$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fare Kemik İliği Hücreleri İzolasyon
- Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanan protokolünü kullanarak fareler Euthanize ve% 70 etanol ile hayvan yüzey sprey.
- Orta karın deri bir kesi yapmak ve alt ekstremite kaplayan deri ve fare distal kısmından cilt kaldırmak.
- Makas kullanarak alt ekstremite kasları kesilmiş ve femur başı kırılma kaçınarak dikkatle, kalça eklemi gelen asetabulum yerinden.
- Bir neşter ve makas kullanılarak femur ve tibia gelen kalan kasları çıkarın ve kemik uçları kırmak değil diz egzersiz bakım de tibia gelen femur ayırın. % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 1X içeren bir Petri kabındaki kemikleri yerleştirin.
- Bir doku kültürü kaputu altında aşağıdaki adımlara devam edin. Neutrophi önlemek için sıkı steril teknikleri korumak için ekstra önlem alınl aktivasyonu.
- Kemik yüzeyinden etanol durulayın buz soğukluğunda steril PBS içinde üç yıkamadan sonra (Petri içinde) ve ardından% 70 etanol (bir Petri kabı içinde) ile her bir kemik durulayın.
- Temiz bir steril Petri kabı içinde, kemiklerin epifizleri kesti ve onları bir kenara saklayın.
- Bir 25-gauge iğne ve RPMI,% 10 FBS ve 2 mM EDTA eklenmiş ile dolu bir 12 cc şırınga kullanarak ve bir 100 mikron ile donatılmış, 50 ml'lik vida üst Falcon tüpüne kemik şaftlann her iki ucunda ikinci kemik iliği hücrelerinin bir hizada filtre. Etkili bir biçimde hücreleri çıkarmak amacıyla, 25-gauge iğne kullanılarak kemik iç yüzeyi raspa.
NOT: kemik haşlama hücreleri yeterince kazınmış olduğunu gösterir.
NOT: femur / tibia çifti temizlemek için medya yaklaşık 10 ml kullanın. Orta EDTA ekleyerek hücrelerin kümeleşmeyi önlemek için gereklidir.
- Kemik epifizleri CutBir neşter ve bir 2.5 ml Eppendorf Combitip Artı Biopur pipet arka uç kullanarak 100 mikron filtre aracılığıyla şut küçük 0.5-1 mm 3 adet.
- 4 ° C, 7 dakika boyunca 1400 rpm'de santrifüj
- Yaklaşık olarak 20 saniye boyunca% 0.2 NaCl, 20 ml hücre pelletini tekrar süspanse ederek, kırmızı kan hücrelerinin lize% 1.6 NaCl, 20 ml ilave edilir. (Kritik: kemik iliği hücre ölümü önlemek için hipotonik lizis 20-30 sn aşmayın ikinci nötrofil aktive potansiyeline sahiptir, çünkü parçalama için hipotonik NaCl kullanımı ACK parçalama tampon üzerinde tavsiye edilir.).
- 4 at 1.400 rpm 7 dakika santrifüj ° C hücreleri toplamak için.
- % 10 FBS ve 2 mM EDTA ile takviye edilmiş RPMI 1640 hücreleri 1X yıkayın ve adım 1.12 olarak santrifüj.
- Bu yöntemi kullanarak, kemik iliği hücrelerinin verimi yaklaşık 60-80.000.000 enfekte 8-12 haftalık C57BL / 6 fare başına verilir.
2. Nötrofiller ayrılmasıyoğunluk dereceli santrifüj yoluyla
- Kemik iliği hücreleri saymak ve buz soğukluğunda steril 1 ml PBS içinde yeniden süspanse.
- 15 ml konik bir tüp içinde Histopaque 1119, 3 ml (yoğunluğu, 1.119 g / ml) eklenir.
- Histopaque 1119, 3 ml üzerinde Histopaque 1077 kaplama 3 ml (yoğunluk 1.077 g / ml).
NOT: Histopaque 1.119 ve Histopaque 1.077 18-26 ısındı olmalıdır ° C kullanmadan önce.
Kritik Adım: hemen önceden degrade iki kat ve optimal nötrofil saflık ve kurtarma arasındaki difüzyon ile sonuçlanır hazırlama gibi kullanmadan önce geçişlerini hazırlayın.
Kritik Adım: Kaplama santrifüj sırasında hücre ayırma engel olan iki yoğunlukları, karıştırma önlemek için yavaş yavaş yapılması 1119 ihtiyaçları üzerinde Histopaque 1.077.
- Histopaque 1077 üstüne kemik iliği hücre süspansiyonu Yerleşimi.
Kritik Adım: Overlhücreler ve Histopaque 1077 arasındaki ara rahatsız etmemek amacıyla yavaşça yapılması gereken Histopaque 1077 ihtiyaçları üzerinde kemik iliği hücre süspansiyonu Aying.
Not: 1 ml PBS enfekte olmamış bir fare kemik iliği hücreleri Resuspending,>% 90 saflıkta nötrofil verir. Bununla birlikte, pek çok kemik iliği örneklerinden havuzu nötrofil saflık uzlaşma, örneğin, 3 ml PBS ~% 80 ile>% 90 saflıkta nötrofil azaltır 300 x 10 6 hücre yeniden süspansiyon haline getirilmesi. Bu nedenle, araştırmacılar kendi özel deneyler için ideal bir hücre sayısı / hacim koşulları tanımlamak için Pilot deneyler yapmalıdır
- 25 2.000 rpm'de 30 dakika ° frensiz C için santrifüj.
NOT: Oda sıcaklığında gradyan santrifüj nötrofil etkin bir şekilde ayrılması için önemli ve gereklidir.
- Histopaque 1119 arayüzü nötrofil toplayın ve 1.077 katmanları Histopaque.
- RPMI ile iki kere yıkayın toplanan nötrofillerden 1X 1640% 10 FBS ve 4, 7 dakika boyunca 1400 rpm'de% 1 penisilin / streptomisin ve santrifüj ° C ile desteklenmiş
- Nötrofil saymak ve canlılığı belirler.
Not: Nötrofiller, tipik olarak> FACS analizi ile belirlendiği gibi% 95 uygulanabilir ve>% 90 saf. Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare kemik iliğinden nötrofillerin tipik verim (yani 2 femur ve tibia kemikleri 2) ~ 6-12.000.000 hücredir. Nötrofil enfekte hayvanların kemik iliğinden hasat edilir, bu numara büyük ölçüde daha büyüktür. Candida ile enfekte farelerde hücre hasat 6 kullanıldı zaman Bu nedenle, ~, 30-40 milyon nötrofil / fare ele geçmiştir.
3. CellTracker Boyalar kullanarak Nötrofiller etiketlenmesi
- 5. nötrofil süspanse x 10 6 hücre / mL PBS içinde 37 ° C'de önceden ılıtılır
- Son bir concent bir CellTracker boya ekle5 mcM oranı.
Not: CellTracker Yeşil (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein diasetat) ve CellTracker Turuncu (CMTMR (5 - (and-6)-4-klorometil benzoil amino tetramethylrhodamine) için farklı yabani tip ve gen-eksikliği nötrofillerin etiketlemek için bu protokolü kullanılmıştır fareler.
NOT: Deney gününe kadar -80 10 CellTracker Green mM ve CellTracker Portakal, kısım, ve mağaza bir stok solüsyonu ° C hazırlayın.
- Karanlıkta çalkalanan bir su banyosu içerisinde 37 ° C 'de 10 dakika boyunca, karşılık gelen CellTracker boya 5 uM nötrofil inkübe edin.
- % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 hücreleri 1X ile iki kere yıkayın.
NOT: hücrelerin Verimli yıkama CellTracker boya ile etiketleme adım çıkışlar için diferansiyel-etiketli nötrofil nüfus karıştırmadan önce boya çapraz bulaşmayı önlemek için gereklidir sonratream rekabetçi repopulation çalışmaları.
4. Fare ve Akım Sitometri kullanarak Aktarılan Nötrofiller Analizinde nötrofillerin Kabul edilmiş Transfer
- 25 x 10 6 hücre / ml ile 5 x 10 6 nötrofil fare başına aktarılır, böylece, yanal kuyruk damarı içine süspansiyonu 200 ul enjekte edilir bir konsantrasyonda buz gibi soğuk PBS içinde süspanse nötrofil. Rekabetçi repopulation nötrofil çalışmaları için, bir 1:1 oranında yabani tip ve gen-eksikliği nötrofil karıştırmak ve yukarıdaki gibi fare başına 5 x 10 6 nötrofiller toplam enjekte edilir.
NOT: En az en fazla 10 x 10 6 nötrofil adoptively hayvanlara açık hemen toksisite olmadan fare başına devredilebilir.
- Evlatlık transferi (örneğin 1, 2, 3 veya 4 saat sonrası transferi) ardından farklı zamanlarda, fare ve hasat kan euthanize ve / veya ilgi kemik iliği ve / veya diğer hedef organ (lar).
- Si hazırlayınyayınlanan protokolleri 6,15 kullanarak adoptively transfer etiketli nötrofil nicel ve nitel analiz için bu dokulardan ngle hücre süspansiyonları.
- Ölü / canlı canlılığı boyama ve Fc abluka, CD45 (klon 30-F11) ile etiket hücreleri, Ly6G (klon 1A8) ve CD11b'nin (klon M1/70) ve kapı canlı CD45 + Ly6G + CD11b + nötrofiller üzerinde. Ardından Bu kapının Nötrofiller FITC (+ CellTracker Yeşil ile etiketlenmiş) veya PE + (Hücre Takibi Portakal ile etiketlenmiş varsa) olan alıcı fare yerli nötrofiller gibi adoptif transfer etiketli nötrofiller bulunmaktadır.
NOT: Nötrofiller en az 4 saat sonrası transferi için Candida ile enfekte farelerde kan, kemik iliği ve böbrek izlenen olabilir.
Not: PBS içinde% 2 paraformaldehit ile sabitleme olumsuz CellTracker Gr ile etiketlenmiş, nötrofillerin ortalama floresan yoğunluğu etkilemezEn az 48 saat süre ile ya da een CellTracker Turuncu.