Yöntem makalesi

İnsan THP-1 Makrofajlarında Candida glabrata'nın Hücre İçi Davranışını İncelemek İçin İn vitro Sistemin Kurulması

DOI:

10.3791/50625

⸱

10 Aralık 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Fungal Pathogenesis, Centre for DNA Fingerprinting and Diagnostics, Andhra Pradesh, India, 2Current location: VIB Department for Molecular Biomedical Research, UGent, Fiers-Schell-Van Montagu Building, Technologiepark 927, B-9052 Ghent (Zwijnaarde), Belgium

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, mantar virülans mekanizmaları hakkındaki bilgimizi ilerletmek için yararlı bir araç olacak olan fakültatif bir hücre içi insan mantar patojeni Candida glabrata'nın insan makrofajları ile etkileşimini incelemek için bir in vitro hücre kültürü model sistemi oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir hücre kültürü model sistemi, konakçı çevresel koşulların yakın bir taklidi ise, mikrobiyal patojen enfeksiyonunun belirli bir basamağının incelenmesi için hayvan model sistemlerine ucuz, tekrarlanabilir ve kolayca manipüle edilebilir bir alternatif olarak hizmet edebilir. Phorbol ester tedavisi üzerine makrofajlara farklılaşan bir insan monositik hücre hattı THP-1, daha önce Mycobacterium tuberculosis dahil olmak üzere birçok hücre içi patojenin virülans stratejilerini incelemek için kullanılmıştır. Burada, fırsatçı bir insan mayası patojeni Candida glabrata'nın konakçı fagositik hücrelerle etkileşimini tanımlamak için THP-1 makrofajlarını kullanan bir in vitro hücre kültürü model sistemini yürürlüğe koymak için bir protokolü tartışıyoruz. Bu model sistem basit, hızlı, yüksek verimli mutant ekranlara uygundur ve karmaşık ekipman gerektirmez. Tipik bir THP-1 makrofaj enfeksiyonu deneyi, geri kazanılan hücre içi mayanın koloni oluşturan birim bazlı canlılık analizi için zengin ortamda büyümesine izin vermek için yaklaşık 24-48 saat sürer. Diğer in vitro model sistemler gibi, bu yaklaşımın olası bir sınırlaması, elde edilen sonuçların insan konakçıda bulunan oldukça karmaşık bir bağışıklık hücresi devresine ekstrapolasyonunun zorluğudur. Bununla birlikte, buna rağmen, mevcut protokol, bir mantar patojeninin antimikrobiyal yanıttan kaçınmak / karşı koymak ve konakçı bağışıklık hücrelerinin besin açısından fakir ortamında hayatta kalmak, uyum sağlamak ve çoğalmak için kullanabileceği stratejileri aydınlatmak için çok yararlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida türleri, bağışıklığı baskılanmış hastalarda yaşamı tehdit eden invaziv mantar enfeksiyonlarının önde gelen nedenidir1. Ortaya çıkan bir nozokomiyal patojen olan Candida glabrata, coğrafi konuma bağlı olarak Yoğun Bakım Ünitesi hastalarından en sık izole edilen ikinci veya üçüncü Candida türüdür1-3. Filogenetik olarak, haploid tomurcuklanan bir maya olan C. glabrata, patojenik olmayan model maya Saccharomyces cerevisiae ile patojenik Candida spp. C. albicans4 dahil. Bununla tutarlı olarak, C. glabrata çiftleşme, salgılanan proteolitik aktivite ve morfolojik plastisite4-5 dahil olmak üzere bazı temel mantar virülans özelliklerinden yoksundur.

C. glabrata hif oluşturmamasına rağmen, murin ve insan makrofajlarında6-8 hayatta kalabilir ve çoğalabilir, bu da benzersiz patogenez mekanizmaları geliştirdiğini düşündürmektedir. C. glabrata'nın besin açısından fakir hücre içi makrofaj ortamında hayatta kalmak ve konakçı bağışıklık hücreleri tarafından oluşturulan oksidatif ve oksidatif olmayan konak tepkilerine karşı koymak için kullandığı stratejiler hakkında sınırlı bilgi mevcuttur5. İlgili bir makrofaj model sistemi, C. glabrata'nın konakçı fagositik hücrelerle etkileşimini fonksiyonel genomik ve proteomik yaklaşımlarla tanımlamak için bir ön koşuldur. Sırasıyla insan ve murin kökenli periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler), daha önce C. glabrata'nın konakçı bağışıklık hücreleri ile etkileşimini incelemek için kullanılmıştır7,9. Bununla birlikte, PBMC'lerin ve BMDM'lerin elde edilmesindeki zorluk, sınırlı ömürleri ve farklı memeli donörleri arasındaki içsel varyasyon, bu hücrelerin çok yönlü model sistemler olarak kullanımını kısıtlamaktadır.

Burada, insan monositik hücre hattı THP-1'den türetilen makrofajlarda C. glabrata hücrelerinin hücre içi davranışını incelemek için bir in vitro sistemin kurulması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolün genel amacı, konakçı-mantar patojen etkileşiminin farklı yönlerini incelemek için kolayca manipüle edilebilen basit, ucuz, hızlı ve tekrarlanabilir bir hücre kültürü model sistemini yürürlüğe koymaktı.

THP-1 hücreleri daha önce bakteriler, virüsler ve mantarlar10-12 dahil olmak üzere çok çeşitli patojenlere karşı konakçı bağışıklık tepkisini deşifre etmek için kullanılmıştır. Monositik THP-1 hücrelerinin bakımı kolaydır ve forbol ester tedavisi üzerine, insanın monosit türevli makrofajlarını taklit eden ve uygun makrofaj belirteçlerini eksprese eden makrofajlara ayırt edilebilir13. THP-1 makrofaj model sisteminin temel avantajları, kullanım kolaylığı ve karmaşık ekipman gereksiniminin olmamasıdır.

Burada sunulan protokol, diğer insan mantar patojenlerinin konakçı bağışıklık hücreleri ile etkileşimini incelemek için kolayca uyarlanabilir. Mevcut prosedür, yüksek verimli mutant ekranlar kullanarak ilgilenilen patojen için virülans faktörlerini belirlemek için de kullanılabilir. Bu kavram kanıtı, insan makrofajlarında C. glabrata'nın hayatta kalması için gerekli olan 56 genin bir setini tanımlamak için THP-1 kültür model sisteminin başarılı bir şekilde kullanılmasıyla örneklenmiştir8.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. glabrata enfeksiyon deneylerinin biyogüvenlik muhafaza seviyesi 2 (BSL-2) olan bir laboratuvarda yapılması önerilir.

  1. THP-1 makrofaj tek tabakasının hazırlanması.
  2. C. glabrata hücre süspansiyonunun hazırlanması.
  3. THP-1 makrofajlarının C. glabrata hücreleri ile enfeksiyonu.
  4. Koloni oluşturan birim testi ile fagositoz hızı ve hücre içi replikasyonun ölçülmesi.
  5. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak hücre içi replikasyonun izlenmesi.

1. THP-1 Makrofaj Tek Tabakasının Hazırlanması

  1. THP-1, akut monositik lösemi14'ten muzdarip 1 yaşındaki bir erkek çocuğun periferik kanından türetilen bir insan monositik hücre hattıdır. Bir süspansiyon hücre hattı olan THP-1, %10 FBS (fetal sığır serumu) ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamında nemlendirilmiş %5 CO2'de rutin olarak 37 ° C'de tutulur. Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA, bir forbol ester) ile tedavi, THP-1 monositik hücrelerin makrofajlara terminal farklılaşmasına neden olur. Daha da önemlisi, PMA tedavisi hücre canlılığını etkilemez ve farklılaşmış hücreler bölünmez.
  2. RPMI-1640 tam ortamında (% 10 serum, 2 mM glutamin ve 1x antibiyotik ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamı) 100 mm'lik kültür kaplarında yaklaşık 1.5 x10 6 THP-1 monositlerini tohumlayın ve hücrelerin 2 gün boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de büyümesine izin verin.
  3. THP-1 hücreleri 8 x 105 hücre / ml yoğunluğa ulaştığında, kültür kabını hücre kültürü laminer akış başlığına aktarın ve çökelmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe döndürün.
  4. Hücre süspansiyonunu pipetleyin, 15 ml'lik steril bir tüpe yerleştirin ve 1.000 rpm'de (130 x g) 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve THP-1 hücre peletini 5 ml taze, önceden ısıtılmış, RPMI-1640 tam ortamda askıya alın.
  5. Hücreleri bir hemositometre ile numaralandırın ve hücre süspansiyonunu önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortam ile 106 hücre / ml'lik bir nihai yoğunluğa seyreltin
  6. 10 ml THP-1 hücre süspansiyonuna (son konsantrasyon 16 nM) 1 μl 160 mM PMA stoğu (forbol 12-miristat 13-asetat çözeltisi) ekleyin ve iyice karıştırın. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 1 ml hücre süspansiyonu dağıtın ve 12 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutulan inkübatörde inkübe etme plakası
    7. .
  7. Eski ortamı çıkarın, 1 ml önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortam ekleyin ve hücrelerin% 5 CO2'de 37 ° C'de 12 saat iyileşmesine izin verin.
  8. Süspansiyondaki oval şekilli THP-1 monositik hücrelerin düzleştirilmiş, iğ şeklinde ve yapışık makrofajlara farklılaştığından emin olmak için hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Bu farklılaşmış hücreler artık C. glabrata enfeksiyon çalışmalarını yürütmeye hazırdır.

2. C. glabrata Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

C. glabrata vahşi tip suşu Bg2, THP-1 makrofajlarını enfekte etmek için kullanılacaktır. C. glabrata hücreleri rutin olarak sıvı YPD (Maya özütü (% 1) -Pepton (% 2) -Dekstroz (% 2)) ortamında kültürlenir. Katı YPD besiyeri, orta otoklavlamadan önce %2 agar ilave edilerek hazırlanır.

  1. Bir C. glabrata kültürü hazırlamak için, steril, tek kullanımlık bir halka ile agar plakasından tek bir koloni alın ve 10 ml YPD sıvı ortama aşılayın ve 30 ° C'de çalkalanarak (200 rpm) 14-16 saat inkübe edin.
  2. Bu kültürü (1 ml) 4.000 rpm'de (1.800 x g) 5 dakika boyunca masa üstü mikrosantrifüjde santrifüjleyin, hücreleri steril PBS (fosfat tamponlu salin, pH 7.4) ile üç kez yıkayın ve hücre peletini 1 ml PBS'de askıya alın.
  3. C. glabrata hücre süspansiyonunun OD600'ünü ölçün ve 2 x 106 hücre / ml (OD600 = 0.1) yoğunluk elde etmek için uygun hacimde steril PBS ile seyreltin. Alternatif olarak, bir hemositometre kullanılarak maya hücreleri sayılarak istenen hücre yoğunluğu elde edilebilir.

3. THP-1 Makrofajlarının C. glabrata Hücreleri ile Enfeksiyonu

  1. 0.1'lik bir MOI (enfeksiyon çokluğu) elde etmek için THP-1 makrofajlarına (24 oyuklu bir kültür plakasının oyuğu başına ekilen 10,6 hücre) 50 μl C. glabrata hücre süspansiyonu ekleyin ve plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
  2. Canlı maya sayımlarını belirlemek için, 50 μl C. glabrata hücre süspansiyonunu steril PBS'de 100 kat seyreltin ve YPD katı ortamında 100 μl plakayı seyreltin. Plakaları 30 ° C'de inkübe edin ve 1-2 gün sonra ortaya çıkan maya kolonilerinin sayısını manuel olarak sayın. Bu sayılar bundan böyle 0 saat C. glabrata CFU'ları (koloni oluşturan birimler) olarak anılacaktır.
  3. THP-1 hücrelerinin C. glabrata hücreleri ile 2 saat birlikte kültürlenmesinden sonra, 24 oyuklu doku kültürü plakasını bir rezervuarda ters çevirerek kültür ortamını atın ve fagositozlu hücre dışı C. glabrata hücrelerini çıkarmak için önceden ısıtılmış steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın. THP-1 makrofaj tek tabakasına herhangi bir zarar vermeden tüm hücre dışı mayaların tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için PBS ile nazik yıkamalar kesinlikle gereklidir.

4. Koloni Oluşturan Birim Testi ile Fagositoz Hızının ve Hücre İçi Replikasyonun Ölçülmesi

  1. Lyse C. glabrata, THP-1 makrofajlarını 1 ml steril H 2O'da2 dakika boyunca enfekte etti, makrofaj kalıntılarını kuyudan çıkarmak için hafifçe kazıyın ve hücre lizatını bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Tam makrofaj lizizinin mikroskobik olarak doğrulanması, içselleştirilmiş tüm mayaların geri kazanımı için çok önemlidir.
  2. Steril PBS'de 100 kat seyreltme hazırlayın, YPD katı ortamda 100 μl plaka hazırlayın ve plakaları 30 ° C'de inkübe edin.
  3. 1-2 gün sonra, YPD ortamında ortaya çıkan C. glabrata kolonilerinin sayısını manuel olarak sayın, seyreltme faktörü (2 saat CFU) ile çarpın ve aşağıdaki formülü kullanarak 2 saatlik madeni para oluşumundan sonra THP-1 makrofajları tarafından yutulan C. glabrata hücrelerinin yüzdesini ifade eden fagositoz oranını hesaplayın.
    % fagositoz = [(2 saatteki CFU'lar)/(0 saatteki CFU'lar)] X 100
  4. THP-1 makrofajlarındaki C. glabrata hücrelerinin hücre içi replikasyon hızını ölçmek için, enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında, yani 4, 6, 8, 10, 12 ve 24 saatte, 3.3-4.3 adımlarını tekrarlayarak hücre içi mayayı toplayın.
  5. THP-1 makrofajlarındaki C. glabrata hücrelerinin kıvrım sağkalımını / replikasyonunu, herhangi bir zaman noktasındaki toplam CFU'ları 2 saattekilerle (fagositozlu maya) bölerek hesaplayın.

5. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu Kullanılarak Hücre İçi Replikasyonun İzlenmesi

  1. Bölüm 1'de açıklanan adımları izleyerek, iki dört oyuklu odacıklı slaytların her bir oyuğunda PMA ile muamele edilmiş 5 x 105 THP-1 hücresi tohumlayın ve 12 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Eski ortamı önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortamla değiştirin ve hücrelerin PMA tedavisinden 12 saat boyunca iyileşmesine izin verin.
  3. GFP (yeşil floresan protein) etiketli C. glabrata hücre süspansiyonunu Bölüm 2'de tarif edildiği gibi hazırlayın ve THP-1 makrofajlarına 1'lik bir MOI'ye kadar enfekte edin. GFP'yi eksprese eden C. glabrata suşları mevcut değilse, FITC (floresein izotiyosiyanat) ile etiketlenmiş maya hücreleri, enfeksiyon sonrası erken olayları, yani fagositoz oranını ve 2 saatte fagolizozomal olgunlaşmayı izlemek için kullanılabilir.
  4. Slaytları 37 ° C'de% 5 CO2 ile 2 saat inkübe edin, ortamı atmak için dikkatlice ters çevirin ve 3x'i steril, önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
  5. Bir slaytın her bir odasına 500 μl önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortam ekleyin ve 22 saat boyunca %5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
  6. 2 saat C. glabrata ile enfekte olmuş THP-1 makrofajlarını sabitlemek için, diğer slaytın her bir odasına 500 μl% 3.7 formaldehit (PBS'de hazırlanır) ekleyin ve karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. Slaytı PBS ile üç kez yıkayın, 500 μl Triton-X (% 0.7) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  8. Slaytı 3x PBS ile yıkayın, hazneyi kültür slaytından çıkarın ve karanlıkta 3-5 dakika havayla kurutun.
  9. DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) içeren Vectashield montaj ortamını kullanarak kabarcık oluşumunu önleyerek slayt üzerine dikkatlice bir lamel monte edin. Fazla sıvıyı Kimwipe ile nazikçe çıkarın ve lamel kenarlarını tırnak cilası ile kapatın. Slaytı kullanana kadar karanlıkta 4°C'de saklayın.
  10. Enfeksiyondan 24 saat sonra THP-1 hücrelerini işlemek için 5.4 ve 5.6-5.9 adımlarını tekrarlayın.
  11. Lazer taramalı konfokal mikroskop kullanan görüntü hücreleri (60X yağa daldırma objektifi, DAPI ve GFP boyası için sırasıyla 405 nm ve 488 nm'de uyarma).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PMA ile işlem görmüş THP-1 makrofajlarının C. glabrata vahşi tip (wt) hücrelerle enfeksiyon analizleri, 2 saatlik birlikte inkübasyon sonrası wt hücrelerin %55-65 oranında makrofajlar tarafından fagosite edildiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, C. glabrata hücreleri THP-1 makrofajları tarafından öldürülmeye karşı direnç göstermiş ve THP-1 makrofajları ile 24 saatlik ko-kültür sonrası CFU değerlerinde 5 ila 7 katlık orta düzeyde bir artış gerçekleşmiştir8.  GFP eksprese eden...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, fırsatçı mantar enfeksiyonlarının kontrolünde önemli bir rol oynar. Makrofajlar, mantar patojeninin yutulması ve yok edilmesi yoluyla antifungal savunmaya katkıda bulunur. Bu nedenle, hayatta kalmak için gerekli olan faktörlerin aydınlatılması ve/veya makrofajların antimikrobiyal fonksiyonlarına karşı koymak, mantar virülans stratejileri hakkındaki anlayışımızı ilerletecektir. Bu bağlamda, bir insan fırsatçı mantar patojeni C. glabrata'nın konakçı fagositik hücrelerle etkileşim...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Departmanı ve Haydarabad'daki DNA Parmak İzi ve Teşhis Merkezi'nin çekirdek fonları tarafından Yenilikçi Genç Biyoteknoloji Ödülü BT/BI/12/040/2005 ve BT/PR13289/BRB/10/745/2009 hibesi ile desteklenmiştir. MNR ve GB, Manipal Üniversitesi'nde doktora derecesi almak için Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi'nin Genç ve Kıdemli Araştırma Burslarının alıcılarıdır. SB, Manipal Üniversitesi'nde doktora derecesi almak için Biyoteknoloji Bölümü'nün Genç ve Kıdemli Araştırma Bursu'nun alıcısıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
THP-1Amerikan Tipi Kültür KoleksiyonuTIB 202İnsan akut monositik lösemi hücre hattı
RPMI-1640HidroklonSH30096.01THP-1 hücrelerinin bakımı için
Phorbol 12-miristat 13-asetatSigma-AldrichP 8139Dikkat: Tehlikeli
YPD BD-Difco242710Candida glabrata hücrelerinin büyümesi için
FormaldehitSigma-AldrichF8775C. glabrata ile enfekte THP-1 makrofajlarının fiksasyonu için
Fosfat tamponlu salin (PBS)Tampon (137 mM NaCl, 10 mM Fosfat, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) yıkamalar için
Tuzlu su-sodyum sitrat (SSC) Yıkamalar için tampon (3 M NaCl, 20x konsantrasyon için 0,3 M sodyum sitrat)
Prehibridizasyon tamponuTampon (%50 formamid, 5x Denhardt' s çözeltisi, 5x SSC, %1 SDS) hibridizasyon için
VECTASHIELD montaj ortamıVector LabsH-1200Konfokal mikroskopi için slaytları monte etmek için
32P etiketli α-dCTPJONAKI-BARCLCP-102İmza etiketlerinin radyolinguistik etiketlemesi için
100 mm doku kültürü kaplarıCorning430167THP-1 hücrelerini kültürlemek için
24 oyuklu doku kültürü plakasıCorning3527THP-1 makrofajlarında C. glabrata enfeksiyon çalışmaları yapmak
4 odacıklı doku kültürü ile muamele edilmiş cam slaytBD FalconREF354104C. glabrata ile enfekte THP-1 makrofajlarını görüntülemek için
HemositometreRohem HindistanHücrelerin sayımı için
Masa üstü mikrosantrifüjBeckman CoulterMikrofüj 18Mikrotüplerdeki hücreleri döndürmek için Masa
üstü santrifüjRemiR-8C15 ml'lik tüplerde hücreleri döndürmek için
SpektrofotometreAmersham BiosciencesUltraspec 10Maya hücrelerinin emilimini izlemek için
Plaka inkübatörüLabtechSoğutmalıC. glabrata hücrelerini büyütmek için
Çalkalayıcı kuluçka makinesiNew BrunswickInnova 43C. glabrata hücrelerini büyütmek için
Su ceketli CO2  inkübatörThermo Electron CorporationForma serisi 2THP-1 hücrelerini kültürlemek için
Konfokal mikroskopCarl ZiessZiess LSM 510 metaC. glabrata enfekte THP-1 makrofajlarını gözlemlemek için
Bileşik mikroskopOlympusCKX 41C. glabrata ve THP-1 makrofajlarını gözlemlemek için
PCR makinesiBioRadDNA MotoruGiriş ve çıkış genomik DNA
Hibridizasyon fırınındanLabnetProblot 12SHibridizasyon için 
PhosphorImagerFujifilmFLA-9000Hibritleştirilmiş membranları taramak için
ThermomixerEppendorfThermomixer Comfort Radyoaktifişaretli imza etiketlerinin denatürasyonu için
Jel dokümantasyon ünitesiAlphainnontechAlphaimagerAgaroz jellerde etidyum bromür lekeli DNA'yı görselleştirmek için
için benzersiz etiketleri yükseltmek için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
  2. Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
  3. Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
  4. Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
  5. Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
  6. Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
  7. Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
  8. Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863(2012).
  9. Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
  10. Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
  11. Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
  12. Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
  13. Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
  14. Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
  15. Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fungal PatojenKonak Etkile imiKoloni Olu turan BirimlerKonfokal MikroskopiMutant TaramaFagositoz Deneyi

İlgili makaleler