Yöntem makalesi

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

10.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50639

⸱

10 Aralık 2013

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

Bu makalede

Özet

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Özet

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM), biyofilmlerin araştırılması için güçlü bir araçtır. Çok az sayıda araştırma, biyofilmler içinde ikiden fazla bileşenin eşzamanlı dağılımını başarılı bir şekilde ölçmüştür, çünkü: 1) minimum spektral örtüşmeye sahip floresan boyaların seçimi karmaşıktır ve 2) çoklu florokromların miktar tayini çok faktörlü bir problem oluşturur. Hedef: İlgili substratlar üzerinde büyütülen biyofilmlerin üç hücresel/hücre dışı bileşeninin eşzamanlı 3 boyutlu dağılımlarını ölçmek ve karşılaştırmak için bir metodoloji rapor edin. Yöntemler: Yöntem, biyofilm büyümesi, boyama, CLSM görüntüleme, biyofilm yapısal analizi ve görselleştirme ve yapısal parametrelerin istatistiksel analizini içeren farklı, birbirine bağlı adımlardan oluşur. Streptococcus mutans'ın (suşu UA159) biyofilmleri, Point 4 ve TPH3 reçine kompozitlerinin steril örnekleri üzerinde 48 saat boyunca büyütüldü. Örnekler daha sonra 60 saniye boyunca Biotène PBF (BIO) veya Listerine Total Care (LTO) gargaralarına veya suya daldırıldı (kontrol grubu; n=5/grup). Biyofilmler, CLSM ile görüntülemeden önce hücre dışı polimerik maddeler, proteinler ve nükleik asitler için florokromlarla boyandı. ISA3D görüntü analiz yazılımı kullanılarak hesaplanan biyofilm yapısal parametreleri biyohacim ve ortalama biyofilm kalınlığıydı. Karma modellerde yapılan istatistiksel analizlerde gargara ve kontrol grupları arasındaki yapısal parametreler karşılaştırılmıştır (SAS yazılımı; α=0.05). Volocity yazılımı, üst üste bindirilmiş biyofilm bileşenlerinin (florokromlar) 3D dağıtımlarının görselleştirilmesine izin verdi. Sonuç -ları: Gargara BIO, her iki reçine kompozitinde kontrolden (p<0.05) önemli ölçüde farklı biyofilm yapıları üretirken, LTO her iki üründe de farklılık göstermedi (p>0.05). Sonuç: Bu metodoloji, S. mutans biyofilmleri içindeki üç ana bileşenin ilgili substratlar üzerindeki eşzamanlı 3D dağılımlarını verimli ve başarılı bir şekilde ölçtü ve karşılaştırdı, böylece biyofilm bileşenlerinin eşzamanlı değerlendirmesinin önündeki iki zorluğun üstesinden geldi. Bu yöntem, gargaralar kullanılarak gösterildiği gibi, antibakteriyel/zehirli boya ajanlarının birden fazla biyofilm bileşenine karşı etkinliğini belirlemek için de kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem, çeşitli disiplinlerde biyofilmlerin 3B yapılarının / mimarisinin karşılaştırılmasını kolaylaştırdığı için geniş bir uygulama alanına sahiptir.

Giriş

Biyofilmler, kendi kendine üretilen bir hücre dışı matris içinde kapsüllenen ve biyolojik veya inert yüzeylere1 bağlı yapılandırılmış mikrobiyal topluluklardır. Biyofilmler, birçok bakteri için ortak bir yaşam tarzını temsil eder ve serbest yüzen (planktonik) hücrelerden karmaşık çok türlü topluluklara aşamalı olarak geçiş yaparak oluşur. Biyofilmlerin antimikrobiyal ajanlara karşı doğal direnci, oral biyofilmler (diş plağı) tarafından gösterildiği gibi, birçok kalıcı ve kronik bakteriyel enfeksiyonun1,2 kökenindedir. Mutans, streptokok gibi karyojenik mikroorganizmalar, hücre dışı bir matris üretmek ve diş yapısını demineralize edebilen ve diş çürüklerine neden olabilen asitler üretmek için sakaroz ve diğer karbonhidratları işler. Biyofilm matrislerinin çoğu, ekzopolisakkaritler (EPS), proteinler venükleik asitler 3,4 gibi hücresel ve hücre dışı bileşenlerden oluşan biyopolimerlerdir.

Floresan görüntüleme için en yaygın kullanılan teknik olan

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM), hidratlı biyolojik yapıların 3D görüntülerini fiksasyon olmadan toplama yeteneğine sahip olduğu için biyolojide optik görüntülemeyi kökten dönüştürmüştür5,6,7. Bu tahribatsız teknik, odak dışı ışığın katkısını ortadan kaldıracak şekilde numune üzerinde ilgilenilen bir bölgedeki ince kesitlerin görüntülerinin toplanmasını içerir. CLSM tarafından yakalanan görüntülerin kalitesi ve çözünürlüğü, geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak elde edilebilenin ötesindedir. CLSM'nin en büyük dezavantajlarından biri, görüntülerin taranmasının, tüm görüntülerin aynı anda toplandığı geniş alan mikroskobu tekniklerine göre daha yavaş bir hızda gerçekleşmesidir5. Bununla birlikte, genişleyen florokrom, lazer ve filtre seçenekleriyle CLSM, multispektral görüntüleme için hakim tekniklerden biri haline gelmiştir5,7.

Önceki çalışmalar, CLSM'nin, EPS ve hücrelerin biyofilmler içindeki ve özellikle hücre dışı matris içindeki dağılımının daha iyi anlaşılmasını sağlamak için bir veya iki floresan etiket veya leke kullanarak biyofilmlerin yapısını veya mimarisini incelemek için yararlı bir araç olduğunu göstermiştir7,8. Teorik olarak, biyofilmler içindeki hücresel ve hücre dışı bileşenlerin ayrıntılı yapısını ve kolokalizasyonunu araştırmak için çoklu bileşenlerin floresan boyanması / etiketlenmesi arzu edilir. Bununla birlikte, biyofilmler içindeki çeşitli bileşenlerin eşzamanlı analizi zor olabilir, çünkü: 1) minimum spektral örtüşmeye sahip floresan boyaların seçimi karmaşıktır ve 2) çoklu florokromların miktar tayini çok faktörlü bir problem oluşturur. Birden fazla florokrom kullanılarak kolokalizasyon, iki florokromun spektral tepe noktalarında önemli ölçüde örtüştüğünde meydana gelen ve birinin diğerinden daha güçlü bir şekilde uyarılmasına neden olan herhangi bir sızıntı etkisinden kaçınmak için minimum spektral girişime sahip oldukça spesifik lekelerin kullanılmasını gerektirir9. İdeal olarak, örtüşmeyen uyarma spektrumlarına sahip florokromlar en iyi sonuçları sağlayacaktır, ancak bu kriteri karşılayan lekeleri bulmak çok zordur. Bunun yerine, emisyon spektrumları minimum örtüşmeye sahip florokromlar seçilerek leke seçimi optimize edilir ve lekelerin sınırlı bir gözlem dalga boyubandı 9 içinde tek tek görüntülenmesine izin verilir.

Floresan görüntülerin üst üste bindirilmesi, florokromların eşzamanlı dağılımını değerlendirmek için muhtemelen en yaygın kullanılan yöntemdir. Çeşitli bileşenlerin kolokalizasyonu, incelenen florokromlar tarafından oluşturulan çoklu kanallar aracılığıyla farklı renklerin üst üste binmesi olarak ortaya çıkar10. Çok kanallı floresan görüntüleri birleştirilmiş renkli görüntüler olarak görüntülemek için araçlar çoğu CLSM yazılımında ve biyolojik görüntü analiz yazılımında mevcuttur. Görüntülerin üst üste bindirilmesi, kolokalizasyonun mekansal değerlendirmesi için yararlı olsa da, görüntüler yalnızca görsel analiz ile nitel olarak incelenebilir. Bu, sınırlı miktarda bilgi sağlar, çünkü bu temsiller genellikle farklı deneysel koşullar altında kolokalizasyonu ölçmek için yardımcı olmaz ve kolokalizasyonun rastgele tesadüfü aşıp aşmadığını belirlemez11. Şimdiye kadar çok az sayıda araştırma, biyofilmlerin ve biyofilm bileşenlerinin 3 boyutlu yapısını analiz etmek için nicel yöntemler kullanmıştır ve daha da azı, antibakteriyel işlemlerin veya zehirli boya önlemlerinin biyofilm bileşenleri üzerindeki etkisini ölçmüştür.

Bu çalışmanın amacı, biyofilmlerin üç hücresel ve hücre dışı bileşeninin eşzamanlı 3 boyutlu dağılımlarının niceliklerinin belirlenmesi ve karşılaştırılması için bir metodoloji raporlamaktı. Yöntem, biyofilm büyümesi, boyama, biyofilmlerin CLSM görüntülemesi, biyofilm yapısal analizi ve görselleştirmesi ve yapısal parametrelerin istatistiksel analizini içeren farklı ancak birbirine bağlı adımlardan oluşur. Biyofilm büyüme testi, ilgili substratlar üzerinde biyofilm büyümesine izin verir ve tekrarlanabilir biyofilm yapıları üretir. EPS, proteinler ve nükleik asit bileşenlerinin yeni eşzamanlı boyanmasının 3D biyofilm yapısal parametrelerinin ölçümü ile kombinasyonu, biyofilmler içindeki bileşenlerin ölçülebilir dağılımları ile sonuçlanır. Biyofilm yapısal parametrelerinin istatistiksel analizi, bir sonraki bölümde açıklanacağı gibi, belirli deneysel koşullar altında (örneğin gargaralarla tedaviden sonra) biyofilmlerin değerlendirilmesini kolaylaştırır.

Protokol

1. Besiyeri ve Reaktiflerin Hazırlanması

  1. 300 ml gece boyu kültür ortamı (üretici talimatlarına göre hazırlanan %3 Todd Hewitt Broth'un ultrapure su içinde %0,3 Yeast Extract ile desteklenmiş hali; THY) hazırlayın ve otoklavlayın. Oda sıcaklığında 2 aya kadar saklayın.
  2. 1 L THY agar (ultrapure su içinde %3 Todd Hewitt Broth, %0,3 Yeast Extract ve %1,5 agar) hazırlayın, otoklavlayın ve Petri kaplarına dökmeden önce 60 °C'ye kadar soğutun. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
  3. 150 ml biyofilm büyüme ortamı (10 mM sükroz ile desteklenmiş 0,5X TY; ultrapure su içinde %1,5 Tryptone, %0,5 Yeast Extract ve 10 mM sükroz) hazırlayın ve filtre ile sterilize edin. Oda sıcaklığında 1 aya kadar saklayın.
  4. 1 L Fosfat Tamponlu Salin (PBS; ultrapure su içinde 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 ve 0,24 g KH2PO4) hazırlayın ve otoklavlayın. Oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklayın.
  5. Ultrapure su içinde 10 mM CaCl2 ile desteklenmiş 600 ml 10 mM Tris HCl tamponu (TC tamponu; pH 7,2) hazırlayın ve otoklavlayın. Oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklayın.
  6. 1 L ultrapure suyu otoklavlayın. Oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklayın.

2. Numune Hazırlama

  1. Point 4 (PF) ve TPH3 (TP) dental rezin kompozitlerinden, özel yapım bir paslanmaz çelik kalıpta iki artırım halinde disk şeklinde numuneler hazırlayın. Her artırım, bir LED ışıkla sertleştirme ünitesi kullanılarak 40 sec boyunca ışıkla sertleştirilir. İki ürünün kompozisyonları ve dolgu seviyeleri hafifçe farklıdır ve bu nedenle biyofilmlerin üzerinde büyütüleceği farklı yüzey topografileri oluştururlar.
    1. İlgili substratların numuneleri, adım 2.1 yerine diğer disiplinlerden gelen yerleşik protokoller kullanılarak hazırlanabilir.
  2. Numuneleri kabul edilebilir bir nihai yüzey finişine gelene kadar, örneğin yarı otomatik bir taşlama-polisaj cihazı kullanarak bitirin ve parlatın. Parlatılmış numuneleri ultrapure su ile durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun.
  3. Numuneleri etilen oksit gazı veya alternatif bir sterilizasyon yöntemi kullanarak sterilize edin.

3. Biyofilm Büyümesi

  1. Tek bir S. mutans kolonisini 4 ml gecelik kültür ortamına inoküle edin (adım 1.1). 37 °C'de 16-18 saat boyunca gecelik olarak inkübe edin. Kültürün optik yoğunluğu (OD600) ≥0,9 olmalıdır.
    1. Daha tutarlı biyofilm büyümesi sağladığı için, orijinal stoktan 2 kez pasajlanmış plaka kültürlerinden bir koloni kullanılması en iyisidir.
  2. Gecelik kültürü (adım 1.1) kullanarak 10 ml biyofilm büyüme ortamında (adım 1.3) 1:100 oranında bir dilüsyon hazırlayın.
  3. Steril rezin kompozit örnekleri (örn. PF, TP) steril 12 kuyucuklu plakalara aktarın.
  4. Tedavi (ağız çalkalama suyu) ve kontrol grupları için kuyucuklara 2,5 ml dilüe kültür ortamı (adım 3.2) ekleyin. Sterilite kontrol kuyucuklarına 2,5 ml steril, inoküle edilmemiş biyofilm büyüme ortamı ekleyin.
  5. Biyofilmleri mikroaerofilik koşullar altında büyütün. Plakaları, 37 °C'deki bir inkübatör içinde 100 rpm hızındaki bir çalkalayıcıya 24 saat boyunca yerleştirin.
  6. 24 saat sonra, tüm kuyucuklardaki ortamı aseptik olarak aspire edin ve her yıkamadan sonra PBS'yi aspire ederek steril PBS ile iki kez yıkayın (adım 1.4; 2,5 ml/kuyucuk). Her kuyucuğa 2,5 ml taze biyofilm büyüme ortamı ekleyin ve toplam biyofilm büyüme süresi 48 saat olacak şekilde, önceki adımla aynı koşullar altında ek 24 saat daha inkübe edin.
  7. Yukarıdaki adımlar yerine, diğer türlerin biyofilmleri yerleşik protokoller kullanılarak substratlar üzerinde büyütülebilir.

4. Antibakteriyel/Ağız Çalkalama Tedavileri

  1. Biyofilm büyümesi tamamlandıktan sonra besiyerini aspire edin.
  2. Tedavi grupları için kuyucuklara 2,5 ml Biotène PBF (BIO) veya Listerine Total Care (LTO) ağız çalkalama suyu ya da başka bir tedavi yöntemi ekleyin ve kontrol grubu kuyucuğuna 2,5 ml steril ultrapure su ekleyin. Üretici talimatlarına uygun olarak, plakaları 150 rpm hızında orbital bir çalkalayıcıda sallarken örnekleri 60 sn boyunca daldırın. Ağız çalkalama suyunu ve ultrapure suyu kuyucuklardan hemen aspire edin.
  3. Örnekleri, 150 rpm hızındaki orbital çalkalayıcıda her yıkama için 15 sn boyunca steril ultrapure su ile 5 kez yıkayın ve her yıkama adımından sonra suyu aspire edin.
  4. Yukarıdaki adımların yerine, yerleşik protokoller kullanılarak diğer antibakteriyel ajanlar test edilebilir.

5. Boyama

  1. Biyofilm analizi için boya dilüsyonlarını hazırlayın.
    1. 0.1 M sodyum bikarbonat pH 8.3 içerisinde 5 mg/ml Concanavalin A, Alexa Fluor 647 konjuge (AF) stok çözeltisi hazırlayın. Dondurma ve çözme işlemlerinden kaçınılması gerektiği için tek kullanımlık alikotlar halinde -20 °C'de birkaç ay boyunca saklayın. Bu AF stok çözeltisini kullanarak, TC tamponunda 250 μg/ml'lik bir dilüsyon hazırlayın.
    2. Üretici tarafından sağlanan 5 mM Syto 9 stok çözeltisini (SY) kullanarak, TC tamponunda 10 μM'lık bir dilüsyon hazırlayın. Kalan SY stok çözeltisini birkaç ay boyunca -20 °C'de saklayın.
    3. Üretici tarafından sağlanan 5,000x Sypro Red stok çözeltisini (SR) kullanarak, steril ultrapure su içerisinde 10x dilüsyon hazırlayın. Kalan SR stok çözeltisini birkaç ay boyunca -20 °C'de saklayın.
  2. Tüm biyofilmleri, el ile dairesel sallama hareketi kullanarak 2x TC tamponu (2.5 ml/kuyu) ile yıkayın ve ikinci yıkamanın oda sıcaklığında 30 dk boyunca plakta kalmasını sağlayın. Aspire edin.
  3. Her biyofilm örneğinin üzerine 50 μl AF boyası damlatın. Işıktan korunmuş şekilde, oda sıcaklığında 30 dk boyunca boyayın. Her yıkama sonrası aspire ederek TC tamponu (2.5 ml/kuyu) ile 2x yıkayın.
  4. Ardından, her biyofilm örneğinin üzerine 50 μl SY boyası damlatın. Işıktan korunmuş şekilde, oda sıcaklığında 30 dk boyunca boyayın. Her yıkama sonrası aspire ederek steril ultrapure su (2.5 ml/kuyu) ile 2x yıkayın.
  5. Son olarak, her biyofilm örneğinin üzerine 50 μl SR boyası damlatın. Işıktan korunmuş şekilde, oda sıcaklığında 30 dk boyunca boyayın. Her yıkama sonrası aspire ederek steril ultrapure su (2.5 ml/kuyu) ile 3x yıkayın.
  6. Konfokal mikroskobiyi kolaylaştırmak için örnekleri, her kuyuda 6 ml steril ultrapure su olacak şekilde bir 6 kuyulu plaka transfer edin.

6. Konfokal Lazer Taramalı Mikroskopi Kullanarak Görüntüleme

  1. Tedavi ve kontrol gruplarının biyofilmleri içindeki her bir bileşenin (boyanın) görüntülerini, Tablo 1'de gösterilen konfokal lazer tarama mikroskobu ayarlarını kullanarak elde edin. Bu çalışmada, 2,2 mm çalışma mesafesine sahip 0,9 sayısal açıklıklı 63X daldırma objektif kullanılmıştır.
    Biyofilm boyama çizelgesi; EPS, nükleik asitler ve proteinler için lazer dalga boyları (nm) ve emisyon bantları (nm).
    Tablo 1. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu Ayarları.

  1. Kantitatif analiz için yeterli çözünürlükte CLSM görüntüleri elde etmek amacıyla, tarama boyutunu 250 μm x 250 μm ve minimum piksel çözünürlüğünü 512 x 512 olarak ayarlayın.
  2. Biyofilm görüntü yığınının üst ve alt noktalarını belirlemek için SY boyasını kullanın, ardından z-adımını kantitatif analiz için uygun olacak şekilde ayarlayın (bu çalışma için 0.6 μm). Tarama yapmadan önce, QLUT seçeneğini kullanarak görüntü ve boyama parametrelerini (i.e. PMT voltajı ve offset) optimize edin. 3D rekonstrüksiyonda her bir biyofilm bileşenini daha ayırt edilebilir hale getirmek için her boyaya psödo-renkler atamak amacıyla bir renk bakma tablosu kullanılmıştır (SY için yeşil, SR için kırmızı ve AF için mavi).
  3. Aynı biyofilm içindeki birden fazla boyanın görüntülerinin yakalanmasını optimize etmek için "yığınlar arası" modda ardışık tarama kullanarak 400 Hz'de CLSM görüntüleri toplayın.

7. Biyofilm Yapısal Analizi

  1. Biyofilmler için görüntü analiz yazılımı kullanarak toplanan CLSM görüntülerini analiz edin. Aşağıdaki adımlar, toplanan biyofilm görüntülerinin yapısal parametrelerini hesaplamak için ISA3D yazılımının12 kullanımını açıklamaktadır.
    1. Yazılım kılavuzunda belirtildiği şekilde, her biyofilm için CLSM görüntü dosyalarını Images klasörüne kopyalayın. Yazılım tarafından gerekli olan CLSM dosyaları adlandırma kuralına uyulduğundan emin olun. Yazılım, alt klasörlerdeki dosyaların toplu modda analiz edilmesine izin verir, böylece aynı çalıştırmada tedavi ve kontrol grubu biyofilmlerinin analizini kolaylaştırır.
    2. CLSM görüntülerinin x, y ve z ekseni boyutlarını ana iletişim kutusundaki dxy ve dz alanlarına girin. Yazılım kılavuzunda açıklandığı şekilde eşik ve mesafe eşleme ayarlarını seçin (bu çalışmada sırasıyla Otsu ve Quasi-Euclidean kullanılmıştır). Sonuç dosyası için uygun bir isim girin ve ardından programı çalıştırın. ISA klasöründe bir sonuç dosyası oluşturulacaktır.
    3. Biyofilm içindeki her bir bileşenin (boyanın) 3 boyutlu dağılımını nicelendiren biyohacim ve ortalama biyofilm kalınlığı (bu çalışmada ölçülen) gibi yirmi 3D yapısal parametre12 değerini elde etmek için sonuç dosyasını görüntüleyin.

8. Biyofilm Yapısının Görüntülenmesi

  1. Görüntü analiz yazılımı kullanarak her bir biyofilm içerisindeki üst üste binmiş bileşenlerin (boyaların) yeniden yapılandırmasını oluşturun. Aşağıdaki adımlar, 3D yeniden yapılandırmalar oluşturmak için Volocity yazılımının kullanımını açıklamaktadır.
    1. Kılavuzda açıklandığı şekilde, CLSM görüntü dosyalarını yazılıma kopyalayarak her bir biyofilm için bir kütüphane oluşturun.
    2. Her bir biyofilmin CLSM görüntülerinden yeniden yapılandırılmış bir 3D görüntü üretmek için 3D Renderer menü seçeneğini kullanın (bu çalışma için HR Opacity formatı kullanılmıştır).
    3. Tüm biyofilmleri x-, y- ve z-koordinat eksenlerine göre benzer şekilde yönlendirmek için 3D görüntüyü döndürün. Doğru şekilde yönlendirilmiş biyofilm yeniden yapılandırmasının bir anlık görüntüsünü alın ve ardından bu görüntüyü TIFF, JPEG veya başka bir uygun formatta dışa aktarın.
  2. Yeniden yapılandırılmış görüntüler üzerinde, biyofilmler içerisindeki EPS, proteinlerin ve nükleik asit bileşenlerinin eş zamanlı dağılımının görsel analizini gerçekleştirin.
  3. Birden fazla biyofilm bileşeninin kolokalizasyon analizini gerçekleştirmek için Pearson korelasyon katsayısı ve Manders örtüşme katsayısını kullanın (bu çalışmada kolokalizasyon ölçülmemiştir).

9. İstatistiksel Analiz

  1. Ağız çalkalama solüsyonu ve kontrol grupları arasındaki yapısal parametrelerin ortalama değerlerini karşılaştırmak için ayrı karma modeller istatistiksel analizleri kullanın (α=0.05). Bu çalışmada, istatistiksel analizleri gerçekleştirmek için SAS yazılımı kullanılmıştır.

Sonuçlar

İşlemler (ağız çalkalama suları) ve işlem görmemiş kontrol grubu için temsili sonuçlar Tablo 2'de ve Şekil 1 ile Şekil 2'de gösterilmiştir. Tablo 2, ISA3D yazılımı kullanılarak hesaplanan biyofilm yapısal parametreleri biyovolüm (μm3) ve ortalama biyofilm kalınlığının (μm) ortalama ve standart sapma değerlerini göstermektedir. Ağız çalkalama suyu ile tedavi edilen biyofilmlerin, kontrol grubundaki biyofilmlerden önemli ölçüde farklılık gösteren (p<0.05) yapısal parametrelerinin ortalama ve standart sapma değerleri kırmızı ile vurgulanmıştır. Karma modeller istatistiksel analizlerinin sonuçları, BIO ağız çalkalama suyunun her iki rezin kompozit üzerinde kontrolden önemli ölçüde farklı biyofilm yapıları oluşturduğunu (p<0.05), buna karşın LTO ağız çalkalama suyunun her iki rezin kompozitte de anlamlı farklılıklar oluşturmadığını (p>0.05) ortaya koymuştur. Sonuçlar, iki ağız çalkalama suyu uygulamasından sonra kalan hücresel ve hücre dışı biyofilm bileşenlerinin farklı olduğunu açıkça göstermektedir. Ayrıca, iki substrat (PF ve TP) üzerinde büyütülen S. mutans biyofilmlerinin, benzer koşullar altında büyütülmelerine ve her iki substratın benzer aşındırıcılarla cilalanmış olmasına rağmen 3B yapı bakımından farklılık gösterdiği belirtilmelidir.

EPS, proteinler ve nükleik asitlerin biyofilmler içindeki eş zamanlı dağılımı, Volocity yazılımı kullanılarak oluşturulan 3D rekonstrüksiyonlar aracılığıyla görselleştirilebilir. Şekil 1 ve 2, sırasıyla PF ve TP rezin kompozitler üzerinde büyütülen kontrol grubu biyofilmlerinin temsili rekonstrüksiyonlarını göstermektedir. Mavi boyama S. mutans biyofilmleri içindeki EPS'yi, yeşil boyama nükleik asitleri ve kırmızı boyama proteinleri temsil eder. Aradaki boşluklar su veya floresanla işaretlenmemiş diğer biyofilm bileşenleri ile dolu olabilir.

3D dağılım grafiği, dinamik veri görselleştirme, grafik, etkileşimli araştırma aracı, analitik ekran.
Şekil 1. Kontrol grubunda (ağız çalkalama solüsyonu ile tedavi edilmemiş) PF reçine kompozit üzerinde büyütülen S. mutans biyofilminin temsili bir 3D rekonstrüksiyonu. Tek bir biyofilm içindeki üç boyanın eş zamanlı üst üste bindirilmesi; S. mutans biyofilmleri içindeki EPS (mavi boya), nükleik asit (yeşil boya) ve protein (kırmızı boya) bileşenlerinin aynı anda görselleştirilmesine olanak tanır. (1 Birim = 24 μm). Şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayın.

3B hücresel yapı görselleştirmesi, floresan mikroskobu, uzamsal veri analizi, bilimsel grafik.
Şekil 2. Kontrol grubunda (ağız çalkalama suyu ile tedavi edilmemiş) TP reçine kompoziti üzerinde büyütülen S. mutans biyofilminin temsili bir 3B rekonstrüksiyonu. Tek bir biyofilm içindeki üç boyanın eş zamanlı üst üste bindirilmesi, S. mutans biyofilmleri içindeki EPS (mavi boya), nükleik asit (yeşil boya) ve protein (kırmızı boya) bileşenlerinin aynı anda görselleştirilmesine olanak tanır. (1 Birim = 24 μm). Şeklin daha büyüğünü görüntülemek için buraya tıklayın.

Rezin kompozitNokta 4TPH3
Ağız çalkalama suyuBileşenBV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBFNükleik Asitler279,517±53,2919.32±2.80195,033±42,0147.45±3.70
EPS344,902±56,38635.22±17.19197,840±62,3519.83±7.26
Proteinler298,796±62,86854.21±21.65216,033±66,65424.33±39.64
Listerine Total CareNükleik Asitler355,707±110,44426.45±14.21273,296±47,32313.43±2.89
EPS494,099±180,59264.90± 26.68329,150±47,14534.35±30.32
Proteinler348,416±161,31658.68±47.28303,150±54,70534.18±41.46
Kontrol (işlem görmemiş)Nükleik Asitler388,375±42,15251.15±40.66327,809±39,40017.08±1.65
EPS660,448±173,19791.37±74.84363,850±67,61228.33± 15.07
Proteinler517,274±119,475127.96±73.84353,161±56,51821.17±4.41

Tablo 2. BIO veya LTO ile tedavi edilen veya tedavi edilmeyen (kontrol grubu) biyofilmlerin Biyohacim (BV) ve Ortalama biyofilm kalınlığının (MT) ortalama ve standart sapma değerleri. Ağız çalkalama sularıyla tedavi edilen biyofilmlerin, kontrol grubundaki biyofilmlerinkinden anlamlı derecede farklı olan (p<0.05) yapısal parametrelerinin ortalama ve standart sapma değerleri kırmızıyla vurgulanmıştır.

Tartışma

CLSM görüntülerinin elde edilmesi, biyofilmlerin nicelleştirilmesi ve kolokalizasyon analizi için gerekli şekilde ve formatta gerçekleştirilmelidir, öyle ki, her görüntüdeki sinyal yoğunluğunun dağılımı, biyofilm yığınındaki her bir florokromun dağılımının güvenilir bir temsilidir. Sinyal yoğunluğu, gürültü ve arka plandan10,11 ayırt edilebilir olmalı, alt tabakadan otofloresanstan etkilenmemeli ve kullanılan florokromlar11 arasındaki spektral girişim nedeniyle minimum kanamaya sahip olmalıdır. Gürültü, floresan mikroskobu11'in kaçınılmaz bir sınırlamasıdır ve görüntü kalitesi bazen teknik veya lojistik nedenlerle sınırlı olabilir. Minimum spektral örtüşme ile florokromların tanımlanması, bu yöntemin başarısı için kritik öneme sahiptir, ancak karmaşık olabilir. Ayrıca, çoklu florokromların miktarının belirlenmesi çok faktörlü bir problem teşkil etmektedir. Bu nedenle, çok az sayıda araştırmanın biyofilm yapıları içinde ikiden fazla bileşenin eşzamanlı dağılımını başarılı bir şekilde ölçmüş olması şaşırtıcı değildir.

Bu çalışmanın amacı, biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı 3 boyutlu dağılımlarının ölçülmesi ve karşılaştırılması için farklı ancak birbirine bağlı adımlardan oluşan bir metodolojiyi rapor etmekti. Açıklanan biyofilm büyüme testi, ilgili substratlar üzerinde biyofilm büyümesine izin verir ve Tablo 1'de bildirilen sonuçlarla gösterildiği gibi tekrarlanabilir biyofilm yapıları üretir. EPS, proteinler ve nükleik asit bileşenlerinin yeni eşzamanlı boyanmasının 3D biyofilm yapısal parametrelerinin ölçümü ile kombinasyonu, biyofilmler içindeki bileşenlerin ölçülebilir dağılımları ile sonuçlanır. EPS, proteinler ve nükleik asidin biyofilmler içindeki eşzamanlı dağılımının kalitatif görsel analizi, her bir biyofilm içinde üst üste bindirilmiş lekelerin yeniden yapılandırılması yoluyla mümkündür. ISA3D yazılımı12 , biyofilmlerin 3D yapılarının nicelleştirilmesini geliştirmek için gözeneklilik ve biyofilm kalınlığı gibi geleneksel olarak ölçülen parametrelere ek olarak fraktal boyut, homojenlik ve biyofilm pürüzlülük katsayısı gibi birkaç benzersiz yapısal parametre içerir. Biyofilm yapısal parametrelerinin istatistiksel analizi, antibakteriyel/zehirli boya etkinliği (örneğin gargaralarla tedaviden sonra) veya zaman içinde (zamansal etkiler) gibi belirli deneysel koşullar altında biyofilmlerin ilgili karşılaştırmalarını kolaylaştırır.

Bu metodoloji, ilgili substratlar üzerinde büyütülen S. mutans biyofilmleri içindeki üç ana bileşenin eşzamanlı 3D dağılımlarını verimli ve başarılı bir şekilde ölçtü ve karşılaştırdı, böylece biyofilm bileşenlerinin eşzamanlı değerlendirilmesindeki iki zorluğun üstesinden geldi. Bu yöntem, bu çalışmada gargaralar kullanılarak gösterildiği gibi, antibakteriyel tedavilerin veya çoklu biyofilm bileşenlerine karşı zehirli boya önlemlerinin etkinliğini belirlemek için de kullanılabilir. Ayrıca, yukarıda açıklanan protokollerin çoğu, ilgili substratların üretimi ve ilgili mikroorganizmaların biyofilm büyüme deneyleri için protokollerle değiştirilebilir. Bu nedenle, bu yöntem, tıp, dişçilik, jeoloji ve deniz bilimleri dahil olmak üzere çeşitli disiplinlerde in vitro ve in vivo biyofilmlerin 3D yapılarının/mimarisinin karşılaştırılmasını kolaylaştırdığı için geniş bir uygulamaya sahiptir.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Bu makaleye üretim ve Ücretsiz Erişim Leica Microsystems tarafından desteklenmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışmanın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri/NIDCR hibesi 1R15DE019566-01A1 tarafından sağlanmıştır. Jim Henthorn (OUHSC Akış ve Görüntü Sitometrisi Laboratuvarı), konfokal lazer tarama mikroskobu konusunda teknik yardım sağladığı için kabul edilmektedir. Dr. Fernando Esteban Florez (Diş Malzemeleri Bölümü) bu videonun çekimi sırasında teknik yardım sağladığı için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bacto AgarBecton, Dickinson ve Şirketi214010
Bacto Todd Hewitt Et SuyuBecton, Dickinson ve Şirketi249240
Maya Özü, GranülEMD Millipore1.03753.0500
Bacto TriptonBecton, Dickinson ve Şirketi211705
OmniPur SükrozEMD Millipore8510
Potasyum Klorür, ACS reaktifi, %99.0-100.5Sigma-AldrichP3911-500G
Potasyum Fosfat, monobazik vb.; %99,0, ACS reaktifiSigma-AldrichP0662-500G
Sodyum KlorürSigma-AldrichS9888-500G
Sodyum Fosfat, Monobazik, MonohidratEMD MilliporeSX0710-1
Tris(hidroksimetil)aminometan, %99,8+, ACS reaktifiSigma-Aldrich252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 KonjugeİnvitrojenC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro KırmızıInvitrogenS12012 veya S6653
Biot & egrave; ne PBF Ağız ÇalkalamaGlaxoSmithKlineN/A
Listerine Total CareMcNeil-PPC, Inc.Yok
, ,

Kaynaklar

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  3. Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).
  4. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. J. Vis. Exp. , (2011).
  5. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).
  6. Robinson, J. P. Principles of confocal microscopy. Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).
  7. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).
  8. Wood, S. R., et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).
  9. Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).
  10. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).
  11. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).
  12. Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. Three-dimensional biofilm structure quantification. J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyofilm NicemlemesiKonfokal MikroskopiH cre D Polimerik MaddelerN kleik Asit BoyamaProtein BoyamaBiyofilm Yap sal Analizi3B G r nt Rekonstr ksiyonustatistiksel AnalizA z alkalama TedavisiStreptococcus Mutans
Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.