Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli efektör hücrelerdir. Bunlar hızla akut inflamasyon bölgelerinde işe ve inflamatuar ortamı bağlı olarak koruyucu veya patojenik etkiler gösterebilir vardır. Bununla birlikte, farklı bulaşıcı hastalıklar ve inflamatuar koşullarda nötrofil 'efektör ve immunopathogenic etkileri aracılık moleküler faktörlerin bağışıklık, ayrıntılı bir anlayış nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen hala kısmen, kısa yarı ömrü, bunların kullanımı ile zorluklar, eksik hücreleri ve alt fonksiyonel çalışmalar ve evlat edinen transferi deneyler için nötrofil yeterli sayıda elde etmek için güvenilir deneysel protokollerin eksikliği. Bu nedenle, basit, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir yöntem gibi fagositoz, öldürme, sitokin üretimi, degranülasyonunun ve ticareti gibi işlevleri değerlendirmek için fare nötrofil yeterli sayıda hasat için son derece arzu edilir. Bu amaçla,yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izole etmek için, herhangi bir laboratuvar olarak adapte edilebilir, tekrarlanabilir yoğunluk gradyan santrifüj tabanlı bir protokol, mevcut. Ayrıca, daha sonra adoptively akım sitometri kullanarak en az 4 saat sonrası transferi için alıcı farelere transfer ve çeşitli dokularda izlenebilir izole nötrofil, etiketlemek için CellTracker boyalar kullanan basit bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı CellTracker boyalarla yabani tip ve gen-eksik fareler nötrofil diferansiyel etiketleme başarılı bir şekilde in vivo olarak hedef dokulara kan nötrofilleri ticareti özel genlerin doğrudan rolünün değerlendirilmesi için rekabet repopulation çalışmaların gerçekleştirilmesi için kullanılabilecektir .
Giriş
Nötrofiller, insanlarda en bol lökositlerdir. Onlar mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olarak doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve hareket temel hücresel bileşenidir. Nötrofil sayısı ve / veya fonksiyonunu etkileyen kazanılmış nötropeni ve primer immün yetmezlikler olan hastalar konak savunma 1 bu hücrelerin önemini vurgulayarak hayatı tehdit eden invazif bakteriyel ve mantar enfeksiyonları, geliştirmek. Iltihaplı doku 2 içine kan dolaşımından işe nötrofil yeteneğine sahip bir kemotaktik degrade oluşturmak chemoattractants salgılanmasına yol açan bir yönetilen doğal immün yanıt, en indüksiyon kendi soydaş desen tanıma reseptörle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Fare Kemik İliği Hücreleri İzolasyon
- Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanan protokolünü kullanarak fareler Euthanize ve% 70 etanol ile hayvan yüzey sprey.
- Orta karın deri bir kesi yapmak ve alt ekstremite kaplayan deri ve fare distal kısmından cilt kaldırmak.
- Makas kullanarak alt ekstremite kasları kesilmiş ve femur başı kırılma kaçınarak dikkatle, kalça eklemi gelen asetabulum yerinden.
- Bir neşter ve makas kullanılarak femur ve tibia gelen kalan kasları çıkarın ve kemik uçları kırmak değil diz egzersiz bakım de tibia gelen femur ayırın. % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş buz gibi soğuk RPM....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, farelerden elde edilen kemik iliği hücreleri ve ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma ortamı Histopaque kullanılarak yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla, bu hücrelerin, nötrofillerin sonraki ayırma hasat için optimize edilmiştir. Nötrofiller, bu yöntemi kullanan alt fonksiyonel çalışmalar, ex vivo çeşitli ve alıcı farelerde adoptif transfer deneyleri için de kullanılabilir izole edilmiştir.
Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare başına femur ve tibia hem de kemik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu olgu, bir yoğunluk gradyan santrifüj yaklaşım kullanılarak yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izolasyonu için güvenilir, basit, hızlı ve ekonomik bir protokol mevcut. Bu protokol doğru gerçekleştirildiğinde, ~ 6-12 x 10 6 nötrofil enfekte olmamış bir fareden elde edilebilir ve en çok ~ olarak 30-40 x 10 6 nötrofil enfeksiyonu 6 sonra bir fareden izole edilebilir. Izole nötrofil% 80-95 saf ve>% 95 yaşayabilir.
Kem.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Bu çalışma Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID), Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH), ABD İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir.
Tüm fareler Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID) de Laboratuar Hayvan Bakımı-akredite hayvan tesisin Akreditasyon için Amerikan Derneği muhafaza ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen usullere uygun olarak muhafaza edildi NIAID ve Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol himayesinde.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifler< / güçlü > | |||
| RPMI 1640 1X, L-glutamin ve 25 mM HEPES | ile Cellgro | 10-041-CV& | nbsp; |
| Fetal Sığır Serumu (Isı ile Aktive Edilmiş) | GemCell | 100500 | |
| Penisilin / Streptomisin (10.000 ünite penisilin / 10.000 mg / ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Kalite Biyolojik A.Ş | 351-027-101 | |
| %0,2 ve %1,6 sodyum klorür | JT Baker | 3624 | Damıtılmış su ve steril filtrelenmiş kullanılarak hazırlanan sodyum klorür çözeltileri |
| Steril filtreli Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077'nin 18-26 dereceye getirilmesi gerekir; C kullanmadan önce |
| Steril filtreli Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119'un 18-26 dereceye getirilmesi gerekir; C kullanmadan önce |
| Kalsiyum ve Magnezyum içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Cellgro | 210-40-CV& | nbsp; |
| Etil Alkol (200 kanıt) | Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Klorometilfloresein Diasetat) | Invitrogen | C-7025 | DMSO'da 10 mM'lik stok çözeltileri yapın, alikot ve -80 °C'de saklayın; C |
| CellTracker Turuncu (CMTMR, 5- (ve 6)-4-Klorometil Benzoil Amino Tetrametilrodamin) | Invitrogen | C-2927 | DMSO, alikotta 10 mM'lik stok çözeltileri yapın ve -80 °C'de saklayın; C |
| Anti-fare CD45 (Klon 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | (nbsp; |
| Anti-fare Ly6G (Klon 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-fare Ly6G (Klon 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-fare CD11b (Klon M1 / 70) | eBioscience | 47-0112-82& | nbsp; |
| Anti-fare CD16 / CD32 (Fare BD Fc Bloğu) | BD Pharmingen | 553141 | 1:100 seyreltmede kullanın |
| CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke Kiti | Moleküler Problar | L-23105 | 1:1000 seyreltmede kullanın |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehit Çözeltisi, PBS | USB Corporation | 19943'te | |
| Tablo 1. Evlat edinerek transfer edilen nötrofillerin izolasyonu, etiketlenmesi ve izlenmesi için reaktifler. | |||
| Malzemeler< / güçlü > | |||
| C57BL / 6 fare | Taconic | & nbsp; | |
| 15 ml santrifüj tüpleri | Corning | 430053 | |
| 50 ml santrifüj tüpleri | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serolojik pipetler | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serolojik pipetler | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serolojik pipetler | Celltreat | 229205B | |
| Pastör pipetleri (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml şırınga | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 inç İğneler (hassas kayma iğneleri) | BD | 305122 | |
| 100 mm hücre süzgeçleri | BD Falcon | 352360 | |
| Bakterisidal Petri kapları | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Fare diseksiyon aletleri (Makas, forseps, neşter) | Biyomedikal Araştırma Aletleri | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Kullanımdan önce sterilize edilen aletler |
| < güçlü > Ekipman< / güçlü > | |||
| doku kültürü başlığı | The Baker Company | SG403 | ve nbsp; |
| Soğutmalı santrifüj | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 & derece; C çalkalama su banyosu | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Tablo 2. Bu protokolde kullanılan Malzeme ve Ekipmanların listesi. |
Kaynaklar
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
