Yöntem makalesi

Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi

DOI:

10.3791/50605

⸱

4 Eylül 2013

 ,  , 
1Department of Neuroscience, IRCCS - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin inflamatuar yanıtının karmaşıklığı hakkında yeni bilgiler edinmenin bir yolu sunulmaktadır. İmmünofloresan tabanlı protokolleri ve ardından fokal iskeminin bir fare modelinde mikroglia/makrofaj fenotip belirteçlerinin birlikte ekspresyon modelini araştırmak için üç boyutlu konfokal analizi tanımladık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin felcinden sonra mikroglia/makrofajlar (M/M), yeni yüzey antijenlerinin ekspresyonunu ve inflamatuar yanıtı oluşturan ve sürdüren mediatörlerin üretimini içeren dramatik morfolojik ve fenotipik değişikliklerle hızlı aktivasyona uğrar. Ortaya çıkan kanıtlar, M/M'nin akut beyin hasarından sonra klasik proinflamatuar (M1) veya alternatif anti-inflamatuar (M2) aktivasyonu varsayabilen oldukça plastik hücreler olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, M/M fenotip belirteç ekspresyonunun tam bir karakterizasyonu, bunların kolokalizasyonu ve yaralı beyindeki zamansal evrimi hala eksiktir.

M/M aktivasyonunun ilgili belirteçlerini spesifik olarak boyayan immünofloresan protokolleri, iskemik beyinde gerçekleştirilebilir. Burada, orta serebral arterin (pMCAO) kalıcı oklüzyonu ile indüklenen fokal iskeminin fare modelinde CD11b, CD68, Ym1 gibi M/M fenotip belirteçlerinin lokalizasyon ve birlikte ekspresyon paternini araştırmak için güçlü bir yaklaşım olarak immünofloresan tabanlı protokolleri ve ardından üç boyutlu konfokal analizi sunuyoruz. Boyanmış alanın iki boyutlu analizi, her bir belirtecin tanımlanmış bir M/M morfolojisi ile ilişkili olduğunu ve iskemik lezyonda belirli bir lokalizasyona sahip olduğunu ortaya koymaktadır. M/M fenotip belirteç ko-ekspresyon paternleri, iskemik alanda üç boyutlu konfokal görüntüleme ile değerlendirilebilir. Görüntüler, taşma etkilerini en aza indirmek ve dalga boyu örtüşmesini önlemek için sıralı bir tarama modu ile tanımlanmış bir hacimde (10 μm z ekseni ve 0,23 μm adım boyutu, 180 x 135 x 10 μm hacme karşılık gelir) elde edilebilir. Görüntüler daha sonra Imaris yazılımı aracılığıyla üç boyutlu görüntüler elde etmek için işlenir. Üç boyutlu işlemelerin katı görünümü, hücre kümelerinde işaretçi ifadesinin tanımlanmasına izin verir. M/M'nin, lezyon bölgesindeki konuma ve yaralanmadan sonraki zamana bağlı olarak çok sayıda fenotipe doğru farklılaşma yeteneğine sahip olduğunu gösterdik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut beyin hasarından sonra, mikroglia hızla aktive olur ve dramatik morfolojik ve fenotipik değişikliklereuğrar 1-3. Bu içsel yanıt, yaralı beyin parankimine göç eden kan kaynaklı makrofajların işe alınmasıyla ilişkilidir4,5. Antijenik olarak ayırt edilemeyen (bundan böyle M/M olarak anılacaktır) mikroglia ve makrofajların beyin hasarındaki rolü hala tartışılmaktadır. Artan sayıda çalışma, periferik makrofajlar için tarif edilenlere benzer şekilde, mikroglia ve beyin tarafından işe alınan makrofajların, uç noktaları klasik pro-inflamatuar toksik (M1) veya anti-inflamatuar koruyucu (M2) fenotipe karşılık gelen farklı fenotipler alabileceğini göstermektedir. Pro- veya anti-enflamatuar faktörlerin salgılanması, nörotrofik moleküllerin salınması ve lizozomal aktivite dahil olmak üzere farklı aktivasyon durumları, ekspresyonu çevredeki ortamın zamansal evrimine bağlı olan spesifik bir fenotipik belirteç modeli ile karakterize edilir. Yaralı beyindeki bu M / M fenotiplerinin karakterizasyonu hala yetersizdir. İnme sonrası M / M ekspresyonunu ve evrimini analiz etmek için iyi kurulmuş bir pMCAo fare modeli kullandık. Burada sunulan immünofloresan tabanlı protokoller, iskemik alanda spesifik M/M fenotip belirteçlerinin görünümü, lokalizasyonu ve hücresel ko-ekspresyonu hakkında bilgi edinmeyi amaçlamaktadır. Farklı aktivasyon durumu veya fenotipi ile ilişkili birkaç molekülü, yani lökositler tarafından eksprese edilen bir yüzey markörü ve yaygın olarak kullanılan bir M/M aktivasyon/işe alımbelirteci olan CD11b, 6-8, CD68 lizozom6,7 ve alternatif olarak aktive edilen (M2) makrofajlar tarafından eksprese edilen ve iyileşme ve fonksiyon restorasyonu ile ilişkili bir salgı proteini olan Ym19-10 ile ilişkili birkaç molekülü araştırdık.

İki belirteç aynı hücre tarafından, ancak farklı hücre altı bölmelerde ifade edildiğinde, tek başına kolokalizasyon çok bilgilendirici olmayabilir. Bu durumda, tek düzlem görünümü ve üç boyutlu renderlar kullanılarak ortak ifade analizi gerçekleştirilebilir. Burada, işaretleyici birlikte ifadesinin kapsamlı bir üç boyutlu analizini elde etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İmmünofloresan

Aşağıdaki protokol, transkardiyal perfüze farelerden (20 ml PBS, 0.1 mol/litre, pH 7.4, ardından PBS'de %4 50 ml soğutulmuş paraformaldehit) elde edilen koronal beyin kriyoseksiyonları üzerinde gerçekleştirilir. Perfüzyondan sonra, beyinler dikkatlice çıkarılır ve kriyoproteksiyon için gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 30 sükroza aktarılır. Beyinler daha sonra şişelere kapatılmadan ve kullanıma kadar -70 ° C'de saklanmadan önce 3 dakika boyunca - 45 ° C'de izopentan içine daldırılarak hızla dondurulur. Koronal beyin kriyoseksiyonları (20 μm) seri olarak kesilir ve immünofloresan protokolü 11, 6'ya tabi tutulur.

Kullanmadan önce tüm reaktifleri ve numuneleri oda sıcaklığına getirin. Sunulan çalışma antikor ve serum seyreltmelerinin, en iyi performansı elde etmek için yapılan denemelerden kaynaklandığını lütfen unutmayın. Farklı antikorlar ve serum kullanıldığında, protokolün doğrulanması gerekir.

Hem anti-CD11b hem de anti-CD68 primer antikorları sıçanlarda yapıldığından, sıçan karşıtı Alexa 546'nın çapraz sinyalini önlemek için, yüksek miktarda anti-CD11b seyreltmesi ve ardından TSA kiti (Cy5 Tyramide) ile floresan sinyal amplifikasyonu kullandık. Adım 1.17 dışında açıklanan protokolü uygulayarak ve tablo 1'de bildirildiği gibi en az 7 farklı anti-CD11b seyreltmesi kullanarak anti-CD11b için en uygun çalışma seyreltmesini oluşturduk. Sonuç olarak, 1: 30.000, aşağıdakileri başaran tek seyreltme olarak seçilmiştir: 1) uyarma dalga boyu 646 nm'de Cy5 ile görünür sinyal; 2) 532 nm uyarma dalga boyunda Alexa 546 ile sinyal yok. Bu şekilde, Alexa 546 floresan sinyali seçici olarak CD68 ekspresyonu ile ilişkilendirilir.

Anti-CD11b ve anti-CD68 antikorları için optimal dilüsyonlar, doku tipine bağlı olarak değişebilir ve ortak etiketleme protokolünü başlatmadan önce tanımlanmalıdır.

  1. Beyin kriyoseksiyonlarını PBS ile iki kez yıkayın.
  2. % 1 H2O2 içeren PBS'de kriyoseksiyonları 5 dakika inkübe edin (floresan amplifikasyonun yaban turpu peroksidaz, streptavidin-HRP ile inkübasyona ihtiyacı olduğundan adım gereklidir, bkz. adım 1.12).
  3. Kriyosekeseksiyonları 2x PBS ile yıkayın.
  4. %10 NGS ve %0.3 Triton içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.
  5. Birincil Ab Rat anti-CD11b [1:30.000], %10 NGS ve %0.3 Triton içeren PBS'de kriyoseksiyonları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  6. Kriyokesitleri 2x (5 dakika) PBS ile yıkayın.
  7. Biyotinile edilmiş ikincil anti-Rat Ab [1:200] ve% 1 NGS içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.
  8. Kriyosekeseksiyonları 2x PBS ile yıkayın.
  9. Kriyosekesyonları TNT ile yıkayın (Tris-HCl, NaCl, Ara: 0.1 M TRIS-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, %0.05 Tween 20).
  10. Kriyoseksiyonları TNB'de 1,5 saat inkübe edin (Tris-HCl-NaCl-Bloke edici tampon: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, uygun kitten %0,5 Bloke edici reaktif (reaktifler tablosuna bakınız)).
  11. Kriyoseksiyonları TNT ile 3 kez yıkayın.
  12. Streptavidin HRP içeren TNB'de kriyoseksiyonları inkübe edin [1:100].
  13. Kriyoseksiyonları 3x TNT ile yıkayın.
  14. Kriyoseksiyonları Siyanin 5 Tyramid [1:300] içeren Amplifikasyon Seyrelticisinde 8 dakika inkübe edin.
  15. Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.
  16. % 10 NGS ve% 0.1 Triton içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.
  17. Kriyoseksiyonları gece boyunca 4 °C'de primer Ab Rat anti-CD68 [1:200], %3 NGS ve %0.3 Triton içeren PBS'de inkübe edin.
  18. Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.
  19. Florkonjuge ikincil Ab, Alexa 546, anti-Rat [1:500] ve% 1 NGS içeren PBS'de kriyoseksiyonları 60 dakika inkübe edin.
  20. Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.
  21. Hoechst 1 μg / ml içeren PBS'de kriyoseksiyonları 10 dakika inkübe edin.
  22. Kriyokesitleri 3x PBS ile yıkayın.
  23. Kriyoseksiyonları Prolong Gold'a monte edin.

2. Konfokal Mikroskopi ile Üç Boyutlu Görüntülerin Elde Edilmesi

Burada kullanılan mikroskop, 3 lazer çizgisine sahip bir konfokal tarama ünitesi FV500 ile donatılmış bir IX81 mikroskobu idi: Ar-Kr (488nm), He-Ne kırmızı (646nm) ve He-Ne yeşil (532nm) ve bir UV diyotu.

  1. Uyarılacak floresan boyaların dalga boylarına bağlı olarak uyarma lazerlerini seçin (Cy5, CD11b için He-Ne kırmızısı; Alexa546, CD68 için He-Ne yeşili ve Hoechst, çekirdekler için UV diyotu).
  2. Işık sinyali toplama için en iyi dikroik ayna kombinasyonunu seçin.
  3. Görüntü çözünürlüğünü en az 800 x 600 piksel olarak ayarlayın.
  4. Epi-floresan kullanarak bir ilgi alanı belirleyin ve büyütmeyi kademeli olarak 40X objektife yükseltin.
  5. Lazer Tarama Mikroskobu (LSM) modalitesine geçin.
  6. Her kanal için fotoçoğaltıcıyı (PMT) ve kazancı ayarlamak için tekrarlayan taramalar yapın. Kurulumu kolaylaştırmak için lazerler ayrı ayrı açılabilir. İstenmeyen, spesifik olmayan sinyalleri önlemek için kazancı mümkün olduğunca düşük tutun.
  7. Tekrarlayan tarama çalışırken, z ekseninin alt ve üst uçlarını tanımlamak için odak kontrolünü hareket ettirin (toplam z ekseni uzunluğu = 10 μm).
  8. Tekrarlayan taramayı durdurun.
  9. Adım boyutunu tanımlayın. Z ekseni üzerinde standart bir 0.225:1 boyut oranı elde etmek için piksel boyutuna (1 μm) mümkün olduğunca yakın olmalıdır.
  10. Kalman filtresini en az 2 kez etkinleştirin.
  11. Taşma efektlerini önlemek için sıralı tarama modunu etkinleştirin.
  12. Z ekseni boyunca yarıya kadar gidin ve bir xy sıralı tarama çalıştırın. PMT ve kazanç kurulumunu kontrol edin (iyi sinyal/gürültü oranı). Tatmin edici değilse, adım 2.6'yı tekrarlayın.
  13. xyz alımını çalıştırın.
  14. Verileri multitiff dosyası olarak dışa aktarın. Her multitiff dosyası tipik olarak 3 renk kanalı (mavi, yeşil ve kırmızı) ve 44 odak düzlemi içerir.

3. Konfokal Edinimlerin Üç Boyutlu Görünümü ve Üç Boyutlu İşleme

Multitiff dosyalarını Imaris yazılımına yükleyin ve aşağıdaki gibi işleyin:

  1. Yazılımı açın.
  2. Aşma görünümünü seçin.
  3. Multitiff dosyasını yükleyin.
  4. Her kanal için istediğiniz rengi seçin.
  5. Ekran ayar panelindeki minimum değeri artırarak arka plandaki gürültüyü kaldırın. Her kanalı ayrı ayrı ayarlayın.
  6. Bölüm görünümüne gidin. Birlikte yerelleştirmeyi (sarı pikseller) aramak için z ekseni boyunca hareket edin.
  7. Z ekseni boyunca kolokalizasyonun mevcut olup olmadığını (yani katı bir nesneye ait olup olmadığını) görmek için sarı bir alana tıklayın. Z ekseni çıkıntıları şeklin sağ ve alt kısmında görülebilir.
  8. Anlık görüntü alın.
  9. Geçiş görünümüne geri dönün.
  10. Bir hücreyi veya hücre kümesini izole etmek için 3B'yi kırpın.
  11. Ekran ayar panelinde bir kanal seçin.
  12. Aşma/yüzeyler algoritması oluşturucusunu seçin. Algoritma adımları:
    1. Kanal seçin.
    2. Eşiği tanımlayın (ekran ayarlama panelinde aynı minimum değeri kullanın).
    3. Yeniden boyutlandırmayı tanımlayın.
    4. Düzgünleştirmeyi tanımlayın (en iyi = 0,200).
    5. Renk görünümünü tanımlayın.
    6. Algoritmayı sonlandırın.
  13. Her kanal için 3.12 adımını tekrarlayın.
  14. Ekran ayar panelinde floresan kanallarının seçimini kaldırın ve üç yüzeyi de seçin.
  15. En iyi görünümü bulmak için sesi hareket ettirin.
  16. Anlık görüntü alın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskemik bölgeye etiketleme protokolleri ve konfokal edinimler gerçekleştirildiğinde elde edilen sonuçların bir örneği Şekil 1A ve 1B'de gösterilmektedir. Elde edilen görüntülerin iki boyutlu bir görünümü, iskemi (A) 'dan yirmi dört saat sonra, lizozomal belirteç CD68'in (yeşil) iskemik çekirdekte bulunan hipertrofik ameboid CD11b hücrelerinde (kırmızı) eksprese edildiğini göstermektedir. Sınır bölgesinde (B) CD11b pozitif hücreler, yuvarlak hücre gövdele...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, M/M fenotip belirteçlerinin iskemik alana lokalizasyonunu ve birlikte ekspresyonunu araştırmak için güçlü bir yaklaşım olarak immünofloresan bazlı protokolleri ve ardından üç boyutlu konfokal analizi sunuyoruz (daha ayrıntılı bir analiz için bkz. ref 6). Bu yöntem, M/M aktivasyonunun ilgili belirtecinin spesifik boyamasını üç boyutlu konfokal görüntüleme ile birleştirir. Antikorların, serumun ve florkonjuge çalışma dilüsyonlarının ince ayarı, araştırılan belirteçlerin optimal sinyal-gürültü oranına izi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stefano Fumagalli, Monzino Vakfı'nın bir üyesidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Ekipman< / güçlü >

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Materials
>Rat Anti-fare CD11bNazikçe Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milano, İtalya
tarafından sağlanmıştır Sıçan Anti-fare CD68 AbD SerotecMCA 1957
Tavşan Anti-fare Ym1 Kök Hücre Teknolojileri1404
H– chst 33342Yaşam teknolojileriH21492
Fare Anti-Nöral Çekirdekleri (NeuN)CHEMICONMAB377
Biyotinillenmiş Keçi Anti-Sıçan antikoruJackson İmmüno Araştırma112-065-143
TSA Siyanin 5 Sistemi Perkin ElmerNEL705A001KT
Uzatma Altın İnvitrojenP36930
Anti-sıçan alexa 546InvitrogenA-11081
Anti fare Alexa 488InvitrogenA-21121
Anti-tavşan Alexa 594InvitrogenA-11037
Normal Keçi SerumuVektörleriLaboratuvarları S-1000
Tritin X-100SigmaT8787
Fosfat Tamponlu SalinSigmaP4417-100
Kriyostat CM1850Leica
Olympus IX81 konfokal mikroskop Olympus
AnalySIS yazılımıOlympus
Imaris yazılımı 5.0Bitplane
Photoshop cs2Adobe Sistemleri
Yazılım paketleri GraphPad Prism sürüm 4.0GraphPad Yazılım A.Ş.
<td colspan="4">

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  2. Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
  3. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
  6. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
  7. Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
  8. Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373(2007).
  9. Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943(2011).
  10. Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
  11. Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
  12. Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nofloresan ProtokolleriCD11b CD68 Ym1Fokal skemi ModeliKal c MCAOImaris G r nt lemeZ ekseni Kazan mArd k Tarama ModuMark r Ko ekspresyon Analizi

İlgili makaleler