek algoritmaları daha sonra örneğin rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ^{26, 12,} ve bir yağmur fırtınası palm3d ²⁷ Gauss montaj ²³ ile 20 nm'den daha iyi kesinleşmemiş ile molekülün gerçek konumunu bulmak için de kullanılabilir. Hücre ya da yüksek molekül yoğunluğa sahip diğer biyolojik örnekler, görüntüleme, bu çerçevelerin binlerce almak nedenle gerekliBu, konumsal olarak ayrılmış, yanıp sönen bir görüntü için Etiketlenmiş moleküllerin önemli bir bölümü olarak işaret etmektedir.

Rasgele optik yeniden mikroskobu (STORM) ve yüksek ölçüde ilişkili dSTORM ve GSDIM yöntemler ticari olarak temin edilebilen organik boyalar ²¹ ile çalışmak için gösterilmiştir lokalizasyon tabanlı süper çözünürlük yöntemleri vardır. O zamandan beri, çünkü özgüllük ve floresan mikroskobu gerçekleştirmek için köklü immün yaklaşımların göreli kolaylık metodoloji özellikle cazip kılan farklı bir dizi boya için ^28-30 için geçerli olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, lokalizasyon tabanlı süper çözünürlük görüntülemede kullanılmak üzere potansiyeline sahip boya antikoru ve boya-biyomolekül konjugatlarının, bir dizi kolay erişim vardır. STORM ve benzeri yaklaşımların genel ilkeleri nispeten basit ve ilk bakışta donanım ve numune hazırlama nispeten stra görünüyor ikenightforward, yüksek kalite, artifakttan ücretsiz, süper çözünürlüklü görüntüler elde için kritik süreçte adımlar vardır.

Tüm mikroskopi teknikleri olduğu gibi süreç 3 ana adımda düşünülebilir: Birinci, ikinci numune hazırlama, görüntü alma ve, üçüncü, görüntü işleme ve / veya görüntü analizi ve yorumlanması. Ek çözme gücü ve yerelleştirme dayalı bir yaklaşım kullanarak süper çözünürlüklü görüntüler üreten yöntem bazı yeni sorunlar ve düşünceler ^31-33 tanıttı. Immün, birincil ve ikincil antikor kombinasyonu kullanıldığında, özellikle dolaylı immünoflüoresans gerçekleştirirken numune hazırlama ile başlayarak, bu floresan boya uzak, ilgi konusu moleküle kadar 20 nm'ye kadar olabileceğini not edilmelidir. Mikrotübül durumunda, bu 25 nm ^28,30 beklenen bir mikro tüp çapı ile karşılaştırıldığında, 35-50 nm çap ile sonuçlanır. Ayrıca, etiketleme yoğunluk gerekir mbir yüksek kaliteli görüntü ¹⁴ oluşturmak için Nyquist kriterlerini EET. Bir lifli yapı boyunca 20 nm beklenen bir resim çözünürlüğü için örneğin en az her 10 nm ^27, bir boya molekülü olmalıdır. Üzerinde denge - birçok boyalar lokalizasyon tabanlı boya genel performansı en az dört önemli kriterlerin, olay anahtarlama başına yani tespit edilen fotonların (parlak iyidir her yanıp sönüyor parlaklık) bir karışımı olan yaklaşımları için çalışmak yayınlanmıştır iken -off görev döngüsü (devlete karşı off boyaların kontrast oranı - daha kapalı genellikle daha iyidir), hayatta kalma fraksiyonu (düşük bir ağartma oranı daha iyidir) ve döngüleri geçiş sayısı (floroforun başına yanıp sayısı - daha fazla floroforla başına 1 yanıp sönme) molekülü sayma amaçlar için bir avantaj olmasına rağmen, yüksek çözünürlük için daha iyidir. Bu durum, bundan başka, herhangi bir boya için, bu özellikler, farklı tampon şartlarında değişir ve gerçeği ile karmaşıkLazer gücü ^28,29 ile. Buna ek olarak, aynı zamanda, bu benzersiz STORM düşünceler olarak, görüntü kalitesi sabitleme koşulları modifikasyonu ve söndürme reaktiflerin kullanımı ile otoflüoresanı en aza, örneğin daha geleneksel floresan mikroskopi teknikleri ile aynı şekilde örnek hazırlama optimize ederek arttırılabilir. Ayrıca, spesifik olmayan şekilde bağlanmış florofor minimize etiket konsantrasyonları, inkübasyon süreleri ve blokaj ve yıkama adımları ayarlama yapılabilir ki önemlidir.

Görüntü alımı ikinci adımı da önemlidir. Mikroskop üzerinde optimum ayar boya, tampon koşulları, etiketleme yoğunluğu ve örnek tipi, cam, hücreler ya da doku örnekleri üzerinde, örneğin tekli katmanları bağlıdır. Ana hususlar kamera pozlama süresi, kare sayısı, aydınlatma açısı (TIRF, HILO, Epi) ve lazer güç vardır. Amaç mümkün olduğunca çabuk kadar çok parlak bir konumsal olarak ayrılmış yanıp toplamaktır. Eğer arka irekonstrüksiyon algoritması olarak doğru bir pozisyon lokalize etmek mümkün olmayacaktır, yüksek s veya yanıp söner, çok parlak değildir, başka bir deyişle, sinyal-gürültü oranı kötüdür. Yanı sıra ölçülebilir her molekül konumu ile doğruluk, yani yerelleştirme hassasiyet maksimize olarak, görüntü kalitesi de yerleşimlerin yüksek sayısına bağlıdır. Ilgi moleküllerin sayısı yetersiz yansıması, Nyquist kriterleri ^14,27 karşılanmış olmayacak gibi, ya da kötü olması nedeniyle etiketleme verimliliği, aşırı ağartmanın veya yetersiz bir kare sayısına, daha sonra elde edilen süper çözünürlüklü görüntü noktasal ve süreksiz olacak .

Ve son olarak, Üçüncü adım, görüntü işleme, standart floresan mikroskopi teknikleri ile karşılaştırıldığında özellikle önemlidir. W bilmek kafa karıştırıcı olabilir tercih açısından bir avantaj, ve hem de bir dezavantaj serbestçe ve ticari olarak temin edilebilen algoritmaları, bir dizi bulunmaktadırhich kullanmak için en uygun olan. Örneğin ham veri mekansal ayrı yanıp iyi aralıklı varsa o zaman bir tek-molekül uydurma algoritması rainstorm ²⁷ mevcut seyrek uydurma algoritmaları, örneğin son derece doğru ve verimli olabilir, rapidSTORM ^24,25, QuickPALM ²⁶ Yazılım ¹² palm3d ve . Ham veriler daha sonra uygun olabilir algoritmaları sinyalleri örtüşen bir sürü varsa DAOSTORM ^34, 3B ³⁵ ve deconSTORM ³⁶ içerir. Ayrıca bu algoritmalar, sinyal sayısı, ya da yanıp başına foton, yanı sıra düzeltilmiş Gauss fonksiyonları ile görüntülenmesi veya süper-çözünürlük piksel boyutu olabilir piksel ızgaraları ile histogramlar gibi farklı görüntü ekran seçenekleri gibi çeşitli kriterler için eşik içerir kullanıcı tarafından seçilir. Tüm bu seçenekler son görüntünün görünümünü değiştirmek ve görüntü analizi ve yorumlanması için etkileri vardır.

Bu nedenle, açıklık uğruna biz fırtına gibi sevk edecektir boya temelli lokalizasyon tabanlı süper-çözünürlük deneyleri, ve daha deneyimli kullanıcılar fırsat için bir başlangıç ​​noktası ile yeni kullanıcı sağlayacak 3 test örneklerini sunmak daha da optimize deneyleri. İlk olarak, bu kat için dextran-boya konjugatının bir floresan tabakası ile cam yüzey mümkündür. Bu mikroskop, boya ve tampon floresan sinyal yanıp üretmek için çalıştıklarını söyledi kurmak için hızlı ve kolay bir yol sağlar. Yöntem daha sonra, tampon koşulları optimize görüntü toplama ayarları ve farklı boyalar test etmek için yağmur fırtınası tarafından üretilen ortalama yerelleştirme hassas ve sayı ölçümleri karşılaştırarak uzatılabilir. İkincisi, biz kolayca phalloidin-boya birleşimleri kullanılarak etiketli olabilir camına aktin filamentleri hazırlamak için basit bir protokol mevcut. Bu çözünürlükte ²⁷ ve genellikle tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) ölçümleri almak için idealdir yapıları sağlamakbir filament çözünürlüğü ³⁷ ampirik bir tahmini olarak verilmiştir. Bu lokalizasyon tabanlı süper çözünürlük mikroskopisinde çözünürlük florofor parlaklık, arka plan gürültüsü ve yerelleştirme yoğunluğu ²⁷ bir fonksiyonudur ve bu numune boyunca mutlaka sabit olmadığı için çözünürlük örnekleri arasında ve aynı numune içindeki görüntüleri arasında değişir unutulmamalıdır. Aktin filamentleri gibi mislocalizations gibi potansiyel eserler göstermek ve sürüklenme için kullanılan ve yağmur fırtınası içinde yazılım özellikleri ile tespit edilebilir nasıl vardır. Ayrıca, ölçü ve doğru kayması hem de floresan referans işaretlerinin kullanılmasını tarif eder. Ve üçüncüsü, epidermal büyüme faktörü (EGF)-boya konjugatları ile hücrelerin boyanması tarif edilmektedir. Hücre yüzeyindeki reseptörünün bir kısmı, yaklaşık 50-150 n alt kırılma boyutlu yapılar vesiküller, endositoz yoluyla uğrar, çünkü EGF, süper çözünürlüklü görüntü performansı yararlı bir gösterge sağlarçapı ^27,38,39 m.

Protocol

Not: Bu protokol boyunca, ipuçları ve öneriler belirli adımları izleyerek bulunur. "* 1" notu 1 böylece bu özel adıma alakalı olduğunu ve gösterir.

1.. Cam Floresan Dekstran Kaplama

1. 8 odasının coverglass her oyuğuna% 0.01 poli-L-lisin çözeltisinin 200 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca inkübe edilir. Hiçbir kalan sıvı olmasını sağlamak için, bir pipet ile çıkarın.
2. , Bir 2 mg / ml stok çözeltisi yaratmak için imalatçının talimatlarına uygun olarak, dekstran-Alexa 647 ^{* 1} sulandırın. Buradan, bir 20 ug / ml solüsyon oluşturmak için deiyonize edilmiş su içinde 25 ul halinde 0,25 ul seyreltik.
3. Dekstran Alexa-647 çözeltisinin bir yüksek yoğunluklu bir kaplama oluşturmak için, de-iyonize su, 200 ul bir toplam olarak 20 ug / ml çözeltisinin 20 ul seyreltik. Bir orta yoğunluklu bir çözüm için de-iyonize su (orijinal stok çözeltiden 1:10,000 seyreltme) 200 ul 2 ul seyreltik. Düşük içinyoğunluklu çözüm de-iyonize su (orijinal stok çözeltiden 1:100,000 seyrelti) 200 ul 0.2 ul seyreltik.
4. Her çukuruna seyreltilmiş Alexa 647-dekstran çözeltileri 200 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca inkübe edilir. Daha uzun inkübasyon süreleri, daha yoğun bir dekstran kaplama ile sonuçlanabilir ki kullanılabilir. Üç kez çıkarın ve _H2O ile yıkayın ^{* 2}

Not 1: Diğer dekstran-boya konjugatlan kullanılabilir. Istenen kombinasyonları ticari olarak mevcut değilse, Konjuge olmamış dekstran da boyalar konjuge edilebilir.

Not 2: floresan muntazamlığı azaltabilir, ancak aynı dekstran odalar haftalık bir süre boyunca reimaged edilebilir. Herhangi bir tampon maddesi yokluğunda, 4 ° C de depolama önerilir.

2. Camına Floresan Aktin filamentler

1. Bölmenin her çukuruna% 0.01 poli-L-lisin çözeltisinin 200 ul ilave edin ve ^{3 *} 10 dakika boyunca inkübe edilir. ReKalan herhangi bir sıvı olmasını sağlamak için, bir pipet ile hareket eder.
2. Her bölmeye genel aktin tamponu (imalatçının talimatlarına göre yeniden) 90 ul ekle. (Üretici talimatlarına uygun olarak metanol, 1.5 ml içinde çözündürüldüğünde 0.2 birim) aktin filament çözeltisi ve 1 ul falloidin-Alexa 647 önceden 10 uM 10 ul eklenir ve hafifçe yukarı aşağı pipet ve karıştırın. ^{4 *} 30 dakika boyunca inkübe edin.

Not 3: Poli-L-lisin kaplamalı cam bağlanabilen az filamentler odacık sonuçları içinde filaman çözelti hacmini arttırmak.

Not 4: 4 ° C'de en çok 48 saat inkübasyonu kez iyi sonuçlar ile test edilmiştir. Bir oda daha fazla gün için aynı örneği kullanmak için tavsiye edilmez yani tampon anahtarlama maruz edildikten sonra aktin filament görüntü kalitesi bozulur.

3. Fiducial Markers olarak kürecik Floresan Boncuk

1. 200 ul PBS'ye TetraSpeck tanelerin 1 ul seyreltin ve karıştırın.
2. Bir görüntüleme odasına seyreltilmiş boncuk ^* ilave edin ve ^{5 ila} 15 dakika boyunca bekleyin. Çözeltisini çıkarın ve önceki görüntüleme 3 defa PBS ile yıkayın.

Not 5 - seyreltme ve inkübasyon süresi boncuk farklı yoğunlukları elde etmek için ayarlanabilir. 20.5 mikron başına 10 boncuk x 20.5 mikron alan-view - Bu protokol genellikle 3 ile sonuçlanır.

4. Epidermal Büyüme Faktörü Hücre boyama

1. Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde, yaklaşık olarak% 80 birleşme görüntüleme odalarına Kültür HeLa hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu ile takviye edilmiştir.
2. Kültür Ortamı çıkarın ve PBS ile yıkayın. Daha sonra 10 dakika boyunca% 4 formaldehit çözeltisi (4 mi,% 10 formaldehid çözeltisi, 1 ml 10X PBS, 5 ml su) içinde 500 ul ekleyin. Formaldehit çıkarın ve 3 defa PBS ile yıkayın. Hücreler d kalmasına izin vermeyinry ve her zaman kullanmak PBS hipotonik stresi önlemek için çözümler tamponlu.

DİKKAT - formaldehit son derece zehirlidir. Uygun eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar mont giyilir emin olun. Formaldehit bertarafı için yerel kuralları kontrol edin.

3. 50 ug / ml stok çözeltisi yaratmak için imalatçının talimatlarına uygun olarak EGF-Alexa 647 sulandırın. (PBS içinde)% 0.1 BSA çözeltisi 200 ul bu stok çözeltinin 2 ul ekle. Hücrelerden PBS çıkarın, EGF bir çözeltisi eklenmekte ve 30 dakika boyunca inkübe edin.
4. Çözeltisini çıkarın ve 15 dakika boyunca (PBS içinde)% 0.1 BSA, bir bloklama çözeltisi ilave edilmeden önce 3 defa PBS ile yıkayın. Bu kaldırma ve önceki görüntüleme PBS ile, ilave 3 kez yıkayın.

5. Tampon Hazırlama anahtarlama

1. Katalaz 10 ul (20 ug / ml), 1 M Tris-(2-carboxyelthyl) fosfin hidroklorür (4 mM), 2.5 mi gliserin (% 50) 20 ul, 125 ul bir enzim stok çözeltisi (A) İsim1 M KCI (25 mM) içinde, 1 M, pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 100 ul, 5 glukoz oksidaz (1 mg / ml) ve diH20 mg ile 5 ml hacme kadar top. Bu, -20 ° C'de saklanır ve 1 yıla kadar kullanılabilir 100 x 50 ul alikotları yapmak için yeterlidir.
2. ) 4 g glükoz (100 mg / ml), 4 ml gliserin (% 10) ve 36 ml diH20 ile bir şeker stok solüsyonu (B) olun. 20 ° C ve 1 yıla kadar kullanılabilir - Bu saklanabilir 100 x 400 ul alikotları yapmak için yeterlidir.
3. MEA-HCI (1 M) ve 113.6 mg ₂ dihidro 0 1 ml olan bir indirgeyici madde stok çözelti (C) olun. Taze kullanın veya -20 ° C'de saklanır ve 1 aya kadar kullanılabilecek 10 x 100 ul hacimde, (bölüntülerin dondurursam yok) olun.
4. Hemen önce görüntüleme için, enzim (A), glukoz (B) ve bu oran, 50 ul içinde birlikte madde (C) stok çözeltileri azaltılması, 400 ul, 100 ul karıştırın ve ^{* 6} PBS ile 1 ml'ye. Bu tampon şimdi oksijen temizlemek ve bir indirgeyici ortam (100 mM MEA-olacakHCl) ^{* 7.} Nihai pH değeri 6.0 olmalıdır - 8.5 (ayarı normalde gerekli değildir) ^{* 8.}

Not 6 - bu tamponu, Cy5 ve Alexa 647 gibi karbosiyanin bazlı boya ile kullanılmak için uygundur.

Not 7 - nihai enzim konsantrasyonu glikoz oksidaz, 50 ug / ml (5 birim / ml) ve katalaz 1 ug / ml (40-60 birim / ml) 'dir. Enzimatik etkinlik (adet) tedarikçiler tarafından verilir ve değişebilir. Katalaz için hesaplamalar adım 5.4 sonra 1 ug / ml 'lik son konsantrasyonu, enzim, 50 birimleri içeren varsayalım. Benzer oksijen tutucu bileşenleri dahil olmak üzere çeşitli tampon kompozisyonlar ^21,30,40 bulunabilir. Tampon ve boya kombinasyonları bir özeti için başvurular ^28,29 bakın. Gliserin ve TCEP -20 ° C'de uzun süreli depolama için gerekli olan

Not 8 - görüntüleme aktin filamentler t istikrara kavuşturmak için 2 mM _MgCl2 ve 0.2 mM ATP eklersenizo filamentler.

6. (Alexa 647 boya kullanılarak) FIRTINA Veri mikroskop kazanılması

1. Termal denge ulaşılacak izin STORM / PALM mikroskop, görüntüleme önce tercihen en az 3 saat açın. Bu daha önce görüntüleme sürüklenme artan bir şansı var.
2. Mikroskop sahne numune tutucu içine görüntüleme odasına yerleştirin. Numune tutucuya sıkıca ve düz olduğundan emin olun.
3. Görüntüleme odasından PBS çıkarın ve daha sonra anahtarlama tamponu ile üst doldurun. Dikkatli olun kabarcıklar bütün olduğunu ve tüm odasının kapalı olduğunu yapma, odasının üst üzerinde bir lamel yerleştirin. Herhangi kabarcıklar görülüyorsa, ek tampon veya PBS ile kontör aksi performans azalabilir tampon.

DİKKAT - objektif lens ile ilgili olarak örnek yan ve eksenel kayma en aza indirmek için bu örnek ve tampon dengelenmeye bırakılır önerilirönce görüntüleme için en az 15 dakika süre ile oda sıcaklığı arasında gerçekleştirilir.

4. Görüntülü ilgilendiren bir floresan yapısını bulmak. Bu hücre örneklerinin için özellikle yararlı olan-dışı odak ışığı, en aza indirerek, sinyal-gürültü oranını iyileştirir gibi bu durumda aydınlatma arzu edilen açı, bir TIRF ya da son derece eğimli açı seçin önerilir. Önce STORM görüntüleme için bir yapı referans kırınım sınırlı görüntü al.
5. Yaklaşık 2 kW / cm ² tekabül yüksek bir güce (yaklaşık 640 nm uygun bir dalgaboyu) uyarma lazer artırmak iken 10 msn maruz kamera ayarları ve yaklaşık 50 Hz'lik bir çevrim süresi ile görüntüleme (saniye başına kare) . Flüoroforlar (çoğu örnekler için muhtemelen 10 saniye içinde) bir seyrek yanıp sönen desen içine geçiş kere ^{* 9} 10.000 kare toplamak.

Not 9 - 10000 çerçeveleri Burada açıklanan örnekler için uygundurancak diğer örnekler için 50.000 veya daha fazla çerçeve sayısını artırmak için gerekli olabilir.

7. Ham Veri Super-Çözünürlüklü resimler Yeniden (rainstorm kullanarak)

1. MATLAB içinde rainSTORM.m dosyasını açın ve (Şekil 1A) çalıştırın.
2. Rainstorm pencerede (Şekil 1B) Gözat düğmesini kullanarak analiz edilecek görüntü dosyasını seçin. Bu bir. Tif dosyası (İmageJ tif formatında içine diğer dosya türlerini dönüştürmek için kullanılabilir) olmalıdır. ^{* 10} veri elde etmek için kullanılan mikroskop sisteminin ham verileri eşleştirmek için piksel genişliğini değiştirmek. Varsayılan diğer değerleri bırakın.

Not 10 - görüntü üzerinde piksel boyutu 160 nm olacak 100X objektif lens ile bir sistemde yani tipik bir EMCCD kamera 16 mikron piksel boyutu vardır. Ticari sistemlerde piksel boyutu genellikle yazılım içinde görüntülenir. Piksel boyutları en yerelleştirme mikroskopları için 100 nm ve 160 nm arasında değişmektedir.

3. 'Süreç Görüntüler' düğmesine basın ve bir ön görüntü görünene kadar bekleyin. Işleme süresi, dosya boyutu, bilgisayar şartname ve ^{* 11} ham veri içinde aday yanıp söner sayısına bağlıdır.

Not 11 - aktin ve EGF veri 10.000 çerçeve dizileri Intel Xeon E5420 CPU ile bir PC kullanarak sırasıyla işlemek için 23 saniye ve 25 saniye sürdü. MATLAB bir paralel işleme alet kutusu olmadan aynı bilgisayarı kullanarak, ya da birden fazla çekirdekli işlemci olmadan bir bilgisayar ile, süreleri sırasıyla 66 saniye ve 81 saniye idi.

4. Güncelleştirilmiş bir süper çözünürlüklü görüntü basın 'Aç Değerlendirmeyi' butonu oluşturmak için ve ikinci bir pencere (Şekil 1C) görünecektir. (Şekil 1D) istediğiniz gibi görüntü ekranı değiştirmek için 'Kontrast ayarlayın' düğmesine basın. Bazı durumlarda, görüntü çok koyu olduğu en büyük değer azaltılmalıdır.
5. Rev kullanınkullanışlı görüntü kalitesi ölçümleri üretmek ve daha fazla süper çözünürlüklü görüntü rafine iewer pencere (Şekil 1C). Sırasıyla 4.000, 0.1 ve 0,8-2,0 değerleri ^{* 12} ilk üç kalite kontrol parametrelerini ayarlayın. Ya bir foton kalibrasyon ölçümü veya belirli bir EM kazanç ayarı için kamera üreticisi tarafından belirtilen foton-eğrisi kalibrasyon eğrisi değerleri kullanılarak dayalı olmalıdır foton değeri, başına sayıları güncelleyin. Bu doğru hassasiyet ve ^{* 13} çözünürlükte ölçümler elde etmek için önemlidir.

Not 12 - Sinyal Sayımlar parlaklık kriterlere göre yanıp reddeder. Değer parlak yüksek göz kırpma son görüntüde bir yerelleştirme olarak kabul haline olmalıdır. Bu durum, boya ve maruz kalma süresi ve kameranın duyarlılık foton çıkış bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Sinyali ve monte Gauss yani d arasında anlamlı bir kare hata varsa Tolerans yanıp reddederouble zirveleri. PSF monte genişliği bu aralığın dışında yatıyor eğer PSF Sigma Range yanıp reddeder, yani dar bir aralık out-of-odak sinyallerini ve sürekli floresan büyük toplu lekeler reddetmek için kullanılabilir. Daha geniş bir yelpazede kullanarak son resimde görünen mislocalization eserler neden olabilir. Uygulamada, yerelleştirme hassas kesme parametre kullanarak ilk kalite kontrolünü gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

Not 13 ​​- çözünürlük ölçümleri hakkında daha fazla bilgi için referanslar ^23,27 bkz. Her tarafından üretilen fotonların sayısı her lokalizasyon yerelleştirme hassasiyet hesaplanması ve dolayısıyla genel tüm görüntü için hassas tahminler ortalama türeterek mümkündür yanıp bilerek kısaca. Foton değer başına 200 sayar bir kazanç ayarı ile bir Andor IXON DU-897E kullanılarak 9.04.

6. Ortalama yerelleştirme PRECIS optimize arasındaki ödünleşime yerelleştirme hassas kesme (Şekil 1C) Alterson görüntüde yerelleştirme sayıda karşı iyon. 30-50 nm değerleri verilerin kalitesi ve örnek olarak tavsiye edilir. Histogramlar ve info.txt dosyaları hem de bu kararı (Şekil 1F ve 1G) bilgilendirmek için kullanılabilir.
7. Rekonstrüksiyon ölçek faktörü (Şekil 1C) varsayılan orijinal görüntülerde piksel genişliği 160 nm olduğunu varsayarak 32 nm süper çözünürlük piksel üretecek olan, 5'tir. Ham görüntüleri 100 nm bir piksel boyutu varsa, bu 20 nm piksel ile süper çözünürlüklü görüntüler üretecektir. ^{* 14} son resimde küçük süper-çözünürlük pikselleri üretmek için ölçek faktörünü artırın.

Not 14 - yerelleştirme mikroskopi Çözünürlük (basit bir histogram yeniden yapılanma piksel boyutuna yani) görselleştirme yanı sıra yerelleştirme hassasiyet için gerekli yumuşatma bağlıdır. Uygulamada, yeniden piksel boyutu genel olarak lokalizasyonu daha küçük olmalıdırhassas (info text dosyasına ortalama Hassas tahmini ölçüsünü görmek - 6,11 ve 6,12 adımlar). Bu durumda nedeniyle yeniden piksel boyutuna çözünürlük kaybı ^23,27 küçük olacaktır. Örneğin satır ve Şekil 4E sütun yönünde ortalama hassas tahminler 16.1 nm ve 16.2 nm. 16 nm'lik bir piksel boyutu (160 nm bir orijinal piksel genişliği 10 ile yeniden ölçek faktörü) bu verileri görselleştirmek için kullanılır olmuştur.

8. Örneğin, ham veri alt kümeleri için yeniden kısıtlamak için sınır çerçeve aralığını (Şekil 1C) değiştirin [2001-inf] ham verilerin ilk 2.000 kareleri dışlar.
9. Güncelleştirilmiş bir süper-çözünürlüklü görüntü (Şekil 1E) oluşturmak için 'Çalıştır Değerlendirmeyi' düğmesini (Şekil 1C) basın.
10. Görüntü kalitesi ölçümleri (Şekil 1F) ^{* 15} görüntülemek için, 'Görünüm histogramlar' düğmesini (Şekil 1C) basın.

Not 15 - kamera kare sayısı ve sağ alt (Şekil 1F) yılında Thompson Yerelleştirme Precisions histogramında karşı kabul yerleşimlerin sayısını gösteren sağ üst grafik yerelleştirme hassas kesim incelemesi seçeneği bilgilendirmek için kullanılabilir. Örneğin, 50 nm kesme kullanarak nihai süper çözünürlüklü görüntü dahil olmaktan daha kötü hassasiyetle tüm bölgeselleştirmelerini dışlar.

11. Tüm bu veriler ^{* 16} kurtarmak için inceleme (Şekil 1C) olarak 'resim kaydet' butonuna basın.

Not 16 - 3 ila 5 dosya (toplamı görüntü, STORMdataImage, STORMprocessed, bilgi ve hists) seçilen seçeneklere bağlı olarak kaydedilebilir, Şekil 1G bkz. FIRTINA işlenmiş görüntü değiştirilmiş kontrastı ve renk haritaları ile gösterilir. STORMdataImage her pikselin gri seviye uyuşmuş eşittir hangi bir gri tonlamalı görüntüBunun içinde tespit edilmiştir yerleşimlerin er.

12. 7,6 adım ve istenirse farklı yorumcusu parametrelerle sonraki adımları tekrarlayın verileri inceledikten sonra (örneğin info.txt dosya ve histogramlar) dönüş. Adımda 7.11 'Resmi Kaydet' tuşuna basarak önceden kaydedilmiş verilerin üzerine yazılır.

8. Kutu İzleme ve Drift Düzeltme (rainstorm kullanarak)

1. Normal şekilde bir görüntü oluşturmak için 7.9 - 7.1 adımları izleyin.
2. Inceleme (Şekil 1C) de 'Box İzleme' düğmesine basın ve tıklatın ve gözden görüntü üzerinde ilgi fiducial işaretleyici veya yapı üzerinde bir kutu sürükleyin.
3. Yeni bir görüntü görünene kadar 'Kutulu Pozisyonları' (örnekler için Şekil 6B, 6C ve 6F) görüntülemek, hangi bekleyin. İstenirse bu görüntüyü kaydedin.
4. Ilgi nesnesi bir referans işaretleyici ise düzeltme kayması 'kaymakamlık tarafından izlenen' Set Anchor 'düğmesine tıklayarak yapılabiliryolu Drift 'düğmesine basın. Son olarak 'Çalıştır Değerlendirmeyi' şimdi tekrar tüm yerleşimleri fiducial işaretleyici pozisyonlara göre düzeltilmiş olacak yeni bir FIRTINA görüntü oluşturmak için tıklayınız. Boncuk pozisyonları nihai gözden görüntüden silinir.
5. Nihai sürüklenme düzeltilmiş görüntüsü içinde başka referans belirteçleri varsa, bu 'Kutu Takibini' tuşuna basarak kaldırılabilir, 'Kutulu sil' ve sonra istediğiniz gibi 'Run Değerlendirmeyi' olarak birçok kez.

Results

Dekstran

Dekstran Başarılı bir kaplama, bir floresan tek tabaka üretmek gerekir. Yüksek konsantrasyonda bu nispeten homojen görünmelidir. Düşük konsantrasyonlarda (Şekil 2A) seyrek görünür. Birçok FIRTINA / PALM mikroskoplar TIRF için epifluoresan gelen aydınlatma açısını değiştirmek için yeteneği var. Tipik bir EMCCD kamera 512 x 512 piksel, örneğin, bir full frame kamera görünümünü kullanırken, bir hatta aydınlatma dikkat edilmelidir. Herhangi çizgili veya out-of-odak bölgeleri varsa bu örnek objektif lens taze yağ ile numune tutucu içine yerleştirilemeyen gerektiğini gösterebilir. Alternatif olarak bu mikroskop ile bir sorun olduğunu gösterebilir.

Süper çözünürlük ham verileri edinirken görüntüleme lazer yaklaşık 2 kW / cm ² güç olarak artırılmalıdır. Fluorophores tahrik gibi yanıp sönen ardından floresans bir ilk patlama olacakGeçici karanlık devletlere. Yüksek Dekstranın de yanıp söner özellikle görüntü elde başlangıcına yakın, üst üste muhtemeldir yoğunluklarından (Video 1). Orta ve düşük yoğunluklarda bu yanıp yani uzamsal ayrılmış, seyrek olmalı ve belirgin arka plan ile odak (Şekil 2A, Resim 2 ve 3 kare 2.000, 5.000 ve 8.000 bakınız). Bu görüntü alma aşamasında, sabit lazer aydınlatmada, yanıp sayısı (yüksek yoğunluklu numune, Şekil 2A çerçeve 8.000 çerçevesini 2,000 karşılaştırın) zamanla azalacaktır. Farklı dekstran konsantrasyonlarda (yüksek, orta ve düşük) ve çeşitli süper-çözünürlüklü görüntüler arasındaki temel fark yerleşimlerin azalan sayısı (Şekil 2A ve 2B) 'dir. Diğer bir deyişle, floresan moleküllerin konsantrasyonu, ham veri yanıp sayısı ve lokalizasyonu sayısı orantılı bir ilişki vardır. Bu ilişki,Ancak, çok yüksek molekül itibariyle (Şekil 2C kırmızı ve mavi çizgiler karşılaştırmak) yazılım başarıyla molekülleri lokalize etmek mümkün yoğunlaştıran basit doğrusal bir değildir. Bunun nedeni, işlem programı yanıp söner olmayan seyrek Gauss uydurma algoritması kullanılarak uygun pozisyonlar için en yüksek konsantrasyonda mümkün olmasıdır. Yanıp nedeniyle onlar (Şekil 2A ve 2C) seyrek olmak gibi yazılım daha yanıp söner daha uygun olabilir photobleaching edinim aşaması ile azalma gibi. Ayrıca, tek başına boya molekülleri yanıp olabilir ve bu nedenle daha ^28,41,42 birden lokalize.

Bu örneklerin herhangi biri, fakat özellikle yüksek yoğunluklu dekstran bir görüntüleme genel bir sorun, hızlı bir STORM görüntü elde etme aşamasında difüzyon gibi görünen parlak ama odaklanmamış floresan bulanıklığın varlığı olabilir. Bu, üzerinde yüksek kontrast florofor farklıdır(Şekil 3A, video 5) yanıp sönen görülebilir camın yüzeyi. Bu müstakil floresan moleküller önce sviçleme tampon eklenmesi için PBS ile yıkama adımların sayısını arttırarak ya da bölmenin (Şekil 3B, Video 6) taze anahtarlama tampon eklenmesi ile önlenebilir veya kaldırılabilir. İşleme ve yerleşimlerin sayısı ve (Şekil 3C, 3D, 3E yanıp lokalize yazılım takılabilir hangi ile hassas hem de bir azalma var çok farklı süper çözünürlüklü görüntüler her görüntü sırası sonuçlarından verileri karşılaştırarak ve 3F).

Aktin filamentler

Önceden oluşturulmuş aktin filamentler kırınım sınırlı görüntüleme (Şekil 4A-4C) ile camın yüzeyine yapışmış görülebilir. Filaman sayısı çok aşağıda ise, o zaman daha uzun bir enkübasyon süresi, kullanılan ya da aktin hacminde bir azalma olabilirfilament çözüm de yardımcı olur. Daha kaliteli görüntüler tek nispeten parlak filamentler (Şekil 4D) ziyade karışık alanlar sonuçları seçilmesi. Satın alma aşamasında, aydınlık-odak yanıp söner filamanın uzunluğu (Video 7) birlikte görülmelidir. Seyrek Yanıp sönen edinim aşamasında görülmeli ve akabinde işlenen verilerle bir ince sürekli filaman (Şekil 4E) orada olmalı ve çerçeve başına lokalizasyonu gerektiği Şekil 3E aksine kademeli bir düşüş (Şekil 4F).

Yanıp Eğer seyrek olmayan, ya da yazılım molekülleri lokalize etmek mümkün değilse, daha incelikli bir eserdir, bir mislocalization ³² olarak adlandırılan, neden olabilir. Yazılım ortalamalar üst üste binen iki moleküllerinin konumu ve yerelleştirme aralarında orta konumda bir yoldur, bu ortaya çıkar. BLI örtüşen önemli sayıda henüz bir göstergesinks ve dolayısıyla mislocalizations, ortalama hassas tahminleri satır ve sütun yönleri, örneğin, yatay ve dikey olarak aynı olması gerektiğidir; mislocalizations olduğu yerde, bu filamanın uzunluğu boyunca meydana gelmiş olur, üretilen normal göz kırpma (daha büyük yani dolayısıyla yönden birine daha az doğruluk ile lokalize olurdu ki,) daha fazla piksel yayılmıştır. Orada görüntüleme alanında, tek filament aktin ve yatay veya dikey olarak yatan burada en kolay görülür. Bu durumda, STORM mikroskop, her iki yönde de 16 nm bir ortalama hassasiyeti elde etti. Bu hassas sınırı, yaklaşık 34 nm etkili görüntü çözünürlüğü ölçüsü sonuçlanır. Biz, görüntünün çözünürlüğü tahmin etmek FWHM bir önlem almak için çok küçük phalloidin-Alexa 647 etiket ile, homojen bir çapa, 7 nm bir ipliksi bir yapıya sahip gibi bu ölçümler, ancak, bir yağmur fırtınası ²⁷ tarafından sağlanır. Dra tarafındankanat arsa profili özelliğini (Şekil 4H) kullanılarak ve ardından FWHM 43.2 nm olarak hesaplanan bir Gauss uyum (Şekil 4I) sahne ImageJ (Şekil 4G) olarak süper çözünürlüklü görüntünün filamanın düz bir çizgi. Bu ölçüm denerken biz piksel boyutu (info.txt dosyası Şekil 1G bakınız) maç veya görüntü için ortalama hassas tahmini biraz daha küçük olmalıdır öneririz. Bu durumda, 16 nm bir görüntü piksel yeniden oluşturmak için kullanıldı.

İki ilgili sorunları yanıp fluorophores, aynı zamanda, yaklaşık 250 nm yanıp içinde olmayan seyrek, örneğin, ayrı moleküller olabilir ve bu nedenle, üst üste sinyalleri STORM, oluşabilir. İlk algoritması ve kullandığı kalite kontrol kriterlere bağlı olarak, yanıp söner her lokalize olabilir olmasıdır. Bu az veya hiç lokalizasyonu ile süper çözünürlük görüntüler sonuçlanır. Ikinci sorunuiki yanıp sönme tek bir göz kırpma gibi görünmesini birbirine yeterince yakın meydana geldiği mislocalizations oluşur. Bu durumda, nihai görüntüdeki konumu bu ikisinin bir ortalamasını temsil eder. Bu konuda daha fazla ayrıntı için başvuru ³² bkz. Her iki durumda da, bu örneklerin çok yüksek yoğunluklu, yetersiz lazer gücü ile veya tampon sorunlar geçiş ile oluşabilir. Aktin filamentler çok sayıda dallanma ve / veya (Şekiller 5A-D, Video 9) birbirlerine geçiş burada, bu sorun belirgindir. Kare kümelerine işleme, ve ilk ve son 5.000 kareyi karşılaştırarak tarafından farklı bir çıkan görüntü görebilirsiniz. Ilk 5.000 kareleri (Şekil 5C) kullanılarak süper çözünürlüklü görüntü biz görüntünün ortasında birçok yerleşimleri son 5000 çerçeveleri kullanırken, ancak bu çok az görülür ve biz kalır, orada olduğunu görebilirsiniz sadece filamentler, imag içinde yerleşimlerin sayısının düşük borçlu biraz kesintili de olsae (Şekil 5D). Bir çok yüksek yanıp sönme yoğunluklu şüphesi varsa çerçeve verileri başına lokalizasyonu ile görüntülerin karşılaştırılması şiddetle bu sorunun oluştuğunu önerebilirsiniz, çerçevelerin ilk kurulum sırasında son seti ile karşılaştırıldığında üzerinden 10 kare başına yerleşimlerin ortalama bir sayı var yaklaşık 4 (Şekil 5E) olan kare. Yansıması için moleküllerinin büyük bir sayıda ise örneğin, yüksek yoğunluklu numune için, bu gereklidir, her ne kadar mümkün olduğu kadar az kare başına lokalizasyonu için idealdir meydana mislocalizations olasılığını en aza indirmek için bu satın alma çok sayıda çerçeveler sürüklenme FIRTINA mikroskopi başka bir soruna yol alınmalıdır.

Drift Yanal - Aktin filamentler ve Fiducial İşaretleyiciler

Drift oluştuğunda, veri toplama aşaması ile objektif lense ilişkin olarak örnek hareket eder. Bu Durin görmek için zor veya imkansızg görüntü elde etme aşaması, tipik haliyle nispeten kararlı bir mikroskop sistemleri için birkaç dakika boyunca en az 50 nm olduğu gibi özel olarak ise, ölçülen sürece daha çok eksenel ya da yanal fazla, özellikle de. Ancak, bu tür iyi tanımlanmış bir yapıya sahip aktin filamentler olarak bilinen yapıların yeniden görüntülerde, bu süper-çözünürlüklü görüntüler olarak tespit edilebilir. Yanal sürüklenme meydana gelmiş olabilir ilk işareti yapı 67 nm ile karşılaştırıldığında, bu durumda, bir yağmur fırtınası arasındaki hassas sınır verileri ile karşılaştırıldığında, nispeten büyük bir FWHM, örneğin (Şekil 6A, Video 8) 90 nm beklenenden daha büyük olmasıdır. Ancak, drift algılamak için daha iyi bir yolu, sonraki kare lokalizasyonu erken kare olanlarla karşılaştırıldığında yerinden ise, yani görme, zamanın bir fonksiyonu olarak bölgeselleştirmelerini karşılaştırarak olduğunu. Bu, açık bir şekilde, çok küçük ve tek biçimli bir yapıya sahiptirler aktin filamentler, durumunda görülebilir zamankutu izleme özelliğini yağmur fırtınası (Şekil 6B ve 6C) kullanarak bir renk kodu ile görüntülenir.

Drift iyi tanınan bir sorundur ve ¹⁹ aza indirmek veya alım sonrası ya fiducial işaretleri ^21,43 veya çapraz-korelasyonu ⁴⁴ kullanarak düzeltmek için kullanılabilecek stratejiler vardır. Sürüklenme ve bunun için doğru ölçmek için, 100 nm çaplı floresan boncuk referans işaretleri (Şekil 6D) olarak kullanılabilir. Onlar küçük ve parlak olduğu için kendi konumunu doğru gibi yağmur fırtınası gibi Gauss uydurma algoritmaları kullanarak ölçmek olabilir. 3 dakika 10 sn boyunca yaklaşık 100 nm nispeten ciddi sapma olduğu bir örnekte, bilgi edinme aşaması (Şekil 6E) sırasında, aynı kutu izleme özelliği renk kodu için kullanılan ve (Şekil 6F, bu sürüklenme meydana teyit edilebilir .) Bu örnekte dört boncuk yakın aynı sürüklenme göstermek gibi preferans olarak kullanmak ve diğer boncuklar (Şekil 6G) gelen sürüklenme çıkarmak için, bu durumda boncuk 2 bunlardan birini seçmek için ossible. Bu daha sonra, temel yapısı bilinmeyen ya da çok daha fazla değişken bir aktin tel ya da bir floresan kordonu daha herhangi bir sürüklenme ölçülmesi ve düzeltilmesi mümkün olur ilgi konusu bir biyolojik numuneye referans işaretleri ekleyerek.

Epidermal Büyüme Faktörü

Son olarak, EGF-boyanmış HeLa hücreleri, hücreleri (Şekil 7A, Video 10) görüntü çözünürlüğü gerçekçi bir örnek vermek için kullanılabilir. Bu coverglass yakın hücre yüzeyi üzerinde düzlem-of-odak EGF-floresans çoğunluğu olmalıdır gibi bu hücreler, görüntü için nispeten doğru olan. Daha az parlak bölgesi merkezi çekirdeğin konumuna karşılık gelir. TIRF aydınlatma hücre m bölgelerinden gelen out-of-focus floresan ortadan kaldırarak görüntü kalitesini artırabilirsinizzarı böylesine cam (hücrelerine yaklaşık olarak 150 nm penetrasyon) yakınında. kırınım sınırlı görüntüde ilgi bölgelerinde Zoomed değildir (Şekil 7B ve 7C), tipik olarak silik olan, ancak süper çözünürlüklü görüntüler bir karışımı olmalıdır kümeleri ve zaman zaman izole tek bir piksel (Şekil 7D-7F). Bunlar, hücre yüzeyinde ya da spesifik olmayan bağlanma mümkün küçük bir miktarda izole edilmiş EGF reseptörleri ya da temsil edecektir. Kümeler çapı yaklaşık 100 nm olarak ve şekillendirme çukurlar ve vesiküller, EGF ağırlıklı aşağı regüle ve endocytosed olan yolu ile karşılık gelen muhtemel olacaktır. Tipik ortalama hassas tahminleri, yaklaşık 45 nm'lik bir hassasiyet limiti olan numune için bu tip yaklaşık 20 nm. Etkili çözünürlük bu hassas sınır ölçü referans işaretleri ile ölçülebilir hesap etiket boyutu, ya da herhangi bir sürüklenme, içine almaz belirtti, ama yine notic olduğunu edilmelidirkümeleri veya Şekil 6 özetlenen ve protokol bölümünde 8'de açıklandığı gibi kutu izleme özelliğini kullanarak "kuyrukluyıldız kuyrukları" tarafından Eable.

Bileşen	Final Konsantrasyon
Katalaz	1 ug / ml (50 ünite)
Glikoz	40 mg / ml
Glukoz oksidaz	50 ug / ml
Gliserin	12.50%
KCl	1.25 mM
MEA-HCl	100 mM
TCEP	200 uM
Tris	1 mM

Tablo 3. Tamponu Switching

Tipik Toplama Ayarlar	Değer
Piksel boyutu (nm)
Pozlama süresi (msn)	10
Kazanç	200
Çerçeve boyutu (piksel)	128 x 128
Çevrim süresi (fps)	52.5
Şasi numarası	10.000
640 nm lazer güç yoğunluğu (kW / cm 2)	2

160

Tablo 4.. Edinme ayarları

Şekil 1. Yağmur fırtınası kullanma FIRTINA Görüntü Oluşturma. (A) MATLAB içinde yağmur fırtınası Açılış. (B) yağmur fırtınası grafik kullanıcı arayüzü (GUI). (C) rainstorm Yorumcu GUI. (D) kontrast pencere ayarlayın. (E) inceleme ve kontrast ayarı sonra FIRTINA görüntü. (F) Hisgörüntü kalitesi ölçümleri tograms. Yorumcusu GUI görüntü düğmesi kaydet tuşuna bastıktan sonra oluşturulan (G) Dosyaları. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2.. (A) Kırınım sınırlı (DL) görüntüleri dekstran önce FIRTINA görüntüleme farklı konsantrasyonlarını göstermektedir. Süper çözünürlüğü (SR) görüntü rekonstrüksiyonlar 25 nm'lik bir piksel boyutuna sahiptir. 10.000 resim 128 x 128 piksel kare boyutu ve bireysel kare (2.000, 5.000, 8.000) bu diziden gösterilmiştir ile toplanmıştır. Saniyede 52.5 kare bir 10 milisaniye pozlama süresi ile satın aldı. Görüntü 160 nm'lik bir piksel boyutuna sahiptir. % 0.1 piksel doygunluk kontrast görüntüleme netlik için ImageJ kullanılarak uygulandı. Ortalama hassasiyettahminler 28 nm (yüksek), 24 nm (orta) ve farklı dekstran görüntüler için (düşük) 16 nm. Yerelleştirme yoğunlukları um ² (yüksek) ortalama 724 olan um ² (orta) başına 526 ve (düşük) ² um başına 13. (B) Grafik dekstran her bir konsantrasyonu üç 10000 çerçeve sekanslarının bir ortalamasını gösteren. Hata çubukları standart sapma gösteriyor. Yuvarlanan 100 kare ortalama kullanarak kare başına kabul yerleşimlerin sayısı çizilerek (C) Grafik. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Kötü kalite Dekstran Veri. 15.000 kare STORM diziden (A) Kırınım sınırlı çerçeve. Görüntünün genelinde yaygın floresan pus unutmayın. Bu fluoropho kaynaklanır res vasıtasıyla difüzyon. 128 x 128 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare satın aldı. (B) tampon sonra, (A) ile aynı şekilde değiştirildi. Ilişkisiz flüoroforlar uzak yıkanmış olarak geliştirilmiş kontrast unutmayın. (C) (A) toplanan verilere karşılık gelen bir süper-çözünürlüklü görüntü oluşturma. Özdeş görüntü boyutu ama 25 nm piksel. Ortalama hassas tahmini 35 nm. (D) (B) toplanan verilere karşılık gelen bir süper-çözünürlüklü görüntü oluşturma. Özdeş görüntü boyutu ama 25 nm piksel. Ortalama hassas tahmini 30 nm. (E) Grafik yuvarlanan 100 kare ortalama kullanarak, kare başına kabul yerleşimlerin sayısını komplo. Kırmızı çizgi yüksek bir arka plan bulunmaktadır STORM dizisi (A ve C) karşılık gelir. Mavi çizgi plan düşüktür (Yatak & D), karşılık gelen verileri gösterir. Yüksek karşılık görüntüler için kabul yerelleştirme sayısını gösteren (F) Grafik (C) ve düşük (D) arka plan veri.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4. Tipik Aktin Veri. Önce tampon ve FIRTINA görüntüleme anahtarlama eklenmesinden aktin filamentler (AC) Kırınım sınırlı görüntüler. Filaman Değişken uzunlukları görülebilir. Çok parlak filamentler sık ​​birlikte karışık çeşitli iplikçiklerdir. Piksel boyutu 160 nm. (D), tek bir aktin filamanın bir kırınım sınırlı görüntüsü. (E) STORM görüntü (ImageJ uygulanan% 0.1 kontrast). 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisinden. Piksel boyutu 16 nm. Ortalama hassas tahmini 16 nm. (F) Grafik kabul lokalizasyonu sayısı çizilerekyuvarlanan 100 kare ortalama kullanarak kare başına s. Boyunca çizilen bir sarı çizgi profili ile kontrast geliştirme önce (E) aktin filamanın bölgesinde yakınlaştırılmış (G) A. (H) aktin ipliği boyunca çizilen sarı çizgiden bir arsa profil görünümü. ImageJ oluşturuldu. (I) ImageJ eğri uydurma aracı kullanılarak arsa profilinin bir Gauss uyum sağlar. Standart sapma, d, 43.2 nm FWHM ölçüm almak için 2,35 ile çarpılarak. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. Mislocalized Aktin Filaments. (A) Kırınım-sınırlı aktin filament. 160 nm piksel. (A) 'da gösterilen aktin filamanın (B) STORM image. 128 x 128 piksel Fram ile 20.000 kare dizisindene boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare satın aldı. FIRTINA piksel boyutu 16 nm. Tüm 20000 çerçeveler işlenmiştir. Ortalama hassas tahmini 17 nm. (B) olarak, ancak işlenmiş olan 20.000 çerçeve dizisinin sadece ilk 5000 çerçeveli (C). Ortalama hassasiyet tahmini 18 nm'dir. (D) (B) olarak, ancak işlenmiş olan 20.000 çerçeve dizinin sadece son 5.000 kare. Ortalama hassas tahmini 17 nm. Tam 128 x 128 piksel kare görünümünde çerçeve verileri başına yerleşimlerin (E) Grafik.

Şekil 6,. Drift yanal., 64 x 64 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 64.6 kare ile alındığını 10.000 çerçeve dizisinden yeniden bir aktin filamanın (A) STORM görüntü. FIRTINA piksel boyutu 32 nm. Ortalama hassas tahmini32 nm. (B) A STORM görüntü 'Kutu İzleme' özelliğini yağmur fırtınası kullanılarak görüntülenir. Lokalizasyonlarına edinildiğini ne zaman kare sayısına karşılık gelen bir renkle gösterilir, örneğin, erken satın alma sırası gelen lokalizasyonu mavi, geç elde etme sırası gelen lokalizasyonu kırmızı. Yerinden renkler sürüklenme meydana geldiğini göstermektedir. (C) (A) bölgesinde yakınlaştırılmış Box Takip özelliğini yağmur fırtınası kullanılarak görüntülenir. Yerinden renkler sürüklenme oluştu gösterir. (D) referans işaretleri olarak kullanılabilir, dört 100 nm flüoresan boncuklar bir kırılma kısıtlı görüntü. Piksel boyutu 160 nm. Sayılar 1-4 gösteri kırpılmış ve ayrı ayrı boncuk yakınlaştırılmış. (E) 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisinin gelen yağmur fırtınası yeniden (D) karşılık her floresan boncuk. FIRTINA piksel büyüklüğü 5 nm. Ortalama hassas tahmini 7 nm. (F) (D) 'ye karşılık gelen boncuk ve (E),'Kutu İzleme' özelliğini kullanarak görüntülenir. Yerinden renkler sürüklenme oluştu gösterir. (G) sayısı 2 kordon kullanarak referans olarak, boncuklar 1, 3 ve 4 'Çıkart Drift' özelliği sonra gösterildi yağmur fırtınası kullanılır. (E) ile karşılaştırması yanal sürüklenme düzeltilmiş olduğunu göstermektedir. FIRTINA piksel büyüklüğü 5 nm. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7. Tipik EGF veriler. Bazal hücre yüzeyinde odaklı bir HeLa hücresinin bir kısmının (A) sınırlıdır kırınım görüntüsü. Sarı kutular (B) 'de gösterilen ilgi bölgelerde yakınlaştırılmış göstermektedir & (C). (B), hücre (kutu B) kenarına yakın bölgedeki kırılma kısıtlı görüntü Zoomed. (C) sınırlı kırınımında Zoomed Çekirdeğin (kutu ° C) altında bölgesinden görüntüsü. (D) 'e uygun STORM görüntüsü (A). 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisinden. FIRTINA piksel boyutu 25 nm. Ortalama hassas tahmini 21 nm. (E) E (D) kutusuna karşılık FIRTINA görüntü. (F) F (D) kutusuna karşılık FIRTINA görüntü. (D) frame veri başına (G) Yerleşimleri. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

. Videolar 1-4 Videolar değişen dekstran konsantrasyonları ile 2A Şekil karşılık: 1 = yüksek, 2 = orta, 3 = düşük, 4 = hiçbiri). Saniyede 52.5 kare bir 10 milisaniye pozlama süresi ile edinilen 128 x 128 piksel kare boyutları ile 10.000 çerçeve dizileri. videoyu 1 görmek için buraya tıklayın ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> Video 2 Video 3 , Video 4

Videolar 5-6. Videoları 3 A & B video 5 Şekil karşılık ilişkisiz flüoroforlar çıkarıldıktan sonra ön yıkama ve video 6 yıkama sonrası olmasıdır. 128 x 128 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen kullanarak 15.000 kare dizileri. Videoyu 5. görmek için buraya tıklayın , videoyu 6 .

Video 7. Video Şekil 4E STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kare dizisini gösteren. 10.000 kare seque128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile nce. Videoyu 7. görmek için buraya tıklayın .

Video 8. Video Şekil 5B STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kare dizisini gösteren. 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 20.000 kare dizisi. Videoyu 8. görmek için buraya tıklayın .

Video 9. Video Şekil 6A'da STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kayıt birimi dizisini gösteren. 64 x 64 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 64.6 kare alınır. 10.000 kare dizisi CLIBurada ck videoyu 9 görüntülemek için.

Video 10. Şekil 7D STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kare dizisini gösteren video. 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisi. Videoyu 10. görüntülemek için buraya tıklayın .

Discussion

Biz bazı basit test örnekleri ve STORM süper çözünürlük görüntüleme optimize etmek mümkündür özgürce kullanılabilir işleme yazılımı yağmur fırtınası ile göstermektedir. Bu araçlar ve yöntemler yeni kullanıcılar ve mikroskoplar güven ve görülmemiş detaylar biyolojik ve hücresel yapıları incelemek için bunların kullanımını artırmak için deneyimli kullanıcılar için yollar için yararlı başlangıç ​​noktaları sağlayacaktır. Bu görüntü kalitesini iyileştirmek ve daha fazla güven olması mümkündür gösteren bu tür ortalama hassas tahminler, yerelleştirme numarası ve histogramlar olarak yararlı bir görüntü kalitesi ölçümleri bir dizi üretebilir, bilinen ya da iyi anlaşılmış yapıları ve algoritma ile numunelerin bir arada kullanarak STORM görüntüleme işleminde. Kimse-boyut kullanılabilir farklı ticari ve kendini inşa mikroskop yapılandırmaları bir dizi olduğu gibi verileri elde etmek, tüm yaklaşım uyar vardır. Üstelik şekilde etkilenir birçok örnek hazırlama ve görüntü alma adımlar vardırson görüntü bu nedenle yazılım araçları ve test örneklerine sahip anlayış ve FIRTINA görüntü kalitesini optimize etmek önemlidir yaşamaktadırlar.

Ayrıca bu protokoller ortaya çıkabilecek sorunları giderme kullanışlı ve daha az belirsiz yollar sağlayabilir. Örneğin dekstran örnek, herhangi bir lazer ışını kayma veya numunenin dengesiz aydınlatma var olup olmadığını belirlemek için çok kullanışlı bir yoldur. Anahtarlama tampon herhangi bir 'yanıp sönen' yardımcı olacak olup olmadığını görmek için çok basit bir görsel testi çalışmıyor olabilir ki endişeler varsa. Aktin filamentleri FWHM karşılaştırmalar kullanarak yanı sıra sürüklenme ve mislocalization eserler vurgulayarak çözünürlük ölçmek yararlı bir yoludur. Ancak, lokalizasyon tabanlı süper-çözünürlük yöntemleri gibi pozlama süreleri, çerçeve oranları, lazer güçler ve görüntü işlenir yolu olarak katkıda bulunan diğer faktörler, rağmen, duyarlı fluoroforun yoğunluk olabileceği unutulmamalıdır, bu atamak mümkün değildir Bir bir çözünürlükÖzellikle mikroskop ve tüm görüntüleri bu çözünürlüğe sahip olacağını varsayabiliriz. Ne mümkün, ancak bu tür ortalama yerelleştirme kesinleşmemiş, yerelleştirme numarası gibi çözünürlük çeşitli yönlerini ölçmek ve ²⁷ sürüklenmeye olduğunu. Fiducial belirteçler onlar her deneyde dahil olamaz bile, en azından, bir mikroskop sistemi, çevresini karakterize ve daha iyi gibi çok zaman sonra başlatmak termal dengeye ulaşması için gerekli ne gibi operasyonel konuları anlamak için kullanılabilir. Bu görüntüler ⁴³ satın ediliyor iken örnek konumunu düzeltmek için bir astigmat lens kullanımı ve bir geri besleme mekanizması gerektirir rağmen yanı sıra yanal sürüklenme için düzeltme olarak, referans işaretleri, karakterize etmek için kullanılan ve eksenel sürüklenme için doğru olabilir. Ticari süper çözünürlük sistemleri genellikle stabilite kontrolü veya odak kayması düzeltmek için daha pratik bir çözüm olabilir odak-kilit mekanizması, çeşit içerecektir.

Orada birspesifik olmayan bu tür boyalar, doğrudan ya da sekonder antikor olarak başka bir konjugat moleküllerin kullanılarak dekstran, ile cam kaplama alternatif re. Bu yaklaşımların bir sınırlama cama bağlı moleküllerinin sayısı bilinmemektedir olmasıdır. Kullanılmıştır alternatif lifli yapıları mikrotübülleri ²⁸ ve DNA ²¹ içerir. Ancak, çok küçük boyutlu ve kolay bir ticari olarak temin edilebilen reaktifler kombinasyonu farklılaştı ya da kollara ayrılmış filamentlerin ayırma mesafesi de ²⁷ sistem performansı yararlı bir ölçüm olabilir özellikle, çekici bir alternatif aktin olun.

Test örneklerinin daha da geliştirilmesi için oda bu alanda ^28,29,46,47 son ilerlemelere rağmen, var. Özellikle, çok renkli görüntüleme bir görüntüleme 3 ana açıdan zorluklar sayıda örnek etiketleme, görüntü alma (donanım) ve yazılım (görüntü işleme ve hizalama) sunuyor. Bir olmuşturyayınlarda bu yönlerini ^4-6 adresleme ve uygun test örnekleri ve metodolojileri görüntülerin bu tür üreten ve güvenilir bir yorumlama için kritik olan bu nedenle açıktır bir dizi. Nitekim, son zamanlarda dSTORM iki renkli görüntüler almak ve çözümlemek, nükleer gözenek kompleksinin son derece simetrik doğa için kullanılan olabilir ve yazarlar bu renk sapmaları düzeltmeler ⁴⁵ performansını değerlendirmek için ideal bir yol olacağını önerdi gösterilmiştir. Bir başka ilginç yaklaşım dışında ⁴⁶ özel alt-kırılma mesafelerde konumlandırma Flüoroforlann olasılığını yaratan bir nanoruler oluşturmak için DNA origami kullanılmasıdır. Bu çözünürlük değerlendirilmesi ve mesafe ölçümleri yapmak bir yol sağlar. Ancak, nihai amacı karmaşık üç boyutlu yapılardır gibi hücreleri gibi olmayan idealize örneklerinin, bu süper-çözünürlük tekniklerini uygulamaktır. Bu durumda, bir t daha kapsamlı bir anlayış bir aradaO, veri edinme uygun şekillerde işlenmesi ve görüntü ölçümleri sağlayan kullanıcı yardım yazılım araçları ile kombine teknik nihai cevabı olması muhtemeldir. ^28,29,47,48

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Görüntüleme odası camı	Fisher	CBR-166-390E	Numune hazırlama
Ters Mikroskop	Olympus	IX71	* Alternatifler için aşağıya bakın
100 X TIRF Objektif Lensi	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* Alternatifler için aşağıya bakın
EMCCD Kamera	Andor	iXon 897	* Alternatifler için aşağıya bakın
640 nm lazer	Toptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - Alexa 647 veya Cy5 boyalarını görüntülemek için
LabVIEW	National Instruments		*Edinme yazılımı (kontrol donanımı)
PC	Dell		Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Cihaz kontrolü ve görüntü işleme
ImageJ			Görüntü analizi ve işleme http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM	Laser Analytics Group (Cambridge) software		http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Kendi kendine yapılan STORM/PALM mikroskop			Ayrıca referans 29'a bakın http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Ticari STORM/PALM süper çözünürlüklü mikroskoplar			Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Yerelleştirme) Kendi kendine yapılan mikroskoplara alternatifler
Tablo 1. Malzemeler & Ekipman
[başlık]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poli-L-Lizin	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dekstran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
Genel aktin tamponu	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Önceden şekillendirilmiş aktin filamentleri	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Phallodin-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
TetraSpeck Mikroküreler (0.1 mikron)	Invitrogen	T-7279	3.1
HeLa hücreleri	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Kalem / Adım	Canlandırıcı	15070063	4.1
Plastik tabaklar	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldehit -% 10 çözelti EM sınıfı	Polysciences	04018-1	4.2
Katalaz	Sigma	C100	5.1
Glikoz oksidaz	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glikoz	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Gliserin	Sigma	G2289	5.1; 5.2
Tablo 2. Reaktifler