Method Article

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

DOI:

10.3791/50637

⸱

October 4th, 2013

 ,  , 
1Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücre düzeyinde gen ifadesinin miktar nüfus düzeyinde gerçekleştirilen ölçümler gölgede yeni düzenleme mekanizmalarını ortaya çıkarır. İki yöntem mikroskopi dayalı ve akım sitometri gibi veriler elde edilebilir nasıl göstermek için sunulmaktadır. Mayada, ozmotik basıncı yüksek gliserol MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan bir flüoresan raportör ekspresyonu, bir örnek olarak kullanılmıştır. Her bir yöntemin özel avantajları vurgulanır. Sitometrisi hücrelerin geniş bir sayısı (10,000) büyüklüğüne ve floresan proteinin yavaş olgunlaştırma kinetik bağımsız protein ifade dinamikleri doğrudan bir ölçümünü sağlar akış. Mikroskobu ile canlı hücrelerin Imaging az hücrelerinde raportör olgunlaşmış formunun ölçümü ile sınırlı aksine gereğidir. Ancak, bu teknikle üretilen veri setleri birden gazetecilere kombinasyonları ve mekansal ve zamansal bilgiler son derece zengin sayesinde olabilirtek tek hücrelerden elde. Bu iki ölçüm yöntemlerinin kombinasyonu sinyal yolları ile protein ifadesinin düzenlenmesinde yeni anlayışlar sunabilirsiniz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinyal transdüksiyon cascades ile genellikle proteinlerin ekspresyonu son bulur. Bu ifade profilinin karakterizasyonu biyolojik yollarının işlevini anlamada önemli bir unsurdur. Up-regüle proteinler ve bunların aktivasyon dinamikleri spektrumunun tanımlanması, bu tür mikro-dizileri, kuzey ya da batı lekeleri blotlar 1-3 gibi çeşitli teknikler ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bu teknikler arasında, hücreler bütün bir nüfusun ortalama tepki. Protein ekspresyonunun ince düzenleme anlamak için, tek hücre düzeyinde ölçümleri toplamak için tercih edilir. İdeal olarak, bu ölçümler de altta yatan yolun matematiksel modeller geliştirmek için uygun nicel veri ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Mikroskopi Ölçümler

  1. Maya sentetik ortam 5 ml inoküle.
  2. Gece boyunca 30 ° C'de hücreler büyür.
  3. Ertesi sabah, gece boyunca kültürün OD 600 ölçün.
  4. 600 0.05 OD 5 ml sentetik kültür ortamı içinde bir gece boyunca seyreltin.
  5. En az 4 saat boyunca 30 ° C'de seyreltilmiş kültür büyütün.
  6. Hazırlama 3 kat sentetik aracı madde içinde (0.6 M) NaCl solüsyonu konsantre edildi.
  7. PBS, Concanavalin A (ConA) bir 1 mg / ml çözelti hazırlayın.
  8. Süzüntü ~ iyi slayt içine ConA'nın çözeltisi 200 ul.
  9. 30 dakika bekletin.
  10. ConA'nın çözüm çıkarın.
  11. D....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopla inceleme

Sentezleme raportör p STL1-QV (ySP9 7) taşıyan maya hücreleri iyi slaydın tabanına bağlanmış ve mikroskop altında yerleştirildi. Hücreler görüntüleme oturumu sırasında doğrudan kuyuya stres ortamının eklenmesi ile uyarıldı. Bu bize yol indüksiyon öncesi hücrelerin birkaç görüntü elde ve stimülasyon sonrasında kendi kaderini takip sağlar. Bu durumda, hücreler, 10 dakika bir zaman aralığı ile ~ 2 saat boyunca takip edildi. Şekil 1A ve

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopla inceleme

ConA ile kuyunun tedavisi, hücrelerin uygun bir görüntüleme sağlamak için önemli bir adımdır. ConA PBS (5 mg / mi) içinde düşük bir çözünürlüğe sahip olduğundan, filtreleme işlemi sağlar: filtre çözelti içinde mevcut olan ve görüntüleme müdahale büyük agregaların çıkarılması. Hücreler, işlemden geçirilen yüzeye bağlı olarak güçlü bir şekilde tutunur ve uyaran çözeltisinin eklenmesinin uyaran önce ve sonra, bir sürekli izleme sağlayan, hücrelerin lokalizasyonu rahatsız edilm.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Matthias Peter ve bu yöntemler geliştirilmiştir Zürich ETH Biyokimya Enstitüsü'nde yaptığı grup ederim. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Maya Azot BazıForMediumCYN6202
CSM amino asit karışımıForMediumDCS0011
Concanavalin AGE Healthcare17-0450-01
SikloheksimidFluka Aldrich SigmaC7698Toksik
ySP9W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-dörtlüV enus
pSP34pRS305 pSTL1 (-800 -0) - dörtlü V enus
Malzeme
MikroskopNikonTi-Eclipse
Mikroskop kontrol yazılımıMikro yöneticiVer 1.4.11
Kuluçka odasıLISThe Box
Floresan ışığı KaynakLumencorSpectraX
KameraHamamatsuFlash 4.0
Akış sitometresiBDFACS calibur
Sonicator banyosuTelesonicTUC-150
8 kuyulu kaydıraklı Thermo Lab-tek155409
96 kuyulu plakaMatematiksel biyobilimMGB096-1-2-LG
FACS tüpBD Falcon352054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MAPK PathwayYeast CellsFluorescent ReporterFlow CytometryLive Cell MicroscopySingle Cell AnalysisProtein ExpressionCycloheximide TreatmentTime Lapse ImagingGene Expression

Related Articles