Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Summary

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Abstract

Biz, paralel çok sayıda tek hücre içi biyomoleküllerin nicel tespitine olanak sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunmaktır. Bu amaç için, hücreler, pasif bir microchamber ortasında tutulur. Kontrol katmanı aktivasyonu üzerine, hücre küçük bir oda içinde çevreleyen hacim izole edilir. Çevredeki hacmi daha sonra izole edilmiş hücre etkilemeden değiştirilebilir. Bununla birlikte, haznenin kısa açma ve kapama sırasında, odacık içindeki çözelti birkaç yüz milisaniye içinde değiştirilebilir. Nedeniyle odaların düzelmesi için, hücreler, inkübasyon, yıkama, ve son olarak, hücre erimesi için, örneğin, bir çok kontrol edilebilir bir şekilde farklı çözüm sırayla maruz edilebilir. Sıkıca kapatılmış microchambers, lizat tutulmasını sağlayacak en aza indirmek ve hücre lizi sonrasında seyreltme kontrol eder. Parçalama ve analiz aynı yerde meydana geldiği, yüksek hassasiyet muhafaza edilir, çünkü başka bir danalitlerin ilution veya zarar taşıma sırasında ortaya çıkar. Microchamber tasarım, bu nedenle tek tek hücrelerden salınan hücre içi moleküller (attomoles, zeptomoles) çok küçük kopya numaralarının, güvenilir ve tekrarlanabilir bir analiz sağlar. Ayrıca, birçok microchambers uygun optik aletler izlenmesi için kullanılan göz önüne alındığında, aynı anda bir çok hücre analizini sağlayan bir dizi biçimde düzenlenebilir. Biz zaten hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörlerin ve göreli veya mutlak ölçülebilir şekilde ikinci haberciler analiz etmek proof-of-concept çalışmaları için bir platform kullandık.

Introduction

Geçmişte birçok çalışmalar, hücre-hücre geniş bir hücre popülasyonu içinde ^1-3 farklılıklar, özellikle sinyal ⁴ işler ya da bu tür proteinler ^5,6, metabolitleri ve kofaktörler gibi hücre içi ^7,8 biyomoleküllerin miktarlarını ortaya koymuştur. Bu heterojenliklerdir hücre uyumu ve evrimi ⁹ için temelde önemli olabilir, ama aynı zamanda kanser ^10-13 gibi hastalıkların ortaya çıkması ve tedavisinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu yüzden, tek hücre düzeyinde çalışmalar, bu çalışmalar, biyolojik olarak aktif kimyasal maddeler ile muamele edildikten sonra, farklı hücresi tepkilerini ortaya çıkarma....

Protocol

1.. SU-8 Asil Fabrikasyon

Aşağıdaki protokole ancak farklı maske desenler ile (şema ve boyutlar Şekil 2 için, akışkan ve kontrol) kanalları için her iki ana kalıp hazırlayın. Bu süreç Şekil 3a'da gösterilmektedir.

1. 180 ° C'de 10 dakika boyunca 4 inç silikon gofret ısıtılarak Başlangıç Bir spin-lak susuz gofret yükleyin ve spin kaplama SU-8 2015 için aşağıdaki protokol kullanın:
   1. (Dağıtma sonra bu adım, yakın kapak sırasında SU-8 dağıtmak, spin-lak açık kapak) 20 sn boyunca 100 rpm'de gofret Spin.
   2. 10 saniye boyunca 500 rpm'de Spin gofret (bu bütün gofret üzerinde ka....

Results

Bizim platformu içinde mevcut ya da tek hücreleri tarafından üretilen bir hücre içinde çeşitli yanı sıra salgılanmış molekülleri analiz edebilmektedir. Burada, olası deneylerin çeşitliliği vurgulamak için farklı bir örnek çalışmalar sunmak istiyorum. Bir salgılanmış bir enzim (Şekil 5a) ve hem de bir hücre içi enzim (Şekil 5b) ve protein (Şekil 5c ve d) için bir örnek verir. Böyle cofactors veya küçük moleküller gibi daha fazla örnek için, Eyer ve d.......

Discussion

Mikroakiskan teknoloji tek-hücre analizi için yeni ve ilginç olanaklar açtı. Özellikle, tuzak olasılığı ve mikroakışkan araçları hücreleri tek tek hareketsiz tek hücre özellikleri ve tepki üzerine sistematik kısa ve uzun vadeli çalışmalar izin verdi. Buna ek olarak, bir mikro çip üzerinde oluşturulan mikro damlacıkların yüksek frekans, hücrelerin kapsüllenmesi, geleneksel sitometrisi cihazlarla gerçekleştirilemez tek hücre salgısı çalışmalar, sağladı. Mikrodamlacık yaklaşım, ancak, inkübasyon ve yıkama adımları analitik.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS:
Reaktif	Şirketinin	Katalog Numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	na.1H,1H,2H,2H-Perflorodesil-dimetilkloro-silan
	ABCR (Karlsruhe, Almanya)	AB103608
4-Metilumbelliferil β-DN,N′-diasetilkiyosit hidrat	Sigma Aldrich	M9763
Aseton	Merck VWR (Darmstadt, Almanya)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Elektronik Malzemeler (Wiesbaden, Almanya)	n.a.AZ
726 geliştirici	AZ Elektronik Malzemeler (Wiesbaden, Almanya)	n.a.
Sığır serum albümini	Sigma Aldrich	A-4503
Sığır serum albümini, biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Hücre ayrışma tamponu	Invitrogen	13151-014
Heksametildisilazan (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Hidroklorik asit	Fluka	84422
İzopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Almanya)	109634
Magnezyum klorür hekzahidrat	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Almanya)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG aşılı	SuSoS, (Dü bendorf, İsviçre)	n.a.PLL-g-PEG
aşılı biotin	SuSoS, (Dü bendorf, İsviçre)	n.a.Potasyum
klorür	Fluka	60132
Protein G, biotin	Sigma İnce Kimyasallar	41624
Silikon gofret	Si-Mat (Kaufering, Almanya)	n.a.Sylgard
184 Silikon Elastomer Kiti (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hidroksimetil)-aminometan	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
EKİPMANLAR: < / strong>
Malzeme		Adı Şirket Katalog Numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
0.22 &; m PES şırınga filtresi	TRP	99722
1/1.5 mm biyopsi zımba Miltex	, York PA	33-31AA/33-31A
Hücre Trics filtresi 20 ve mikro; m	Partec	04-004-2325
Santrifüj Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Hotplate
HP 160 III BM	Sawatec, Sax, İsviçre	n.a.MA-6
maske hizalayıcı	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M mikroskop	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, Birleşik Krallık	n.a
Plazma Temizleyici PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
kaplayıcı Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Spin
Modülleri SM 180 BM	Sawatec, Sax, İsviçre	n.a.Step
profil oluşturucu Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Şırınga
pompası neMESYS	Cetoni	n.a.