Yöntem makalesi

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

DOI:

10.3791/50585

⸱

26 Eylül 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2001 yılında, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles, araştırmacılar başlangıçta İşlenmiş Lipoaspirate Hücreleri veya PLA hücreleri adı liposuctioned adipoz dokudan erişkin kök hücrelerinin yeni bir nüfus izolasyonunu nitelendirdi. O zamandan beri, bu kök hücreler Yağ elde edilen kök hücreler ya da TSK olarak yeniden adlandırılmış ve kök hücre araştırma ve rejeneratif tıp alanında en popüler yetişkin kök hücreler nüfus biri olmaya gitti. Binlerce makale artık kemik rejenerasyonu, periferik sinir onarımı ve kardiyovasküler mühendisliği de dahil olmak üzere, rejeneratif hayvan modellerinde çeşitli TSK kullanımını tarif eder. Yeni makaleler klinikte TSK için kullandığı sayısız tarif başladı. Bu makalede gösterilen protokol elle ve enzimatik kozmetik işlemler elde lipoaspirates büyük miktarda gelen TSK izole etmek için temel prosedür özetliyor. Bu protokol kolayca ölçekli veya accommod aşağı olabilirlipoaspirate hacmini yedi ve abdominoplasties ve benzer prosedürler ile elde edilen yağ dokusundan TSK ve izole etmek için uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2001 yılında, adipoz dokusundan multipotent kök hücrelerin farazi bir nüfus dergisinde Tissue Engineering 1 'de tarif edilmiştir. Bu hücreler kozmetik cerrahi yoluyla elde edilen işlenmiş lipoaspirate dokudan kendi türetme nedeniyle adı İşlenmiş Lipoaspirate ya da PLA hücreleri verildi. Bu makalede açıklanan izolasyon yöntemi yağ dokusu 2 stromal damar fraksiyon (SVF) izolasyonu için mevcut enzimatik stratejiler dayanıyordu. SVF, bir doku kültürü alt-tabaka 2, 3 uymak için henüz kırmızı kan hücreleri, fibroblastlar, endotelial hücreler, yumuşak kas hücreleri, perisitler ve ön adipositlerin minimal işleme nüfus olarak tanımlanmıştır. Zaman içinde bu SVF ekimi, bu kirletici hücre popülasyonlarının çok ortadan kaldırmak ve bir yapışkan, fibroblastik nüfus neden önerilmiştir. Bu fibroblastlar ön-varlık olarak son 40 yıldır literatürde tespit edilmiştiradipositleri. Ancak, araştırma grubu, bu hücrelerin mezodermal multipotency sahipti ve PLA hücreleri gibi yapışık SVF nüfusu adını gösterdi. Çok sayıda diğer araştırma grupları tarafından daha sonraki çalışmalar (yorum 4 görmek için) Endodermal ve ektodermal potansiyellerini hem düşündüren, bu potansiyeli ekledik. O zamandan beri, bu hücreler için çok sayıda ek şartlar literatürde ortaya çıktı. Uzlaşma çeşit sağlamak amacıyla, vadeli Yağ türetilmiş Kök Hücreler veya TSK 2. yıllık IFATS toplantısında kabul edildi. Bu nedenle, bu terim ASC bu makalede kullanılacaktır.

Bu makalede açıklanan protokol standart laboratuar ekipmanı gerektirir ve bu fosfo-tamponlu tuz çözeltisi, standart doku kültür ortamı reaktifler ve kolajenaz gibi basit bir reaktif kullanan bir nispeten basit bir işlemdir. Bu yağ dokusu hacim ve daha sonra c başlangıç ​​miktarına bağlı olarak TSK çok sayıda üretebilirulture zaman. Ancak, yağ dokusu gibi bir büyük miktarda işlem bu protokolü kullanarak bir dereceye kadar azaltılabilir bazı fiziksel sorunlar ortaya çıkabilir. Ayrıca, bu protokol bu şekilde onaylı bir doku kültürü imkan kullanımını gerektiren, steril doku kültürü tesisleri ve onaylanmış biyo-güvenlik davlumbaz gerektirir. Bunlar iyi üretim uygulamaları klinik kullanım için izolasyonu ve genleşme için tasarlanmış (GMP) onaylı tesisleri izole sürece Bu gereksinim, klinik uygulamalarda ASC nüfusun yarar azaltabilir. Alternatif olarak, işletme tiyatro, kapalı bir sistem içinde TSK ayırabilirsiniz otomatik sistemler bu tuş sorunu önleyeceğini ve sonraki in vitro genişlemesi için herhangi bir ihtiyaç olmaksızın TSK hemen kullanımı için izin verir. Bugüne kadar, insan dokusundan hücrelerinin izole edilmesi için ticari olarak temin edilen altı otomatik sistemleri vardır. Bu sistemler sayesinde izole etmek için yapabilirderhal hasadından sonra adipoz doku büyük miktarda gelen TSK önemli sayıda. Bunlar TSK her zamankinden çalışma odasını terk etmek zorunda hasta olmadan rejeneratif çeşitli amaçlar için hastaya geri olabilir. TSK manuel izole açıklayan bu protokol ek olarak, Celution Sistemi kullanılarak TSK otomatik izolasyonu için protokol, eşlik eden bir makalede verilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gösterilen protokol enzimatik sindirim ve diferansiyel santrifüj kullanılarak kozmetik prosedürler ile elde lipoaspirates gelen TSK manuel izole edilmesini tarif etmektedir. Bu protokol ilk olarak 2001 1'de dergi Doku Mühendisliği yayımlandı nerede çıkan hücreler nedeniyle lipoaspirates kendi tecrit İşlenmiş Lipoaspirate Hücreleri veya PLA hücreleri çağrıldı. Bununla birlikte, terim PLA hücre artık terimi Yağ türetilmiş Kök Hücreler veya saha isimlendirme açısından uygunluk çeşit vermek TSK ile değiştirilmiştir. Bu protokol ile izole hücreler (inceleme için bkz: 4) in vitro ve in vivo olarak mezodermal potansiyele sahip olduğu birçok kişi tarafından gösterilmiştir. Buna ek olarak, ASC ektodermal ve Endodermal potansiyelleri de 4 araştırılmıştır. Izolasyon tekniği basit ve kolaydır ve tamamlamak için yaklaşık bir saat gerektirir. Elde edilen hücres, standart doku kültür koşulları altında kültürlenir. Kültür Zamanla, ASC nüfusu daha homojen kolay genişletmek ve kültür uzun vadede iyi canlılığı göstermek fibroblastik hücrelerden oluşan olur.

Not: Gerekli olan ekipman aşağıdaki parçaları, bu makalenin sonunda listelenmiştir. Tüm cam, medya ve reaktifler otoklav yoluyla sterilize veya 0.22 mikron filtreler aracılığıyla filtre edilmelidir. Aseptik doku kültürü teknikleri her zaman takip edilmelidir. Bunu sağlamak için, biyo-güvenlik kabini içine yerleştirilmiştir tüm malzeme,% 70 etanol çözeltisi ile püskürtme ve temiz bir kağıt havlu ile silinerek sterilize edilmelidir.

1.. Hasattan önce, ardından hazırlayın:

  1. Lipoaspirates yıkama için steril 1X fosfo-tamponlu tuzlu su (PBS). Lipoaspirate her 100 ml için 1 x PBS içinde yaklaşık olarak 1 L hazırlayın. PBS ve otoklavkullanmadan önce oda sıcaklığına soğumaya ow. Bir seçenek olarak, antibiyotik / antimikotik lik bir son konsantrasyona kadar ilave edilebilir: 100 IU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 2.50 ug / ml amfoterisin B PBS soğuduktan sonra.
  2. Lipoaspirate enzimatik sindirim için (Clostridium histolyticum'dan) Steril 0,075-0,1% kollajenaz tip IA. Arıtılmış, yani ham vs - Konsantrasyon kolajenaz kalitesine ve kaynak bağlıdır. Diğer kolajenaz türleri (örneğin kollajen tip II ya da IV) 'e benzer konsantrasyonlarda kullanılabilmektedir. 0.22 um bir filtre ile bir 1.000 ml filtreleme sistemi (Şekil 1 A) kullanılarak 1 x PBS ve steril filtre hazırlayın. Bununla birlikte, şişe üst filtre takılmış steril cam şişeler de kullanılabilir. Hazırlamak ve oda sıcaklığında kullanın. Kadar gerekli Kolajenaz çözümleri 4 ° C'de kısa süreli saklanabilir. Onun aktivitesini azaltmak olabilir kollajenaz çözüm donma yok.
  3. Kolajenaz inaktivasyonu ve ASC nüfusun kültür için steril kontrol ortamı (CM). CM 500 ml için, kombine aşağıdaki gibidir: 50 ml cenin sığır serumu (ısı ile deaktive edilmiş), 5 ml penisilin / streptomisin (10,000 IU penisilin, 10,000 ug / ml 500 ml DMEM (L-glutamin ile 4.5 g / L glukoz,), streptomisin). Bir seçenek olarak, 5 ml amfoterisin B (250 ug / ml amfoterisin B) de ilave edilebilir. Steril olmayan reaktifler kullanılır, bu ortamın steril filtrasyon gereklidir. Orta ısıtmak için kullanılmadan önce 37 ° C su banyosu, 30 dakika içinde CM yerleştirin.
  4. Izolasyon için steril cam ve plasticware. 1000 ml'lik bir cam beher otoklav ve kullanılmadan önce oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Buna ek olarak, aşağıdaki plasticware hazır: aseptik serolojik pipetler (5 mi, 10 ml ve 25 mi), 50 ml santrifüj tüplerine ve doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kaplarına.

2. L TSK İzolasyonuipoaspirates

En lipoaspirates bir aspirasyon kabın (Şekil 1B'ye bakınız) toplanır ve üç ayrı tabakadan oluşmaktadır edilebilir: dolayı olgun adipositlerin lizis petrol 1) bir üst tabaka, yağ dokusunun 2), bir orta tabaka, ve 3) bir alt, sıvı infranatan tuzlu su ihtiva eden ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) gibi hücre tipleri kirletici. Üst yağ tabakası önemli miktarlarda mevcut olmayabilir. Mevcut olduğu takdirde, elde edilen ASC kültürün yağ kirlenmesi kültürünün canlılığı etkileyebilir gibi, aspire edilmelidir. Alt infranatan RBCs ile ASC kültürlerin kirlenmesini en aza indirmek için işlemeden önce çıkarılmalıdır. Bu daha sonra yıkanır ve enzimatik hücresel, stromal vasküler fraksiyonun (SVF) kurtarmak için sindirilmiş olacak orta, adipoz doku tabakası, bırakacaktır.

  1. Lipoaspirate Yıkama: doku kültürü h lipoaspirate kabı açınood ve dikkatli bir şekilde, steril 1 L cam behere lipoaspirate süzün. Adipoz doku tabakası da (Şekil 1 B) ayrılır kadar lipoaspirate tabakaları ayırmak için izin verin.
    1. 10 ml serolojik pipet kullanarak steril bir cam pipet ile, alt tuzlu infranatan kullanılarak yağ tabakasının (eğer varsa) aspire. Bu kırmızı kan hücreleri ve tuzlu su kirlenmesine büyük çoğunluğu kaldırmak olacaktır.
    2. Elde edilen yağ dokusu katmanının hacmi değerlendirmek ve eşit hacimde steril 1x PBS ilave edin. PBS ile lipoaspirate karıştırmak için aspirasyon için kullanılan bir pipet ile aspire karıştırın. Iki kat yerleşmek için izin verin. Yukarıda belirtildiği gibi, 1x PBS antibiyotik / antimikotik ile takviye edilebilir.
    3. 10 ml serolojik pipet kullanarak infranatan aspire.
    4. Adımda 2.1.2 'de belirtildiği gibi adipoz doku fraksiyonu yıkama devam edin. ve 2.1.3. yağ tabakası sarı / altın rengi alana kadar. Aspire incie cam beher içinde yağ dokusu fraksiyonun ayrılması, son bir kez infranatan. Infranatanların yeterli kaldırılmasını sağlamak için, lipoaspirate tabakalar Son yıkamadan sonra ve son aspirasyon önce 5 dakika için yerleşmesine izin.
  2. Lipoaspirate enzimatik sindirim: bir filtre ünitesi de, yukarıda belirtildiği gibi, steril kolajenaz 1A çözeltisi hazırlayın. Yağ fraksiyonu ve steril filtre eşit bir hacmini hazırlayın.
    1. Kolajenaz çözeltisi Süzüldükten sonra, üst filtre ünitesini atmak dikkatli bir kolajenaz çözeltisi içine yıkandı, yağ fraksiyonu dökün ve şişeyi sıkıca kapatın.
    2. Bir 37 ° C su banyosu içinde kolajenaz / yağ karışımı yerleştirin ve 30 dakika boyunca 37 ° C 'de özet. Yavaşça kollajenaz / yağ karışımını her 5-10 dk girdap ve su banyosunda geri yerleştirin. Adipoz doku tabakası "yumuşak" bir görünüm (Figür almalıdıre 1B) sindirim ilerledikçe. Adipoz doku tabakası hala içinde yağ katı parçaları var gibi görünüyor, ek sindirim süreleri (yani 2 saat kadar) kullanılabilir.
  3. TSK İzolasyonu: geri biyogüvenlik kabini içine yerleştirin sindirilmiş kollajenaz / yağ karışımı. Önceki kabinede geri yerleştirerek% 70 etanol ile filtre ünitesini sterilize etmek için emin olun.
    1. Pipet 25 ml steril bir 50 ml santrifüj tüplerine SVF içeren infranatanların alikotları.
    2. Her tüpe CM 25 ml ilave edilir. CM 5 dakika için kabininde oda sıcaklığında inkübe edilerek inaktive kolajenaz izin verin.
    3. Bir pelet gibi SVF toplamak için 1200 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. Biyogüvenlik kabini, her tüpten aspire. (Üst yağ tabakası sağlamak ve herhangi bir kayan adipozitler bu yüzer ile aspire edilir Şekil 1 B).
    5. 30 ml CM kullanılarak bir santrifüj tüpü içine SVF pelet birleştirin ve iki yeni bir 50 ml santrifüj tüplerine üzerinde eşit olarak bölünür. Adım 2.3.3 olarak santrifüj. ve (şekilde gösterilmemiş olan) iki SVF peletlerden süpernatantlar aspire.
      İSTEĞE BAĞLI: RBC parçalama arzu edilirse, bir RBC liziz tamponu (160 mM NH4CI), 10 ml her SVF pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Adım 2.3.3 olarak santrifüj. ve (şekilde gösterilmemiş olan) SVF granül elde etmek üzere üst fazlar aspire.
    6. 5-10 ml CM (Şekil 1B) kullanılarak yeni bir santrifüj tüpü içine, iki SVF granül birleştirin.
    7. Daha büyük partikülleri filtre doku için, yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne üstüne yerleştirilen bir 100 mikron gözenekli filtre üzerine yeniden süspansiyon haline SVF pelet pipet ve yerçekimi akışı ile filtre izin verir.
    8. Yeniden süspansiyon haline Pipet alikotları(Ve filtre) doku kültürü tedavi kültür yemekleri üzerine TSK içeren SVF pelet. CM uygun bir hacmi ile her yemeğin Supplement.
    9. Kültür, 37 ° C, ortam değişikliği olmadan% 5 CO2 3-4 gün boyunca CM hücreler.

Bu ilk kültür periyodu sonrasında, kültür ortamı aspire edilebilir ve herhangi bir kirletici kırmızı kan hücreleri yavaşça steril 1XPBS ile yıkanarak uzaklaştırılmıştır. CM ile değiştirin ve gerektiği gibi kültür TSK devam ediyor. Doku kültürü el çanak ve nasıl yeniden süspansiyon haline SVF topak bu yemekler arasında bölünür ve tip geleneksel doku kültürü, aşağıdaki arzu edilen hücre sayısına bağlıdır.

3. ASC Nüfus Karakterizasyonu: Sitometrisi ve multilineage Farklılaşma

Bir kez izole edilmiş, ASC nüfusun karakterizasyonu yapılmalıdır. Bunun için geleneksel yaklaşımlar akış sitokin içerirmetry hücrelerin hücre yüzeyi antijeni, CD profilini karakterize etmek için in vitro ve farklılaşmasında da multilineage farklılaşma kapasitesi teyit etmek için. Birden fazla soy TSK değerlendirilebilir birlikte, bu protokol multilineage mezodermal potansiyellerini teyit 5 bir aracı olarak adipogenic, osteojenik ve kondrojenik soy hücreleri içine TSK farklılaşmasını özetlenmektedir.

TSK vitro çoklu-soy Farklılaşma

  1. TSK osteojenik Farklılaşma aşağıdaki gibidir: Önceki indüksiyonuna, osteojenik Ortamını (OM) hazırlanması: DMEM, bir 500 ml şişe için, (4.5 g / ml glikoz) penisilin / streptomisin 25.0 FBS (% 5.0 son konsantrasyon) içinde ml ve 5.0 ml eklemek (10,000 IU / sırasıyla ml ve 10000 mg / ml nihai konsantrasyonlar). Deksametazon (0.1 uM nihai), L-askorbik asit 2-fosfat (50.0 uM nihai: Bunun için, belirtilen son konsantrasyonları vermek üzere aşağıdaki osteojenik indüksiyon maddeleri eklemek) Ve β-gliserofosfat (nihai 10.0 mM).
    1. Öncesinde, indüksiyon hasat ve yaklaşık% 50 bir katışma elde edilir ve böylece arzu edilen doku kültürü kabı içine kültürlü TSK plaka. Her deneysel yemeğin kaplama için, uyarılmamış kontrol için ilave bir çanak levha. CM Kültür gecede.
      Not:% 50 confluency bu indüksiyon boyunca oluşabilecek sürekli yayılması için izin vermek için önerilir
    2. Indüksiyon gününde, orta kaldırmak ve şunları ekleyin: kontrol oyuklarına istenen osteojenik deneysel kuyu ve CM OM. Kullanılan ortamın hacmi doku kültürü çanağı boyutuna bağlı olacaktır. 12 de yemekler için, oyuk başına ortam içinde 1.0 ml yeterlidir. 6 bölmeli tepsilerde için, oyuk başına 2.0 ml ortam yeterlidir. 100 mm yemekler için, çanak başına ortam içinde 10.0 ml kullanılmalıdır.
    3. Uygun ortam değişiklikleri her 3-4 ile 14 gün, en az Kültür hücrelergün. Yüksek osteojenik ASC popülasyonları gibi erken 7 gün indüksiyon gibi hücre dışı mineral birikimi belirtileri gösterebilir.
    4. Osteojenik farklılaşma (yani hücre dışı mineral birikimi) kalsiyum fosfat için bir von Kossa histolojik leke kullanılarak teyit edilebilir. Bu leke hücre dışı kalsiyum fosfat (Şekil 2 ye bakınız) varlığını belirleyen bir siyah-kahverengi bir çökelti üretecektir.
      Von Kossa bir reaktif ile leke için:
      1. Kontrol hücrelerinden deney hücrelerden OM ve CM kaldırma
      2. 1x PBS içinde hazırlanmış% 4.0 paraformaldehid içinde 60 dakika boyunca hücreleri saptamak.
      3. 1x PBS ile hücreler iki kez yıkayın.
      4. 30 dakika boyunca karanlıkta (su içinde hazırlandı),% 2.0 gümüş nitrat ile hücreleri inkübe edin.
      5. Gümüş nitrat çıkarın, damıtılmış su ve hava ile kurumaya hücreleri ile iki kez yıkayın.
      6. CAL geliştirmek için 60 dakika boyunca UV ışığına hücreleri Açığakalsiyum veya magnezyum fosfat çökelti.
      7. 1XPBS ile hücreleri birkaç kez yıkayın.
      8. Arzu edildiği takdirde hematoksilin ile hücre Counterstain.
  1. TSK adipojenik Farklılaşması: Ön indüksiyon, aşağıdaki gibi adipojenik Ortamını (AM) hazırlanması: (4.5 g / ml glikoz) (% 10.0 nihai konsantrasyon) FBS 50.0 ml eklemek DMEM biri 500 ml şişe için, ve penisilin / streptomisin, 5.0 mi (10,000 IU / sırasıyla ml ve 10,000 ug / ml nihai konsantrasyonlar). -, Indometasin (nihai 0.2 mM) ve insülin (10.0 uM nihai deksametason (1.0 uM nihai), 3-izobutil-1-metilksantin (nihai 0.5 mM IBMX): Bunun için, belirtilen son konsantrasyonları vermek üzere aşağıdaki adipogenic indüksiyon maddeleri eklemek .)
    1. Öncesinde, indüksiyon hasat ve yaklaşık% 80 lik bir katışma elde edilir ve böylece arzu edilen doku kültürü kabı içine kültürlü TSK plaka. Her deneysel yemeğin kaplama için, bir ek plakaolmayan bir kaynaklı kontrolü için çanak al. . Kültür gecede CM Not: TSK adipogenic farklılaşma artan kaynaşması olan daha verimli olduğu görülmektedir.
    2. Indüksiyon gününde, orta kaldırmak ve şunları ekleyin: kontrol oyuklarına istenen osteojenik deneysel kuyu ve CM AM. Kullanılan ortamın hacmi doku kültürü çanağı boyutuna bağlı olacaktır. 12 de yemekler için, oyuk başına ortam 1.0.ml yeterlidir. 6 bölmeli tepsilerde için, oyuk başına 2.0 ml ortam yeterlidir. 100 mm yemekler için, çanak başına ortam içinde 10.0 ml kullanılmalıdır.
    3. Kültür uygun bir ortam değişiklikleri her 3-4 gün ile 14 gün arasında, en az hücreler. Son derece adipogenic ASC popülasyonları gibi erken 7 gün indüksiyon gibi lipit boşluk oluşumuna belirtileri gösterebilir.
    4. Adipogenic farklılaşma geçiren TSK kolayca ışık mikroskobu altında görüntülendi olabilir birden fazla lipit vakuollere gelişecektir. Buna ek olarak, adipojenik farklılaşma may(bkz. Şekil 2) Bu vakuollerde birikir bir Oil Red O histolojik leke kullanılarak teyit edilecektir.
      Oil Red O ile leke:
      1. Deney ve kontrol hücreleri ortamı çıkarın ve% 10 resmi kalsiyum Fiksatif kullanarak 60 dakika boyunca onları düzeltmek. Bu fiksatif hazırlamak için, aşağıdaki bir araya: CaCI2 1.0 g, 25.0 ml% 16 paraformaldehit (% 4.0 nihai) ve 75.0 ml damıtılmış su.
      2. 1x PBS ile hücreler iki kez yıkayın.
      3. % 70 etanol ile kısa bir süre hücreleri yıkayın.
      4. Yağ Kırmızı O solüsyonu, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe hücreleri. Yağ Kırmızı O solüsyonu hazırlamak için, 50.0 ml% 70 etanol içinde 2.0 g, Yağ Kırmızı O toz ve 50.0 ml aseton içinde çözülür.
      5. Musluk suyu ile% 70 etanol ile ve daha sonra hücreleri yıkayın.
      6. Yakında nedeniyle zamanla leke solmaya boyandıktan sonra hücrelerin görselleştirmek.
  1. TSK kondrojenik Farklılaşması: kondrojenik türev "mikro-kültür" olarak adlandırılan bir yüksek yoğunluklu kültür tekniği ile elde edilir. Şöyle önce kültüre, kondrojenik Orta (ChM) hazırlanması: DMEM, bir 500 ml şişe için (4.5 g / ml glikoz) FBS (% 1 son konsantrasyon) 5.0 ml ve penisilin / streptomisin, 5.0 ml (10,000 IU / ml ekle ve 10,000 ug / ml nihai konsantrasyonlar, sırasıyla). L-askorbik-2-fosfat (nihai 50.0 ug / ml), insülin (nihai 6.25 mg / ml), transferin (nihai 6.25 mg / ml) ve TGFβ1: Bunun için, belirtilen son konsantrasyonları vermek üzere aşağıdaki kondrojenik indüksiyon maddeleri eklemek (10.0 ng / ml).
    1. Hücreleri peletlemek için 1200 x g'de 5 dakika boyunca TSK ve santrifüj hasat. Hücre süspansiyonunun yoğunluğunu belirlemek için hücre sayımı.
    2. Mikro-granül hazırlamak için, iki hücre süspansiyonları hazırlamak: 1 x 10 7 hücre yoğunluğunda CHM hazırlanan bir deney süspansiyonus / ml ve 1 x 10 7 hücre / ml 'lik bir yoğunlukta CM hazırlanan bir kontrol süspansiyonu.
      1. Bir çok-yuvalı tabak bireysel kuyu hücre süspansiyonu 10.0 ul "damlacıkları" yerleştirin. 37 ° C'de 2-3 saat boyunca yapışmaya izin
      2. Yavaşça ChM veya CM ya hücreleri ayırmak için dikkatli olmak ile kaplı damlacıkların bindirmek.
      3. Kültür ortamı içinde değişiklik, her 3-4 günde bir ile CHM veya CM kadar 14 gün için hücreler. CHM içinde kültürlenen hücrelerden çevreleyen bir tek tabaka içinde herhangi bir hücre az olan, yüksek yoğunluklu bir mikro-topak elde etmek için, bu süre içinde yoğunlaşacaktır. Kültürlenmiştir Kontrol hücreleri, bu yoğunlaşma uğramaz ve birçok tek tabaka olarak tespit edilecektir.
      4. Kondorjenez teyit etmek için, oda sıcaklığında (1 x PBS içinde hazırlanmıştır)% 4.0 paraformaldehid içinde 15 dakika boyunca granül düzeltin. Bir Alcian Mavi histolojik leke kullanılarak sülfatlı proteoglikanların varlığı için leke.
        Alsiyan Blue kullanılarak leke için:
        1. Pa yıkayınbir kez 1 x PBS içinde raformaldehyde sabit peletler.
        2. Kendi pH değerini düşürmek için 5 dakika boyunca 0.1 N HCI (pH 1.0) 'de pelet inkübe edin.
        3. HCI çıkarın ve (0.1 N HCI, pH 1.0 içinde hazırlanmıştır)% 1 Alsiyan mavisi reaktif ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
        4. Alsiyan mavisi reaktif çıkarın ve Boya fazlasını uzaklaştırmak için, 0.1 N HCI (pH 1.0) ile granül yıkayın.
        5. Musluk suyu ile yıkama ek arka plan boyama azaltmak için kullanılabilir.
        6. Bir alternatif olarak, mikro-topaklar, hasat edilebilir% 10 formalin içinde gece boyunca sabitlenmiş, parafine gömülü ve bölümler Alcian Mavi için boyandı.

4. TSK Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Hücre yüzeyi antijeni, CD profili karakterizasyonu geleneksel akış sitometrisi yoluyla gerçekleştirilebilir.

  1. Akış sitometri için TSK hazırlanması: Önanalizine, aşağıdakilerden oluşan bir Flow Cytometry Tamponu (FCB) hazırlanması:% 1.0 BSA,% 2.0 FBS ve 1 x PBS içinde hazırlanmış% 0.025 saponin.
    1. TSK hasat ve pelet üretmek için 1.200 x g, 5 dakika için hücreler santrifüj.
    2. Steril 1XPBS hücrelerin tekrar ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Süspansiyonun hücre yoğunluğunu belirler.
    3. Pelet toplam ve santrifüj 5 x 10 5 hücre kısma süspansiyon bölmek.
    4. PBS Süpernatantı ve buz soğukluğundaki% 70 etanol fazlası ile, -20 ° C'de 60 dakika boyunca hücreleri gidermek. Eğer gerekli ise, gerekli olana kadar, bu hücreler, bir -20 ° C dondurucu içinde bu% 70 etanol içinde depolanabilir.
    5. Tespit sonra, dikkatli bir şekilde aspire etanol ve yavaşça FCB fazlası ile topak iki kez yıkayın. Yıkamak için:
      1. FCB aşırısı ekleyin ve hafifçe pelletini.
      2. Hücreleri toplamak için 1.200 x g'de 5 dakika santrifüj birsa pelet.
      3. Dikkatle FCB süpernatant aspire.
      4. Tekrarlayın.
    6. FCB 100 ul her kısım ve tekrar süspansiyon gelen son FCB yıkama süpernatantı. Üreticinin tavsiye edilen bir seyreltme kullanılarak istenen florokrom-eşlenik birincil antikor ekleyin. 30 dakika boyunca antikor ile buz üzerinde hücrelerin inkübe edin.
      Not: florokrom-eşlenik primer antikorlar mevcut değil ise, eşlenik olmayan primer antikorlar kullanılabilmektedir.
    7. (Örneğin, FITC, PE) kullanılan her florokrom, bir negatif kontrol olarak izotip-eşleştirilmiş IgG'leri ihtiva eden 100 mi FCB ile bir kısım hücreler inkübe edin.
    8. İlave bir kontrol olarak hiçbir antikor ihtiva eden 100 ml FCB bir kısım inkübe edin.
    9. Adım 4.1.5 ayrıntılı olarak FCB ile hücrenin Her eş pay, iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, FCB 100 ml hacimde tekrar süspansiyon ve akış analizi ile devam edin.
      Not: eşlenik olmayan primer antikorlar kullanılmışlarsa: FCB üreticinin tavsiye edilen bir seyreltme kullanılarak uygun florokrom-konjuge sekonder antikor ile takviye edilmiş olan bu yıkama aşaması 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe alikotları ardından. Adımda 4.1.5 de belirtildiği gibi iki kez yıkayın.
  2. TSK Akış analizi: akış analizi için, 10.000 olayların minimum sayılmalıdır. Lekesiz ve izotip-eşleştirilmiş kontrol ileri dağılım (FSC) ve yan saçılma (SSC) kapıları ile ayarlamak için kullanılmalıdır. Bunun için, aşama 4.1.8 hiçbir kontrol antikoru (örneğin, lekesiz) artıkları ve ölü TSK ortadan kaldırmak için kullanılmalıdır. Adım 4.1.7 izotip-eşleştirilmiş kontrol IgG. Pozitif floresan alanları oluşturmak için kullanılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol taslak üzerinde geniş hacimli lipoaspirate numuneden bir SVF izolasyonu için bir el enzimatik yöntem açıklanır. Bu SVF içinde, ASC de dahil olmak üzere pek çok hücre popülasyonları vardır. Çeşitli çalışmalar standart doku kültürü koşulları altında bu svf kültürleme ASC türü esas oluşacak muhtemel bir yapışık fibroblast nüfus için seçecektir öneriyorum. Bu uygun olarak, kültürlü SVF peletler önemli bulaşıcı hücreler, tür, yani RBCs, yumuşak kas hücreleri ve endotel soy 1 hücrelerinin esasen haline gel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TSK izolasyonu için yağ dokusu çeşitli biçimlerde gelebilir: şırınga çıkarma veya emme destekli lipoplasty (yani liposuction) ya aracılığıyla elde edilen küçük parçalar rezeksiyon veya lipoplasty yoluyla elde edilen doku katı parçalarından. Çelişkili çalışmalar 16, 17 sunulmuştur daha SVF hücreleri (ve dolayısıyla TSK) rezeke veya aspire yağ örneklerinden elde edilebilir belirsizdir. Bu yağ dokusu ya da bir şekilde sürece operatör kendi izolasyon tekniği yeterli olduğu SVF hücreleri ve TSK izolasyonu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazının yazarları California Üniversitesi Regents ve Cytori Tedavi için lisanslı ait bir patent üzerinde eş-mucitler vardır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar kabul etmek istiyoruz ve dahil açıklanan protokolü ve TSK kendi izolasyon gelişmesine katkıda bu ek araştırma personelini teşekkür: Dr H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, Dr Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, Doktora, ve Dr John Fraser, PhD. Sunulan sonuçlar NIAMS ve NIDCR Enstitüleri dahil olmak üzere Ulusal Sağlık Enstitüleri, araştırma hibe, kısmen finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reagent
DMEM (Dulbecco’ Eagle'ın Modifikasyonu’ s Medium)4,5 g/ml glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat içerenMediatech Cellgro10-013-CV
Penisilin/StreptomisinMediatech Cellgro30-002-CI10.000 IU/ml penisilin/10.000 μ g/ml streptomisin
Amfoterisin BMediatech Cellgro30-003-CF250 & # 956; g/ml amfoterisin B
10X PBS (Fosfo tamponlu Salin)Mediatech Cellgro25-053-CIkalsiyumsuz, magnezyumsuz
Tripsin/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV%0,25 tripsin/2,21mM EDTA
Kollajenaz tip IA (Clostridium histolyticum'dan)SigmaC2674ham preparat; < 125 kollajen sindirim ünitesi/mg katı
FBS (Fetal Sığır Serumu) ısıyla inaktiveGemini Bioproducts100106USDA kaynağı, ısıyla inaktive edilmiş
10 ml serolojik pipetlerGenesee Scientific12-104
25 ml serolojik pipetlerGenesee Scientific12-106
50 ml polipropilen santrifüj tüpleriGenesee Scientific21-106
100 mm doku kültürü kaplarıGenesee Scientific25-202
150 mm doku kültürü kaplarıGenesee Scientific25-203
500 ml Stericup Filtre ÜniteleriMiliporeSCGPU05REPES membranı, 0.22 & # 956; m gözenekli
Hücre süzgeçleriFisherBrand22-363-549100 & # 956; m naylon örgü
deksametazon - suda çözünürSigmaD-2915
L-askorbik asit 2 fosfatSigmaA-8960
& # 946; -gliserofosfat disodyum tuzu SigmaG-9422gliserofosfat
insülinSigmaI-6634sığır pankreas
indometazinSigma I-7378'denyapılmıştır
apo-transferrinSigmaT-4382
TGFβ 1Ar-Ge D Systems240-B-002rekombinant insan
Yağı Kırmızı OSigmaO-0625
Alcian BlueSigmaA-5268
Gümüş nitratSigmaS-0319
Hidroklorik asitFisher ScientificA144
ParaformaldehitFisher Scientific30525-89-4%16 stok
[başlık]
Ekipman Gerekli
Sınıf II A/B Biyogüvenlik başlığıThermo Scientificdavlumbazın aspirasyon için vakum hatlarına sahip olmasını sağlar
Tezgah üstü santrifüjHermle LabnetZ38350 ml'lik tüpler için açılır rotor gereklidir, 1200xg
kapasiteli Su banyosu Fisher Scientific IsotempS52602Q5-10L kapasiteli, 37C kapasiteli
Otomatik Pipet YardımcılarıDrummond Pipet Yardımı XL4-000-105
CO2 İnkübatörThermo ScientificForma 310doğrudan ısı veya su ceketli
edilmiş , olarak da bilinir olarak tedarik edilir,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537(2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stromal Vask ler FraksiyonKollajenaz SindirimiLipoaspirat Y kamaH cre zolasyonuSantrif gasyon ProtokolDoku K lt rDiferansiyasyon AnalizleriAdipojenik OsteojenikKondrojenik Soy Hatlar

İlgili makaleler