Yöntem makalesi

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

DOI:

10.3791/50618

⸱

15 Ekim 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, paralel çok sayıda tek hücre içi biyomoleküllerin nicel tespitine olanak sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunmaktır. Bu amaç için, hücreler, pasif bir microchamber ortasında tutulur. Kontrol katmanı aktivasyonu üzerine, hücre küçük bir oda içinde çevreleyen hacim izole edilir. Çevredeki hacmi daha sonra izole edilmiş hücre etkilemeden değiştirilebilir. Bununla birlikte, haznenin kısa açma ve kapama sırasında, odacık içindeki çözelti birkaç yüz milisaniye içinde değiştirilebilir. Nedeniyle odaların düzelmesi için, hücreler, inkübasyon, yıkama, ve son olarak, hücre erimesi için, örneğin, bir çok kontrol edilebilir bir şekilde farklı çözüm sırayla maruz edilebilir. Sıkıca kapatılmış microchambers, lizat tutulmasını sağlayacak en aza indirmek ve hücre lizi sonrasında seyreltme kontrol eder. Parçalama ve analiz aynı yerde meydana geldiği, yüksek hassasiyet muhafaza edilir, çünkü başka bir danalitlerin ilution veya zarar taşıma sırasında ortaya çıkar. Microchamber tasarım, bu nedenle tek tek hücrelerden salınan hücre içi moleküller (attomoles, zeptomoles) çok küçük kopya numaralarının, güvenilir ve tekrarlanabilir bir analiz sağlar. Ayrıca, birçok microchambers uygun optik aletler izlenmesi için kullanılan göz önüne alındığında, aynı anda bir çok hücre analizini sağlayan bir dizi biçimde düzenlenebilir. Biz zaten hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörlerin ve göreli veya mutlak ölçülebilir şekilde ikinci haberciler analiz etmek proof-of-concept çalışmaları için bir platform kullandık.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçmişte birçok çalışmalar, hücre-hücre geniş bir hücre popülasyonu içinde 1-3 farklılıklar, özellikle sinyal 4 işler ya da bu tür proteinler 5,6, metabolitleri ve kofaktörler gibi hücre içi 7,8 biyomoleküllerin miktarlarını ortaya koymuştur. Bu heterojenliklerdir hücre uyumu ve evrimi 9 için temelde önemli olabilir, ama aynı zamanda kanser 10-13 gibi hastalıkların ortaya çıkması ve tedavisinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu yüzden, tek hücre düzeyinde çalışmalar, bu çalışmalar, biyolojik olarak aktif kimyasal maddeler ile muamele edildikten sonra, farklı hücresi tepkilerini ortaya çıkarmak, özellikle biyolojik ve farmakolojik araştırmalar yüksek ilgi çekmektedir.

Son yıllarda, çok sayıda analitik platformlar tek bir canlı hücrelerin analizi ya da hücre içeriği kimyasal kompozisyona geliştirilmiştir. Floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) altın st ikenandard tek bir canlı hücre çok yüksek verimli analizi için, yöntem, hücre içi veya salgılandığı bileşiklerin miktar tayini için kullanılabilir olamaz. Mikroakışkan platformların ortaya çıkması konumlandırma, tedavi ve tek hücre gözlem için yeni analitik stratejiler söz verdi. Mikroakiskan bir dönüm noktası Quake ve arkadaşları 14,15 tarafından gerçekleştirilen esnek PDMS vanaların entegrasyonu ile ulaşıldı. Onlar yonga üzerinde bölgeleri izole çünkü bu vanalar yararlıdır, örneğin iki kültürü 16 ayrı. Dahası, tek bir hücre analizi için özellikle uygun olan ve bu nedenle de bir analit sulandırma sorunlarını azaltmak için yardımcı olur. Tek hücre analizi için bu yaklaşımın gücü son Hansen ve 17 paralel olarak tek bir hücre yüzlerce gen ekspresyonunu analiz arkadaşları tarafından gösterilmiştir.

Proteinler ve metabolitleri hedeflerken, analiz nedeniyle uygun olmaması için çok zordurmplification yöntemleri, farklı buluşa ait bileşiklerin, kimyasal yapıları ve bunların varyasyonlarının çok sayıda. Ayrıca, çoğu hücre içi biyomoleküller birkaç on bin 18 sırasına göre, düşük kopya sayısında mevcut olması beklenmektedir, bu yüzden, kullanılan analitik yöntem, yüksek bir hassasiyete sahip olmalıdır. Bu tür bağışıklık ve enzim-bağlantılı bağışıklık denemeler (ELISA) gibi daha güçlü deneyleri da birkaç yıkama ve inkübasyon aşaması hem de yüzey immobilizasyon gerektiğinden mikroakışkan cihazlara entegre zordur.

Yaşanan bu zorluklar nedeniyle, bu proteinler ya da metabolitleri tek hücre düzeyinde üzerinde rakama dökülmüştür burada sadece birkaç örnek rapor edilmiş olması şaşırtıcı değildir. Örneğin, floresan bileşikleri salgılaması üzerindeki çalışmalar 19,20 bildirilmiştir. Son zamanlarda, ELISA ile uygulama, bir hücre kültüründen salgılanan (nonfluorescent) protein (THP-1 hücreleri) 21 ve bir (i analizi için sunulmuşturmmune) hücreler 10. Hücre içi proteinleri hedefleyen, Shi et al. Bir bağışıklık 11 vasıtasıyla tümör hücrelerinde sinyal yollarının analizi için hücre içi proteinlerin tanımlanmasını kolaylaştırılmış bir mikroakışkan cihaz geliştirmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin, sadece nispi miktarları tespit edilmiştir ve herhangi bir enzimatik amplifikasyon düşük bolluk proteinleri için sinyali geliştirmek için kullanıldı.

Son zamanlarda, floresan deneyleri 8 ve bağışıklık 22 ile tek-hücre yakalama mikrocihazda (Şekil 1) birleştirmek mümkün. Hücreler pasif arz ve hücrelerin herhangi bir hareketi olmadan orta ve diğer kimyasal maddelerin (hızlı) değişimine izin mikroölçülerdeki engel yapılarda, içinde sıkışıp kalırlar. Her bir tuzak etrafında halka şeklinde bir kapak, çok küçük bir hacme ("microchamber") olarak hücre izolasyonunu sağlar. Bu valf hemen o, bir hücre-yokedici (hypoosmolar) tampon tanıttıktan sonra çalıştırılırnce uzaklaşacak şekilde yayılan moleküllerin hücre içi ya da salgılanan moleküller önler. En önemli olarak, hacim (625 ul) içinde küçük boyutu, moleküllerin büyük bir seyreltme önlenir. Parçalama ve analiz çip aynı pozisyonda yapılmaktadır Bundan başka, taşıma nedeniyle analitlerin kaybı yoktur. Burada açıklanan çip tasarımı 60 microchambers toplam 7 veya 8 ya microchambers 8 alternatif satır içerir. Bir hat boyunca çapraz kontaminasyon engellenir, böylece odalar, sıralar halinde kumanda edilir.

Platform floresan denemelerinde hem de immünolojik tayinler (Şekil 1d) ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Ikincisi için, çip, üretim ve montaj işlemi ile uyumlu olan antikorların, hareketsiz hale getirmek için protokoller kurulmuştur. Dolayısıyla platformu tek hücre düzeyinde, hassas, güvenilir ve ölçülebilir deneyleri için yolu açar. Şimdiye kadar, i analizi için cihaz kullanmıştırntracellular ve salgılanan enzimler (enzim deneyleri ile görece nicel), hücre içi kofaktörler, proteinler ve küçük moleküller (nokta tahlilleri ya da ELISA ile kesin miktar). Aşağıda, microcontact baskı ve yüzey kimyası vasıtası ile çok katmanlı yumuşak litografi ve antikor modelleme için protokol vasıtasıyla çip imalat sürecini tarif eder. Ayrıca, yonga kullanımı ve operasyonların bazı örnekler verilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. SU-8 Asil Fabrikasyon

Aşağıdaki protokole ancak farklı maske desenler ile (şema ve boyutlar Şekil 2 için, akışkan ve kontrol) kanalları için her iki ana kalıp hazırlayın. Bu süreç Şekil 3a'da gösterilmektedir.

  1. 180 ° C'de 10 dakika boyunca 4 inç silikon gofret ısıtılarak Başlangıç Bir spin-lak susuz gofret yükleyin ve spin kaplama SU-8 2015 için aşağıdaki protokol kullanın:
    1. (Dağıtma sonra bu adım, yakın kapak sırasında SU-8 dağıtmak, spin-lak açık kapak) 20 sn boyunca 100 rpm'de gofret Spin.
    2. 10 saniye boyunca 500 rpm'de Spin gofret (bu bütün gofret üzerinde karşı yayar.)
    3. 30 saniye boyunca 1,750 rpm'de Spin gofret (20 um karşı yüksekliğini tanımlar).
  2. Bu aksi takdirde bir sonraki adımda sıcak plaka sopa gibi, aseton (bir bez kullanın) gofretin kenarından karşı çıkarın. Ah gofret aktarın4 dakika boyunca 95 ° C sıcaklıkta otplate. Softbake sonra, (365 nm'de ölçülen 150 mJ / cm 2) UV ışığı ile bir maske hizalayıcısı cam Sodalime bantlanmış bir photomask yoluyla direnmeyi ortaya.
  3. Maruz kaldıktan sonra, bir sıcak plaka üzerinde 5 dakika boyunca 95 ° C'de yeniden gofret ısı. RT'ye gofret soğutun ve daha sonra 4 dakika süreyle SU-8 geliştirici bir banyo içine batırmayın. Kalmayan SU-8 çıkarmak için hafifçe sallayın. Temiz oda dereceli izopropanolle gofret yıkayın ve azot ile kuru darbe. Gelişme (özellikle hücre tuzaklar) başarılı olursa bir mikroskop altında kontrol edin. Hücre tuzakları tamamen geliştirilirse, silikon gofret yansıması görünür olmalıdır. Eğer gerekirse, birkaç dakika boyunca tekrar gofret gelişir.
  4. Tüm çözgen kalıntılarını uzaklaştırmak için 180 ° C'de 2 saat boyunca bir fırın içinde pişirmeye gofret. Bir basamak Profiler ile kanal yüksekliğini kontrol edin. Yüksekliği istenilen yüksekliğe farklıysa, bu protokol yeni bir gofret ile adım 1.1 'de başlayan ve tekrarspin-hızı (adım 1.1.3) değiştirebilirsiniz. 1H, 1H, 2H, gece boyunca bir kurutucu içinde 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silan ile gofret Silanizing ile ana kalıbın imalat tamamlayın.

2. Microcontact Baskı Master İmalatı

  1. Microcontact baskı için ana kalıp hazırlamak için, 180 ° C'de 10 dakika boyunca bir silikon gofret dihidrat (Karşı Silanlanmış yüzeye daha iyi yapışır) 30 saniye boyunca 7,500 rpm'de bu gofret üzerine 1 ml HDMS-kapladıkları Spin. AZ1518 spin-kat 2 ml pozitif bu protokol ile karşı:
    1. Statik Dağıtım gofret direnmek.
    2. 500 rpm'de 5 saniye için gofret Spin.
    3. 4000 rpm'de 60 saniye boyunca gofret Spin.
  2. Bir ocak üzerinde 100 ° C'de 50 saniye softbake sonra, maruz bir photomask boyunca ve bir maske hizalayıcısı UV ışık (365 nm 21 mJ / cm 2) için direnmek. 75 saniye için AZ 726 bir banyosuna karşı geliştirin. DI-su ve darbe d ile geliştirilen gofret durulayınazot ile ry. 50 saniye boyunca 115 ° C de ısıtmak suretiyle gofret, kalan solventin çıkması. Gece boyunca, vakum altında gofret Silanize.

3. Mikroakışkan Chip Fabrikasyon

İki katman cihazın tasarımı, bu deneyler için kullanılır. Çip son olarak bir cam slayt (Şekil 3b) üzerine bağlandığı önceki iki kat, ayrı ayrı hazırlanır ve birbirine bağlanır. Bu adım, PDMS tabakaların üretim ve microcontact baskı için PDMS damga açıklar.

  1. 10:1 'lik bir PDMS karışımı ve bir sertleştirme ajanı hazırlayın. Toplam yaklaşık 80 gr PDMS hazırlayın (bizim tasarımlar kullanılarak, bu 10 cips neden olacaktır). Karışım ücretsiz bubble (~ 30 dk) kadar şiddetle ve hem degas parçaları PDMS karıştırın.
  2. Alt üzerine bir Petri kabı ve bantla bunu iç kontrol katmanı ile gofret yerleştirin. Daha sonra, üstte PDMS ~ 50 g dökün ve tam sağlamak için 80 ° C'de bir fırın içinde en az 2 saat boyunca gofretin koymakPDMS kür. ~ 20 g PDMS gereklidir bunun için, microcontact baskı gofret için aynı işlemi tekrarlayın.
  3. Spin-kat gofret PDMS 2000 rpm'lik bir dönme hızında akışkan tabakası ile yaklaşık 40 mikron yüksek PDMS bir tabaka oluşturmak için. 80 ° C'de en az 1 saat boyunca bir fırın içinde PDMS Cure
  4. Iki parça tedavi zaman, gofret, kontrol tabakası kaldırmak ve bir tıraş bıçağı ile parçalar halinde kesilir. 1 mm biyopsi zımba kullanılarak basınç bağlantısı delikler. Depolama için, bu kanal üzerinden bir bant parçası koymak için tavsiye edilir.
  5. Iki kat bağ için, spin-kaplı gofret ve üst kısmı almak ve bir plazma temizleyici 23 yerleştirin. Plazma muameleden sonra, hızlı bir şekilde büyük bir çalışma mesafesi bir mikroskop altında her iki parça hizalayın. Yerleştirilen üst parçaların etrafında bazı yedek PDMS ekleyin. Bu adım, ancak bu gofret PDMS kaldırılmasını kolaylaştırır, zorunlu değildir. En az 1 saat boyunca 80 ° C'de bir fırın içinde gofretin yerleştirin.
  6. Dikkatli gofret PDMS kaldırmak ve mikroçip kesmek için bir neşter kullanın. 1.5 mm biyopsi zımba ile akışkan bağlantıları için erişim delikler.
  7. PDMS çip şimdi bitti ve ay boyunca saklanabilir. İsteğe bağlı: çip bir rezervuar ile kullanılırsa, 200 ul pipet üst kısmını kesip üstüne yapıştırmak için bazı yedek, yarı işlenmiş PDMS kullanabilirsiniz. En az 1 saat boyunca 80 ° C'de yeniden fırında çipi koyun.

4. Cam Slide Bonding

Direkt enzimatik tahliller için cihazı kullanmak için, yapıştırma sonra gerekli tek adım yüzeylerin engelleme olduğunu. Bu protokol için, immünodeneyler veya ELISA'lan için mikroakışkan çipi kullanmak Ancak, A. geçin, sadece (yani TIRF mikroskopi veya SPR'nin için) cam slayt bağlanma sitelerini sınırlandırmak için protokol B başvurun. Bu kısıtlama önemli değilse, A'ya bakınız, ancak adım 4.3 biotinli konjugatlarını kullanın ve adım 4.8 ile devam edinProtokol B tamamen işlevsel bir yüzey oluşturmak için.

Önceki protokol A ve B gerçekleştirmeden: Bu önce çipin içine tanıtmak için kullanılan protein tüm çözümleri filtre tavsiye edilir. Moloz ve protein agregatları, aksi böylece analiz için kullanılabilir bölmelerin sayısını azaltarak, hücre tuzakları engelleyebilir. Bu amaç için, kanalların içine verilmeden önce bütün çözümler filtre protein olmayan adsorbe edici bir filtre birimi kullanır.

Protokol A (enzim tahlilleri)

  1. Mikroakışkan cihaz sonuçlandırmak için, bir cam slayt üzerine PDMS parçaları bağ. Bunu yapmak için, önce sabun, damıtılmış su ve etanol ile bir cam slayt temizleyin. , Bir nitrojen akışı kullanılarak slayt kurutun. Seloteyple PDMS kısmını temizleyin.
  2. Sıkı bir bağ temin etmek için 18 W da 45 saniye boyunca plazma temizleyici içine PDMS bölümü ve temizlenmiş cam slayt bir ifadeyle, 5 dakika boyunca bir sıcak levha (100 ° C) üzerindeki çip koydu.
  3. Bağlamadan sonra, f çip doldurunLUIDs. Bunu başarmak kolay bir yolu merkezkaç kuvvet kullanmaktır. 200 ul pipet ucunun alt kısmı kesilir. Akışkan kanal için, bloklama çözeltisi ile doldurun (sığır serum albümini (% 4 a / h) ya da poli-L-lizin) aşılanmış polietilen glikol (0.05% w / v) ve girişleri içine ipuçları yerleştirin. Su ile veya bir isosmotic çözelti, örneğin, PBS ile kontrol katmanı girişleri doldurun. 5 dakika boyunca santrifüj (800 x g) içine çip yerleştirin. Kanallar artık tamamen sıvı ile dolu olmalıdır. Eğer değilse, bu adımı tekrarlayın.
  4. , Oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca bloke çözeltisi inkübe edin. Bir şırınga pompası kullanılarak 10 ul / dk 'lık bir akış hızında PBS ile sıvı tabakanın dışarı çözeltisi yıkayın. Cihaz artık cep deneyler için hazır.

Protokol B (bağışıklık)

Itibaren aşama 4,7 yüzey modifikasyonu tam bir genel bakış için, Tablo 1'e bakınız.

  1. IçindeBir bBSA / BSA çözeltisi (örneğin 1-100) ile microcontact baskı için cubate PDMS pulları. 30 dakika sonra damıtılmış su ile iyice pulları temizlemek ve bir nitrojen akışı altında pul kurutun. Hızlı bir şekilde temizlenmiş cam slayt (Şekil 4) damgaları yerleştirin.
  2. Birlikte, bir plazma temizleme maksimum güç (W 18) 45 saniye boyunca oksijen plazma mikroakışkan çip üst kısmı ile damga ile cam slayt Açığa. Plazma tedaviden sonra, damga kaldırmak ve cihazın microchambers altında yazdırılan yüzeye hizalamak. 50 ° C 'de sıcak bir plaka üzerinde 30 dakika boyunca çip yerleştirin
  3. Geri kalan yüzeyi engellemek için, santrifüj ile yonga içine steril olarak filtre edilmiş BSA çözeltisi (% 4 (w / v) PBS içinde) (adım 4.2) tanıtmak. 1 saat boyunca inkübe edilir ve PBS ile akışkan tabaka (adım 4.3) üzerinden çözeltisi yıkayın. Çip, daha sonra bir nemli kutu içinde 4 ° C'de doğrudan kullanılabilir ya da 2 haftaya kadar saklanabilir.
  4. Tamamen işlevsel bir bağlanma için Surface, rezervuar, streptavidin (0.025% (w / v) PBS içinde) sunar. Akışkan kanallardan avidin çözeltisi çekilme 30 dakika boyunca 5 ul / dk 'lık bir akış hızı kullanarak. Daha sonra, 10 dakika boyunca PBS yıkayın. Iyice rezervuar durulayın.
  5. Daha sonra, Protein G (% 0.0025 (w / v) PBS içinde) ve diğer bir 30 dakika boyunca çalkalama ekleyin. Daha sonra başka bir 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Daha sonra, 10 dakika süre ile, ilgi konusu antikoru (% 0.0001 (w / v) PBS içinde) ilave edin. 10 dakika sonra, bağlayıcı izin vermek için 15 dakika boyunca akışını durdurmak. Daha sonra, 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın.

5. Hücre Deneyler

Protokol nedeniyle olası tahlillerinin çeşitli genel olarak yazılmıştır. Bir örnek olarak, G6PDH toksisite deneyi için gerekli olan reaktif maddeler verilir. Cihazın ilk hücre hapsi verimi yani 200 hücre üzerinden 5 tuzağa olacak,% 2.5 civarındadır. Hücre tuzakların son doluluk kuvvetle kullanılan hücre hattı, askıya protokole bağlıdırhücre soyu ve zaman hücreler kanalı ile temizlendi. Doğal (örneğin, U937 gibi) süspansiyon içinde büyüyen hücreler için, tek hücreler, bir kaç dakika sonra, odalar yaklaşık% 75 bulunabilir. Diğer odalar ya da dolu ya da iki ya da daha çok hücre tarafından işgal edilmez. Genel olarak, tek hücreli bir kişi yapışık hücre çizgileri için daha küçüktür. Burada yer alan oldukça hafif süspansiyon protokolünü kullanırken, yüzde (HEK MLT hücreleri) yaklaşık% 30 azalır. Tek hücreli bir kişi, hücrelerin tripsin muamelesi ile artırılabilir, ama bu da deneylerin sonuçlarını değiştirebilir.

Hedef moleküle bağlı olarak, PDMS adsorpsiyon ya da emme sonuçlarını etkileyebilir. Adsorpsiyon BSA veya PLL-PEG-g ile yüzeylerin bloke ederek azaltılabilir. Emilim en hidrofilik biyomoleküllere için olası değildir, ancak (küçük) lipofilik hücre bileşenleri için kontrol edilmelidir.

  1. Özel protokole göre hücreleri hazırlayın (örneğin, ilaç eklenmesi). Süspansiyon hücreleri için, çip doğrudan hücreler ekleyin. Yapışkan hücre hatları, bir hücre süspansiyonu üretmek için enzim içermeyen ayrışma tampon kullanın. Hücre kümelerinin miktarını azaltmak üzere çipe tanıtarak önce hücreler filtre.
  2. , Bir şırınga pompası ve ileri akış kullanılarak çip üzerine hücreleri yük yerine, hücre süspansiyonu çekilme. Kanal duvarlarına hücre spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için bu yana yapışkan hücreler için süspansiyon hücre hatları ve 10-20 | il / dk 'lık yüksek akış oranları için 5 ul / dk' lık bir akış hızı kullanarak.
  3. Trans dolu olduğunda, odacıkları kapatın. Birçok hücre yüzeyine spesifik olmayan yapışma ise, 10-30 ul / dk 'lık bir akış oranında hücre ayrışma tamponu ile aşındırmak deneyin.

Protokol A (enzim tahlilleri)

  1. Yongası ile lizis tamponu çekiniz. Bu örnek için, bu tampon ilave Tween 20 (10 mM Tris-HCI, 10 ile bir hypoosmolar tampondurmM KCI, 1.5 mM MgCI2, 1% (v / v) Tween 20). Liziz için, hızlı bir şekilde açılır ve kapanır bölmeleri (örneğin 10-50 ul / dak 7,21 akış oranları için 500 msn). G6PDH deneyi için, 2 mM glikoz-6-fosfat, 0.5 mM NADP, 0.5 U / ml diaforaz ve lizis tamponuna 0.3 mM resazurin ekleyin. Liziz hemen sonra kinetik reaksiyon izleme başlatın.

Not: tahlil için uygun olan herhangi bir tampon seçin (Triton, SDS) gibi güçlü deterjanlar lyse hücreler hemen ve oda açılması sırasında analit kaybına yol açacaktır aklınızda ancak çıplak.

Protokol B (bağışıklık)

ELISA hücre deneylerinde (debileri, oda durumu, vb) kısa bir açıklama için, Tablo 1'e bakınız.

  1. ELISA için, doğrudan liziz tamponu için gerekli saptama reajanı (ör. ikincil antikor, etiketli antijen) ekleyin. Bu tarifnamede Twee eklendin 20 spesifik olmayan adsorpsiyon azaltır. 5.4 aşamasına göre Lyse hücreler. (Kullanılan antijen ve antikor bağlı inkübasyon süresi) bağlanmaya imkan vermek için 10-15 dakika için karışımın inkübe edin.
  2. Kanal duvarlarına spesifik olmayan adsorbe antikor enzim konjugatları, halihazırda hazne ve kanal içindeki saptama reaktif bir dönüşüme yol açabilir. Bu emilmesidir sorunların azaltılması (saptama reaktif maddesi ilave edilmeden önce, oda kapalı) inkübasyon süresi esnasında yongası ile kullanılan algılama enzim inhibitörü, bir sürekli temizleme için. HRP için, kalıcı olarak spesifik olmayan bir adsorbe edilen enzimleri inaktive etmek için su içinde 20 mM HCl kullanımı.
  3. İnkübasyon süresinden sonra, çip, deteksiyon reajanı (örneğin, Amplex Red ve HRP için hidrojen peroksit) sunar. Uzakta nonbound ikincil antikor yıkamak için kısa bir süre tekrar odaları açın ve algılama reaktifi ekleyin. Hemen kinetik reaksiyon izleme başlatın.
  4. Kalibrasyon: hareketsizilgi konusu hedef karşı antikor. Yakın odaları. Tampon maddesi içinde ya da off-çip hücre lizatı analit farklı konsantrasyonlarda hazırlayın. Çipine bir konsantrasyon uygulayın ve hızlı bir şekilde odalarına (açılış saati 500 msn) iç hacmi değişimi. Bu açılma süresi ek bir birikimi meydana gelir analit yıkama sağlamak için yeterince kısa ve microchamber hacminden moleküllerin sadece bir belirli sayıda tespit edilir. Çözelti içindeki antijenin bilinen konsantrasyon ve odacığın hacminin (625 pl) itibaren, bölmenin içindeki miktarını hesaplar. Daha sonra, adım 5.5 ile devam edin ve algılama parçasını tanıtmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim platformu içinde mevcut ya da tek hücreleri tarafından üretilen bir hücre içinde çeşitli yanı sıra salgılanmış molekülleri analiz edebilmektedir. Burada, olası deneylerin çeşitliliği vurgulamak için farklı bir örnek çalışmalar sunmak istiyorum. Bir salgılanmış bir enzim (Şekil 5a) ve hem de bir hücre içi enzim (Şekil 5b) ve protein (Şekil 5c ve d) için bir örnek verir. Böyle cofactors veya küçük moleküller gibi daha fazla örnek için, Eyer ve d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroakiskan teknoloji tek-hücre analizi için yeni ve ilginç olanaklar açtı. Özellikle, tuzak olasılığı ve mikroakışkan araçları hücreleri tek tek hareketsiz tek hücre özellikleri ve tepki üzerine sistematik kısa ve uzun vadeli çalışmalar izin verdi. Buna ek olarak, bir mikro çip üzerinde oluşturulan mikro damlacıkların yüksek frekans, hücrelerin kapsüllenmesi, geleneksel sitometrisi cihazlarla gerçekleştirilemez tek hücre salgısı çalışmalar, sağladı. Mikrodamlacık yaklaşım, ancak, inkübasyon ve yıkama adımları analitik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar minnetle el yazması, özel yapılmış basınç kontrol sisteminin yapımı için C. BÄRTSCHI ve H. Benz prova okuma Tom Robinson kabul. Biz de temiz oda tesisi İLK ve hem ETH Zürich Işık Mikroskopi Merkezi (LMC) kullanımını kabul etmek istiyorum. Çalışma 7. Çerçeve Programı (ERC Grant başlayarak, proje yok. 203.428, nμLIPIDs) altında Merck Serono ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
REAGENTS:
ReaktifŞirketininKatalog NumarasıYorumlar (isteğe bağlı)
SU-8 2015MicroChem Corp. (Netwon, MA)na.1H,1H,2H,2H-Perflorodesil-dimetilkloro-silan
ABCR (Karlsruhe, Almanya)AB103608
4-Metilumbelliferil β-DN,N′-diasetilkiyosit hidratSigma AldrichM9763
AsetonMerck VWR (Darmstadt, Almanya)100014
AvidinAppliChem (Axon Lab AG)A-2568
AZ 1518AZ Elektronik Malzemeler (Wiesbaden, Almanya)n.a.AZ
726 geliştiriciAZ Elektronik Malzemeler (Wiesbaden, Almanya)n.a.
Sığır serum albüminiSigma AldrichA-4503
Sığır serum albümini, biotinSigma AldrichA-8549
Hücre ayrışma tamponuInvitrogen13151-014
Heksametildisilazan (HDMS)Sigma Aldrich40215
Hidroklorik asitFluka84422
İzopropanolMerck VWR (Darmstadt, Almanya)109634
Magnezyum klorür hekzahidratFluka63068
MR developer 600Microresist technology GmbH (Berlin, Almanya)n.a.PBS
Invitrogen10010-031
PLL-g-PEG aşılıSuSoS, (Dü bendorf, İsviçre)n.a.PLL-g-PEG
aşılı biotinSuSoS, (Dü bendorf, İsviçre)n.a.Potasyum
klorürFluka60132
Protein G, biotinSigma İnce Kimyasallar41624
Silikon gofretSi-Mat (Kaufering, Almanya)n.a.Sylgard
184 Silikon Elastomer Kiti (PDMS)Dow Corning39100000
Tris(hidroksimetil)-aminometanBiorad
Tween 20Biorad1706531
EKİPMANLAR: < / strong>
MalzemeAdı Şirket Katalog NumarasıYorumlar (isteğe bağlı)
0.22 &; m PES şırınga filtresiTRP99722
1/1.5 mm biyopsi zımba Miltex, York PA33-31AA/33-31A
Hücre Trics filtresi 20 ve mikro; mPartec04-004-2325
Santrifüj Sigma 3-18KKuehnern.a.Hotplate
HP 160 III BMSawatec, Sax, İsviçren.a.MA-6
maske hizalayıcıKarl Suessn.a.Multizoom
AZ100M mikroskopNikon Corporationn.a.Photomask
Microlitho, Essex, Birleşik Krallıkn.a
Plazma Temizleyici PDC-32GHarrickn.a.Spin
kaplayıcı Modell WS-400 BZ-6NPP/LITELaurelln.a.Spin
Modülleri SM 180 BMSawatec, Sax, İsviçren.a.Step
profil oluşturucu Dektak XT AdvancedBrukern.a.Şırınga
pompası neMESYSCetonin.a.
Adı 1610716

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Microfluidic ChipSingle Cell AnalysisCell LysisFluorescence MicroscopyImmunoassay DetectionFluidic ControlPDMS FabricationChamber TrappingSolution ExchangeBiomolecule Quantification

İlgili makaleler