Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Biyofilmler, kendi kendine üretilen bir hücre dışı matris içinde kapsüllenen ve biyolojik veya inert yüzeylere¹ bağlı yapılandırılmış mikrobiyal topluluklardır. Biyofilmler, birçok bakteri için ortak bir yaşam tarzını temsil eder ve serbest yüzen (planktonik) hücrelerden karmaşık çok türlü topluluklara aşamalı olarak geçiş yaparak oluşur. Biyofilmlerin antimikrobiyal ajanlara karşı doğal direnci, oral biyofilmler (diş plağı) tarafından gösterildiği gibi, birçok kalıcı ve kronik bakteriyel enfeksiyonun^1,2 kökenindedir. Mutans, streptokok gibi karyojenik mikroorganizmalar, hücre dışı bir matris üretmek ve diş yapısını demineralize edebilen ve diş çürüklerine neden olabilen asitler üretmek için sakaroz ve diğer karbonhidratları işler. Biyofilm matrislerinin çoğu, ekzopolisakkaritler (EPS), proteinler ve^{nükleik asitler 3,4} gibi hücresel ve hücre dışı bileşenlerden oluşan biyopolimerlerdir.

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM), hidratlı biyolojik yapıların 3D görüntülerini fiksasyon olmadan toplama yeteneğine sahip olduğu için biyolojide optik görüntülemeyi kökten dönüştürmüştür^5,6,7. Bu tahribatsız teknik, odak dışı ışığın katkısını ortadan kaldıracak şekilde numune üzerinde ilgilenilen bir bölgedeki ince kesitlerin görüntülerinin toplanmasını içerir. CLSM tarafından yakalanan görüntülerin kalitesi ve çözünürlüğü, geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak elde edilebilenin ötesindedir. CLSM'nin en büyük dezavantajlarından biri, görüntülerin taranmasının, tüm görüntülerin aynı anda toplandığı geniş alan mikroskobu tekniklerine göre daha yavaş bir hızda gerçekleşmesidir⁵. Bununla birlikte, genişleyen florokrom, lazer ve filtre seçenekleriyle CLSM, multispektral görüntüleme için hakim tekniklerden biri haline gelmiştir^5,7.

Önceki çalışmalar, CLSM'nin, EPS ve hücrelerin biyofilmler içindeki ve özellikle hücre dışı matris içindeki dağılımının daha iyi anlaşılmasını sağlamak için bir veya iki floresan etiket veya leke kullanarak biyofilmlerin yapısını veya mimarisini incelemek için yararlı bir araç olduğunu göstermiştir^7,8. Teorik olarak, biyofilmler içindeki hücresel ve hücre dışı bileşenlerin ayrıntılı yapısını ve kolokalizasyonunu araştırmak için çoklu bileşenlerin floresan boyanması / etiketlenmesi arzu edilir. Bununla birlikte, biyofilmler içindeki çeşitli bileşenlerin eşzamanlı analizi zor olabilir, çünkü: 1) minimum spektral örtüşmeye sahip floresan boyaların seçimi karmaşıktır ve 2) çoklu florokromların miktar tayini çok faktörlü bir problem oluşturur. Birden fazla florokrom kullanılarak kolokalizasyon, iki florokromun spektral tepe noktalarında önemli ölçüde örtüştüğünde meydana gelen ve birinin diğerinden daha güçlü bir şekilde uyarılmasına neden olan herhangi bir sızıntı etkisinden kaçınmak için minimum spektral girişime sahip oldukça spesifik lekelerin kullanılmasını gerektirir⁹. İdeal olarak, örtüşmeyen uyarma spektrumlarına sahip florokromlar en iyi sonuçları sağlayacaktır, ancak bu kriteri karşılayan lekeleri bulmak çok zordur. Bunun yerine, emisyon spektrumları minimum örtüşmeye sahip florokromlar seçilerek leke seçimi optimize edilir ve lekelerin sınırlı bir gözlem dalga boyu^{bandı 9} içinde tek tek görüntülenmesine izin verilir.

Floresan görüntülerin üst üste bindirilmesi, florokromların eşzamanlı dağılımını değerlendirmek için muhtemelen en yaygın kullanılan yöntemdir. Çeşitli bileşenlerin kolokalizasyonu, incelenen florokromlar tarafından oluşturulan çoklu kanallar aracılığıyla farklı renklerin üst üste binmesi olarak ortaya çıkar¹⁰. Çok kanallı floresan görüntüleri birleştirilmiş renkli görüntüler olarak görüntülemek için araçlar çoğu CLSM yazılımında ve biyolojik görüntü analiz yazılımında mevcuttur. Görüntülerin üst üste bindirilmesi, kolokalizasyonun mekansal değerlendirmesi için yararlı olsa da, görüntüler yalnızca görsel analiz ile nitel olarak incelenebilir. Bu, sınırlı miktarda bilgi sağlar, çünkü bu temsiller genellikle farklı deneysel koşullar altında kolokalizasyonu ölçmek için yardımcı olmaz ve kolokalizasyonun rastgele tesadüfü aşıp aşmadığını belirlemez¹¹. Şimdiye kadar çok az sayıda araştırma, biyofilmlerin ve biyofilm bileşenlerinin 3 boyutlu yapısını analiz etmek için nicel yöntemler kullanmıştır ve daha da azı, antibakteriyel işlemlerin veya zehirli boya önlemlerinin biyofilm bileşenleri üzerindeki etkisini ölçmüştür.

Bu çalışmanın amacı, biyofilmlerin üç hücresel ve hücre dışı bileşeninin eşzamanlı 3 boyutlu dağılımlarının niceliklerinin belirlenmesi ve karşılaştırılması için bir metodoloji raporlamaktı. Yöntem, biyofilm büyümesi, boyama, biyofilmlerin CLSM görüntülemesi, biyofilm yapısal analizi ve görselleştirmesi ve yapısal parametrelerin istatistiksel analizini içeren farklı ancak birbirine bağlı adımlardan oluşur. Biyofilm büyüme testi, ilgili substratlar üzerinde biyofilm büyümesine izin verir ve tekrarlanabilir biyofilm yapıları üretir. EPS, proteinler ve nükleik asit bileşenlerinin yeni eşzamanlı boyanmasının 3D biyofilm yapısal parametrelerinin ölçümü ile kombinasyonu, biyofilmler içindeki bileşenlerin ölçülebilir dağılımları ile sonuçlanır. Biyofilm yapısal parametrelerinin istatistiksel analizi, bir sonraki bölümde açıklanacağı gibi, belirli deneysel koşullar altında (örneğin gargaralarla tedaviden sonra) biyofilmlerin değerlendirilmesini kolaylaştırır.

1. Ortam ve Reaktiflerin Hazırlanması

1. 300 ml gece boyunca kültür ortamı (THY; üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış% 3 Todd Hewitt Et Suyu, ultra saf suda% 0.3 Maya Özü ile desteklenmiştir) ve otoklav yapın. Oda sıcaklığında 2 aya kadar saklayın.
2. 1 L THY agar (%3 Todd Hewitt Et Suyu, %0,3 Maya Özü ve ultra saf suda %1,5 agar) yapın, otoklavlayın ve Petri kaplarına dökmeden önce 60 °C'ye soğutun. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
3. 150 ml biyofilm büyüme ortamı yapın (10 mM sükroz ile desteklenmiş 0.5X TY; ultra saf suda %1.5 Tripton, %0.5 Maya Özü ve 10 mM sükroz) ve filtre sterilize edin. Oda sıcaklığında 1 aya kadar saklayın.
4. 1 L Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS; 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄ ve ultra saf suda 0.24 g KH₂PO₄) ve otoklav yapın. Birkaç ay oda sıcaklığında saklayın.
5. Ultra saf suda (TC tamponu; pH_7.2) ve otoklavda 10 mM CaCl 2 ile desteklenmiş 600 ml 10 mM Tris HCl tamponu yapın. Birkaç ay oda sıcaklığında saklayın.
6. Otoklav 1 L ultra saf su. Birkaç ay oda sıcaklığında saklayın.

2. Numune İmalatı

1. Point 4 (PF) ve TPH³ (TP) dental reçine kompozitlerinin disk şeklindeki numunelerini özel yapım paslanmaz çelik bir kalıpta iki adımda imal edin. Her artış, bir LED ışıkla sertleştirme ünitesi kullanılarak 40 saniye boyunca ışıkla sertleştirilir. İki ürün biraz farklı bileşimlere ve dolgu seviyelerine sahiptir ve bu nedenle biyofilmlerin üzerinde büyüyeceği farklı yüzey topografyaları üretir.
   1. İlgili substratların örnekleri, adım 2.1 yerine diğer disiplinlerden yerleşik protokoller kullanılarak üretilebilir.
2. Numuneleri, örneğin yarı otomatik bir öğütücü-parlatıcı kullanarak, kabul edilebilir bir nihai yüzey kaplamasına kadar bitirin ve parlatın. Cilalı numuneleri ultra saf suyla durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurulayın.
3. Numuneleri etilen oksit gazı veya alternatif bir sterilizasyon yöntemi kullanarak sterilize edin.

3. Biyofilm Büyümesi

1. Tek bir S. mutans kolonisini 4 ml gece boyunca kültür ortamına aşılayın (adım 1.1). Gece boyunca 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Kültürün optik yoğunluğu (OD₆₀₀) ≥0.9 olmalıdır.
   1. Orijinal bir stoktan 2 kat geçirilmiş plaka kültürlerinden bir koloni kullanmak en iyisidir, çünkü bu daha tutarlı bir biyofilm büyümesi ile sonuçlanır.
2. 10 ml biyofilm büyüme ortamında (adım 1.3) gece kültürünü (adım 1.1) kullanarak 1:100 seyreltme oluşturun.
3. Steril reçine kompozit numuneleri (ör. PF, TP) steril 12 oyuklu plakalara aktarın.
4. Tedavi (gargara) ve kontrol grupları için kuyucuklara 2.5 ml seyreltilmiş kültür ortamı (adım 3.2) ekleyin. Sterilite kontrol kuyucuklarına 2,5 ml steril aşılanmamış biyofilm büyütme ortamı ekleyin.
5. Biyofilmleri mikroaerofilik koşullar altında büyütün. Plakaları 24 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatörün içinde 100 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
6. 24 saat sonra, tüm oyuklardan ortamı aseptik olarak aspire edin ve her yıkamadan sonra PBS'yi aspire ederek steril PBS (adım 1.4; 2.5 ml / kuyu) ile iki kez yıkayın. Her bir oyukta 2,5 ml taze biyofilm büyütme ortamını doldurun ve toplam 48 saatlik biyofilm büyüme süresi için önceki adımla aynı koşullar altında 24 saat daha inkübe edin.
7. Yukarıdaki adımların yerine, diğer türlerin biyofilmleri, yerleşik protokoller kullanılarak substratlar üzerinde büyütülebilir.

4. Antibakteriyel/Gargara Tedavileri

1. Biyofilm büyümesi tamamlandıktan sonra aspirat ortamı.
2. Tedavi grupları için kuyucuklara 2,5 ml Biotène PBF (BIO) veya Listerine Total Care (LTO) gargara veya başka bir tedavi yöntemi ekleyin ve kontrol grubu kuyucuğuna 2,5 ml steril ultra saf su ekleyin. Plakaları 150 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalarken, üreticinin talimatlarına göre numuneleri 60 saniye daldırın. Hem gargarayı hem de ultra saf suyu kuyulardan hemen aspire edin.
3. Numuneleri yıkama başına 5x 15 saniye boyunca orbital çalkalayıcı üzerinde 150 rpm'de steril ultra saf su ile yıkayın ve her yıkama adımından sonra su aspire edin.
4. Yukarıdaki adımların yerine, diğer antibakteriyel ajanlar yerleşik protokoller kullanılarak test edilebilir.

5. Boyama

1. Biyofilm analizi için leke seyreltmelerini hazırlayın.
   1. 0.1 M sodyum bikarbonat pH 8.3'te 5 mg / ml'lik bir Concanavalin A, Alexa Fluor 647 konjugatı (AF) stok çözeltisi hazırlayın. -20 ° C'de birkaç ay boyunca tek kullanımlık alikotlarda saklayın, çünkü dondurma ve çözme önerilmez. Bu AF stok çözeltisini kullanarak, TC tamponunda 250 μg/ml'lik bir seyreltme hazırlayın.
   2. TC tamponunda üretici tarafından sağlanan 5 mM Syto 9 stok çözeltisini (SY) kullanarak 10 μM'lik bir seyreltme hazırlayın. Kalan SY stok çözeltisini birkaç ay boyunca -20 °C'de saklayın.
   3. Steril ultra saf suda, üretici tarafından sağlanan 5.000x Sypro Red stok solüsyonunu (SR) kullanarak 10x seyreltme hazırlayın. Kalan SR stok çözeltisini birkaç ay boyunca -20 °C'de saklayın.
2. Tüm biyofilmleri 2 kez TC tamponu (2,5 ml/kuyu) ile elle döndürme hareketi kullanarak yıkayın ve ikinci yıkamanın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca plakada kalmasına izin verin. Aspirat.
3. Her biyofilm örneğine 50 μl'lik bir damla AF lekesi yerleştirin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 30 dakika lekeleyin. Her yıkamadan sonra aspire ederek TC tamponu (2,5 ml / kuyu) ile 2 kez yıkayın.
4. Her biyofilm örneğinde 50 μl'lik bir damla SY boyası ile devam edin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 30 dakika lekeleyin. 2 kez steril ultra saf su (2,5 ml / kuyu) ile yıkayın, her yıkamadan sonra aspire edin
5. Son olarak, her biyofilm örneğine 50 μl'lik bir damla SR lekesi yerleştirin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 30 dakika lekeleyin. Her yıkamadan sonra aspire ederek 3x'i steril ultra saf suyla (2,5 ml/kuyu) yıkayın.
6. Numuneleri 6 oyuklu bir plakaya aktarın ve konfokal mikroskobu kolaylaştırmak için 6 ml steril ultra saf suya her oyuk başına bir numune yerleştirin.

6. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu Kullanarak Görüntüleme

1. Tablo 1'de gösterilen konfokal lazer tarama mikroskobu ayarlarını kullanarak tedavi ve kontrol gruplarının biyofilmleri içindeki her bir bileşenin (leke) görüntülerini elde edin. Bu çalışmada 2,2 mm çalışma mesafesine sahip 0,9 sayısal diyafram açıklığına sahip 63X daldırma lensi kullanılmıştır.
   
   Tablo 1. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu Ayarları.

1. Kantitatif analiz için yeterli çözünürlükte CLSM görüntüleri elde etmek için tarama boyutunu 250 μm x 250 μm ve minimum piksel çözünürlüğü 512 x 512 olarak ayarlayın.
2. Biyofilm görüntü yığınının üst ve alt noktalarını ayarlamak için SY boyasını kullanın, ardından z adımını kantitatif analiz için yeterli olacak şekilde ayarlayın (bu çalışma için 0,6 μm). Bir tarama toplamadan önce, QLUT seçeneğini kullanarak görüntü ve leke parametrelerini (yani PMT voltajı ve ofset) optimize edin. Her bir biyofilm bileşenini 3D rekonstrüksiyonda daha ayırt edilebilir hale getirmek için her lekeye sahte renkler (SY için yeşil, SR için kırmızı ve AF için mavi) atamak için bir renk arama tablosu kullanıldı.
3. Aynı biyofilm içindeki birden fazla lekenin görüntülerinin yakalanmasını optimize etmek için "yığınlar arasında" modunda sıralı taramayı kullanarak 400 Hz'de CLSM görüntüleri toplayın.

7. Biyofilm Yapısal Analizi

1. Biyofilmler için görüntü analiz yazılımı kullanılarak toplanan CLSM görüntülerini analiz edin. Aşağıdaki adımlar, toplanan biyofilm görüntülerinin yapısal parametrelerini hesaplamak için ISA3D yazılımının¹² kullanımını açıklamaktadır.
   1. Her biyofilm için CLSM görüntü dosyalarını yazılımın kılavuzunda belirtildiği gibi Görüntüler klasörüne kopyalayın. Yazılım için gereken CLSM dosyaları için adlandırma kuralına uyulduğundan emin olun. Yazılım, toplu modda alt klasörler içindeki dosyaların analizine izin verir, böylece aynı çalışmada tedavi ve kontrol grubu biyofilmlerinin analizini kolaylaştırır.
   2. CLSM görüntülerinin x, y ve z ekseni boyutlarını ana iletişim kutusunun dxy ve dz alanlarına girin. Yazılımın kılavuzunda açıklandığı gibi eşik ve mesafe haritalama ayarlarını seçin (bu çalışma için sırasıyla Otsu ve Quasi-Öklidyen kullanılmıştır). Sonuç dosyası için uygun bir ad girin ve ardından programı çalıştırın. ISA klasöründe bir sonuç dosyası oluşturulur.
   3. Biyofilm içindeki her bir bileşenin (leke) 3B dağılımını ölçen biyohacim ve ortalama biyofilm kalınlığı (bu çalışmada ölçülen) gibi yirmi 3B yapısal parametre¹² için değerler elde etmek için sonuç dosyasını görüntüleyin.

8. Biyofilm Yapısının Görselleştirilmesi

1. Görüntü analiz yazılımını kullanarak her bir biyofilm içinde üst üste binen bileşenlerin (lekelerin) bir rekonstrüksiyonunu oluşturun. Aşağıdaki adımlar, 3B rekonstrüksiyonlar oluşturmak için Volocity yazılımının kullanımını açıklamaktadır.
   1. Kılavuzda açıklandığı gibi CLSM görüntü dosyalarını yazılıma kopyalayarak her biyofilm için bir kitaplık oluşturun.
   2. Her bir biyofilmin CLSM görüntülerinden yeniden yapılandırılmış bir 3B görüntü oluşturmak için 3B Oluşturucu menü seçeneğini kullanın (bu çalışma için HR Opaklık formatı kullanılmıştır).
   3. Tüm biyofilmleri x, y ve z koordinat eksenlerine göre benzer şekilde yönlendirmek için 3B görüntüyü döndürün. Doğru yönlendirilmiş biyofilm rekonstrüksiyonunun anlık görüntüsünü yakalayın ve ardından anlık görüntüyü TIFF, JPEG veya başka bir uygun formatta dışa aktarın.
2. Yeniden yapılandırılmış görüntüler üzerinde biyofilmler içindeki EPS, proteinler ve nükleik asit bileşenlerinin eşzamanlı dağılımının görsel analizini gerçekleştirin.
3. Çoklu biyofilm bileşenlerinin kolokalizasyon analizini yapmak için Pearson korelasyon katsayısını ve Manders'in örtüşme katsayısını kullanın (bu çalışmada kolokalizasyon ölçülmemiştir).

9. İstatistiksel Analiz

1. Gargara ve kontrol grupları arasındaki yapısal parametrelerin ortalama değerlerini karşılaştırmak için ayrı karma modeller istatistiksel analizler kullanın (α=0.05). Bu çalışmada istatistiksel analiz yapmak için SAS yazılımı kullanılmıştır.

Tedaviler (gargaralar) ve tedavi edilmeyen kontrol grubu için temsili sonuçlar Tablo 2'de ve Şekil 1 ve 2'de gösterilmektedir. Tablo 2, ISA3D yazılımı kullanılarak hesaplanan biyofilm yapısal parametreleri, biyohacim (μm3) ve ortalama biyofilm kalınlığının (μm) ortalama ve standart sapma değerlerini göstermektedir. Gargara ile tedavi edilen biyofilmlerin yapısal parametrelerinin kontrol grubundaki biyofilmlerden anlamlı olarak farklı olması (p<0.05) ortalama ve standart sapma değerleri kırmızı ile vurgulanmıştır. Karma modellerin istatistiksel analizlerinin sonuçları, gargara BIO'nun her iki reçine kompozitinde kontrolden önemli ölçüde farklı biyofilm yapıları ürettiğini (p<0.05), gargara LTO'nun ise her iki reçine kompozitinde de anlamlı farklılıklar üretmediğini (p>0.05) göstermiştir. Sonuçlar, iki gargara tedavisinden sonra kalan hücresel ve hücre dışı biyofilm bileşenlerinin farklı olduğunu açıkça göstermektedir. Ayrıca, iki substrat (PF ve TP) üzerinde büyütülen S. mutans biyofilmlerinin, benzer koşullar altında yetiştirilmelerine ve her iki substratın da benzer aşındırıcılarla parlatılmasına rağmen 3D yapıda farklılık gösterdiğine dikkat edilmelidir.

EPS, proteinler ve nükleik asidin biyofilmler içindeki eş zamanlı dağılımı, Volocity yazılımı kullanılarak oluşturulan 3D rekonstrüksiyonlar aracılığıyla görselleştirilebilir. Şekil 1 ve 2, sırasıyla PF ve TP reçine kompozitleri üzerinde büyütülen kontrol grubu biyofilmlerinin temsili rekonstrüksiyonlarını göstermektedir. Mavi leke S. mutans biyofilmleri içindeki EPS'yi, yeşil leke nükleik asitleri ve kırmızı leke proteinleri gösterir. Araya giren boşluk, su veya diğer floresan etiketli olmayan biyofilm bileşenleri tarafından işgal edilebilir.

Şekil 1. Kontrol grubunda PF reçine kompoziti üzerinde büyütülen S. mutans biyofilminin temsili bir 3D rekonstrüksiyonu (gargara ile tedavi edilmemiştir). Üç lekenin tek bir biyofilm içinde aynı anda üst üste bindirilmesi, S. mutans biyofilmleri içindeki EPS (mavi leke), nükleik asit (yeşil leke) ve protein (kırmızı leke) bileşenlerinin aynı anda görüntülenmesine izin verir. (1 Birim = 24 μm). Daha büyük şekli görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. Kontrol grubunda TP reçine kompoziti üzerinde büyütülen S. mutans biyofilminin temsili bir 3D rekonstrüksiyonu (gargara ile muamele edilmemiştir). Üç lekenin tek bir biyofilm içinde aynı anda üst üste bindirilmesi, S. mutans biyofilmleri içindeki EPS (mavi leke), nükleik asit (yeşil leke) ve protein (kırmızı leke) bileşenlerinin aynı anda görüntülenmesine izin verir. (1 Birim = 24 μm). Daha büyük şekli görmek için buraya tıklayın.

Tablo 2. BIO veya LTO ile muamele edilmiş veya tedavi edilmemiş bırakılmış (kontrol grubu) biyofilmlerin Biyohacim (BV) ve Ortalama biyofilm kalınlığının (MT) ortalama ve standart sapma değerleri. Ağız gargaraları ile tedavi edilen biyofilmlerin yapısal parametrelerinin kontrol grubundaki biyofilmlerden anlamlı olarak farklı olduğu (p<0.05) ortalama ve standart sapma değerleri kırmızı ile vurgulanmıştır.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Bu makaleye üretim ve Ücretsiz Erişim Leica Microsystems tarafından desteklenmektedir.