Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı

22.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50644

⸱

19 Ekim 2013

 , 
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Bu makalede

Özet

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit edilebilir In situ Melezleme. Bizim geliştirilmiş protokol düşük spesifik olmayan arka plan sinyal düşük bol transkript tespiti için izin verir.

Özet

Bu makale Zebra balığı embriyolarının in situ hibridizasyon (DİLERİZ) in tüm montaj odaklanır. WISH teknoloji doku dağılım ve gelişim aşamasında açısından hem de gen ifadesinin değerlendirilmesi kolaylaştırır. Protokoller digoksijenin ile etiketlenmiş antisens RNA probları kullanılarak zebrabalıkları embriyoların WISH kullanımı tarif edilmektedir. Problar klonlanmış ve lineerize edilmiş gen şablonlar in vitro transkripsiyon yoluyla digoksigenin-bağlı nükleotit ilave edilerek oluşturulur. Belirlenen gelişim aşamalarında hasat embriyoların chorions spesifik problar ile inkübasyondan önce kaldırılır. Aşırı prob kaldırmak için bir yıkama işlemi sonrasında, embriyolar alkalin fosfataz ile konjuge edilmiş anti-digoksigenin antikor ile inkübe edilir. Alkalin fosfataz için bir kromojenik substrat kullanılarak, belirli bir gen ekspresyonu tespit edilebilir. Gen ifade seviyesine bağlı olarak tüm işlem 2-3 gün içinde tamamlanabilir.

Giriş

Zebra balığı (Br.rerio) omurgalı geliştirme, hastalık, davranış çalışma için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya, ve-ilaç tarama 1-3 oldu. Balığı embriyolar, tek bir geçiş yerinden çok sayıda temin edilebilir. Gübreleme ve geliştirme eski rahim ve optik açık embriyoların hızla geliştirmek oluşur. Kritik gelişimsel olaylar ilk 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) meydana gelir. Bu organın taslakları ortaya ve hücre farklılaşması ve başlanması. Proteinlerin demonte veya aşırı ifadesi, morfolino antisens (MO) oligonükleotidlerle embriyoların mikroenjeksiyon yoluyla elde ya da bir ya da iki hücreli aşamada (0,75 HPF) sırasıyla mRNA olabilir.

Zebra balığı embriyoların DİLERİZ ilgi belirli genlerin uzay-zamansal ifade çalışma kolaylaştırır. DİLERİZ tekniğin uygulama aşırı ifade için mRNA veya MO ile embriyo mikroenjeksiyon takipess veya demonte özel protein düzeyleri diğer genlerin diferansiyel düzenleme ortaya koymaktadır.

Gen ekspresyonu değişiklikleri fenotipik değişikliklerle ilişkili ve erken organogenez sırasında hedef genlerin işlevini ortaya olabilir. Probes hazırlanmış ve önceden depolanmış olabilir, çünkü ISH tekniği altı oyuklu plakalar ve özel yapılmış sepet ile aynı anda en az 20 gen için gen ekspresyonu ortaya çıkarmak için uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Zebra balığı Embriyolar Yerinde Hibridizasyon Tüm montaj

Embriyolar 1.1 hazırlanması

  1. Gerekli gelişim aşamalarında embriyolar toplayın. Embriyonik aşamada açıklaması için Kimmel ve ark. 5 bakınız.
  2. Elle forseps (Dumont Saatçiler yok. 5 Forceps) kullanarak chorions çıkarın.
  3. PBS içinde yapılan paraformaldehid% 4 çözelti (PFA) embriyolar saptamak 4 ° C de bir gece (fosfat tamponlu tuzlu eriyik)
  4. En az 3 kat, oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca PBS ile embriyolar yıkayın.
  5. In situ hibridizasyon bütün montaj dahil olmak üzere tekniklerin yönelik uygulama için kullanılana kadar -20 ° C'de% 100 metanol (MeOH) içerisinde deposu embriyolar.
  6. Freeze -80 ° C de RNA çıkarma ve mağaza için sıvı azot içinde embriyolar sahnelenen
  7. Sahnelenen embriyolardan RNA Özü ve PCR ve sonraki klonlama için cDNA sentez.

Digoxygenin-etiketli RNA Problar 1.2 sentezi

  1. Prob şablonu için PCR ve gen klonlama. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, 50 ul'lik toplam hacmi Kur PCR reaksiyonu. Genomik ya da daha fazla DNA şablon olarak PCR reaksiyonunda az cDNA kullanın. 72 C'de 10 dakika uzatma süresi dahil ° C PCR reaksiyon ürünleri TOPO klonlama kolaylaştırmak amacıyla adenylated tam uzunlukta ve 3 'olduğundan emin olmak için, son çevrimin aşağıdaki.
Reaktif Hacim
Şablon DNA, 100 ng
PCR Buffer (10x) 5 ul
dNTP (10 mM) 2 ul
Astarlar (10 mM) 1 uM, her
Bir son hacme kadar su ilave 49.7 ul
Taq Polimeraz (5 adet / & #956; l) 0.3 ul
Reaksiyon hacmi 50 ul

Tablo 1. PCR reaksiyonu.

  1. Agaroz jel elektroforez kullanılarak PCR ürününün büyüklüğü kontrol edin. Prob sentezi için PCR ürününün tahmini boyutu 1 kb civarındadır.
  2. Steril koşullar altında deney yapan ve nükleaz ücretsiz su kullanarak nukleaz kirlenmesini önlemek için özel dikkat gösterin. Birden fazla ürün gözlemlenmesi durumunda, TOPO TA klonlama kiti kullanılarak klonlama ile devam etmeden önce uygun büyüklükte PCR ürünü jel arındırmak. Bulaşması ve çoklu bant görünümü ortadan kaldırmak için optimize PCR reaksiyonu.
  3. Tablo 2'de belirtildiği gibi TOPO klonlama reaksiyon gerçekleştirin. Vektör ve TOPO PCR ürünü, birleştirin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Reaktif Kimyasal Competent Cells'e Elektro Yetkili Hücreler Taze PCR reaksiyon ürünü 1-4 ul 1-4 ul Tuz Çözüm 1 ul Seyreltilmiş Tuz Çözüm 1 ul Su 5 ul hacmi toplam kadar 5 ul hacmi toplam kadar TOPO vektör 1 ul 1 ul Son Ses 6 ul 6 ul

Tablo 2. TOPO klonlama reaksiyon.

  1. Bir atış yetkili hücrelere TOPO klonlama ürün tanıtmak / dahil. Tbu işlem dönüşümü olarak adlandırılır.
  2. Antibiyotik direnç genlerinin ekspresyonunu sağlamak için 260 rpm'de, en az 1 saat boyunca 37 ° C 'de, dönüştürülmüş hücreler inkübe edin. Levha önceden ısıtılmış Luria Bertani (LB) 50 ug / ml ampisilin ve X-gal ihtiva eden agar plakaları üzerine dönüşüm karışımı (50-100 ul). 37 ° C de bir gece inkübe edilir.
  3. Beyaz veya açık mavi kolonilerin görünüşüne göre uç varlığını belirlemek. TOPO vektörü β-galaktosidaz kodlayan lacZ geni içerir. X-gal'ın olarak, β-galaktosidaz üretimi mavi renk oluşturur. Fonksiyonel β-galaktosidaz ve beyaz koloniler oluşumu bozan plasmid içine ligatlandı ve DNA üretilir. Beyaz koloniler veya açık mavi koloniler ucun varlığını doğrulamak.
  4. Steril pipet uçları kullanılarak agar plaka beyaz koloniler seçin ve sallayarak inkübasyon içinde 37 LB medya ve kültür 4 ml içeren steril 10 ml tüp ° C koyun200 rpm'de gece tor.
  5. Üreticilerin talimatlarına göre plazmid DNA kiti kullanılarak plazmid DNA arındırın.
  6. Elemanı 3 '(duyu problar için) veya 5' (antisens prob için) yer alan eşsiz bir bölgesi vardır, uygun sınırlama enzimi ile her bir prob için cDNA, 5 ug sindirilmesi ile cDNA aşağıdaki plazmid saflaştırma Linearize.
  7. Fenol / kloroform ekstraksiyon yöntemi kullanılarak doğrusallaştırılmış DNA arındırın. 4 13,000 rpm'de 3 dakika ° C ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde tepe, fenol / kloroform spin eşit hacimde Temiz tüpe üst sulu faz transfer ve kloroform eşit miktarda ekleyin. 4 ° C'de 13,000 rpm'de 3 dakika boyunca Spin Temiz bir tüp içine üst sulu faz transfer. Bir gece boyunca -20 ° C'de çökelti DNA ve saklamak için% 10 sodyum asetat (3 M) ve% 100 etanol içinde 2.5 x hacim eklemek. 4 ° C'de 13,000 rpm'de 15 dakika için Spin Etanol çıkarın ve% 75 etanol ile pelet yıkayın. Protokol durdurulabilir ve DNA st edilebilir-20 ° C'de ORed ve ertesi gün devam etti. 4 ° C'de 10,000 rpm'de 10 dakika için Spin Dikkatlice süpernatantı ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca pelet kurutun. 20 dakika boyunca 55 ° C'de DEPC su tedavi ve inkübe 10 ul pelletini. UV spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçmek.
  8. % 1 agaroz jel üzerinde, DNA 1 ul kullanarak ve yaklaşık 30 dakika boyunca çalışan agaroz jel elektroforezi ile saflığını değerlendirmek.
  9. RNA etiketleme reaksiyon ayarlayın. Bir RNaz serbest reaksiyon şişesi kullanılarak, 13 ul'lik bir hacme kadar DEPC ile muamele edilmiş, iki kez damıtılmış su, steril, RNaz içermeyen için şablon saflaştırılmış DNA 1-5 ug ekleyin. Buz üzerinde reaksiyon şişesi soğuk ve (bkz. Tablo 3), aşağıdaki reaktifler ekleyin:
Reaktif Hacim
NTP etiketleme karışımı (10x) 2 ul
Transkripsiyon tutkunuer (10x) 2 ul
Koruyucu RNaz inhibitörü 1 ul
RNA Polimeraz SP6 veya
RNA Polimeraz T7 2 ul
Son Ses 20 ul

Tablo 3. RNA etiketleme reaksiyon.

  1. Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 2,000 rpm'de santrifüj ile kısa altında toplanır ve 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir Reaksiyon karışımı, daha sonra yavaşça reaktif karışımı ° C
  2. 37 ° C'de 30 dakika boyunca 2 ul RNase içermeyen DNase I inkübe ekleyerek, şablon DNA çıkarın ve 2 ul 0.2 M EDTA (pH 8.0) ilave edilerek, reaksiyon durur.
  3. 2.5 ul 4 M LiCI ve 75 ul% 100 etanol ilave edilerek reaksiyon ürünleri hızlandırabilir. Çözüm karıştırın ve 45 dakika o için -20 ° C'de tutmakR, -20 ° C'de saklanan aşırı gece ve protokol ertesi gün devam etti.
  4. 2 dakika boyunca kuru bir 10 dakika boyunca -20 ° C de muhafaza santrifüj 500 ul% 70 etanol ile pelet yıkama, daha sonra 4 ° C'de 13,000 rpm'de 30 dakika boyunca santrifüje süspansiyonu, 50 ul içinde yeniden süspanse ve inkübe 37 ° C'de 30 dk
  5. Yaklaşık 30 dakika boyunca% 1 agaroz jeli üzerinde 1-2 ml çalıştırarak prob kalite ve bütünlüğünü doğrulamak. Bu jel üzerinde beklenen boyutta çalışan tek bir ürünün varlığı ile teyit edilir.
  6. Spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ölçerek prob konsantrasyonunu ölçmek. Bu reaksiyondan elde edilen RNA verimi 10 mg (ul / 100-200 ng) ile ilgilidir.

Yerinde Hibridizasyon 1.3 Tüm montaj

  1. 1. GÜN
    1. Rehidrasyon
      1. Naylon örgü (en az 1 mm gözenek boyutu) ve Eppendorf tüpler kullanılarak sepet hazırlayın. Cuttin tarafından sepetleri ConstructEppendorf tüpleri gr (1.5 mL) konik uçları kaldırın. Bireysel sepetleri farklı renkli tüpleri kullanmayın belirlemek ve üst kaldırmak için bunların yarısından itibaren jantlar.
      2. Eppendorf tüpleri arasında kesik uçlara kapsayacak şekilde naylon örgü küçük parçalar. Bir davlumbaz bir elektrik sıcak plaka (yüksek, orta arasında ayarlanabilir) bunları ısıtarak naylon örgü için tüplerin kesim uçları sopa. Soğuduktan sonra sepet gelen aşırı naylon örgü çıkarın ve oda sıcaklığında% 100 metanol saklayın.
      3. % 100 ardından altı oyuklu plakalar ilk üç kuyu kullanarak PBS içinde metanol art arda seyreltmeleri (% 75 [hacim / hacim [metanol,% 50 [hacim / hacim] metanol ve% 25 [hacim / hacim] metanol) hazırlanması PBST (fosfat% 0.1 Tween-20 içeren tamponlu tuz) önümüzdeki üç kuyularda.
      4. In situ figureâ 1a ve b'de gösterildiği gibi, özel yapılmış sepet kullanılarak melezleştirme prosedürü tabi embriyolar. Hibridizasyon için RNaz ücretsiz çözümler kullanın6-delikli plakalardaki yon Adım (4 ml / oyuk). Bu amaca ulaşmak için, iyi ilk 6 sepet kadar yerleştirin. Jant ile yer sepeti ilk ardışık düzenlenmiş farklı renklerde jantlar olmadan sepetleri izledi. 6 adede kadar gen ekspresyonu için bu düzenleme kullanılarak eş zamanlı olarak tespit edilebilir.
      5. Aynı sepet (bkz. Şekil 1) için aynı gelişim aşamasının susuz embriyolar yerleştirin.
      6. Altı-plaka de bir sonraki (her adım için 5 dakika) sepet taşıyarak embriyolar rehidrate. Uygun bir tampon ile dolu altı kuyu kullanın. Embriyolar kez her seyreltme tabi tutulur. Bu şekilde embriyolar 6x, 5 dak / yıkama yıkanır. Susuz embriyoların rehidrasyon ve daha sonra% 100 PBST ile 3 kez yıkanarak PBS ile metanol değiştirilmesi ile elde edilir.
    2. Tablo 4 'de gösterildiği gibi geçirgenliği Digest oda sıcaklığında proteinaz K (10 mg / ml) ile rehidrate embriyolar geçirgen hale getirilmesinin .
      Embriyonik Evre (saat sonra döllenme) Sindirim Dönem (proteinaz K)
      6'ya kadar 15 sn
      6-12 30 sn
      12-18 3 dk
      24 12-15 dk
      48 25-30 dk
      72 40 dakika
      96-120 50 dakika

      Tablo 4. Permeabilization reaksiyon.

    3. Postfiksasyon ve PBST Yıkama
      1. 20 dakika boyunca 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehid (ağırlık / hacim) içinde inkübe edilerek embriyolar düzeltildi.
      2. Embriyolar 3x yıkama artık paraformaldehid çıkarın, 5 1x PBST dakika / yıkama,.
    4. Asetilasyon, her biri 10 dakika için iki kere asetilasyon karışımı (10 mi GKD 2 O 125 ​​ul, trietanolamin ve 27 ul asetik anhidrid) ve inkübe embriyolar hazırlayın. Gerektiğinde endojen fosfataz aktivitesi en aza indirmek için, taze asetilasyon karışım hazırlayın. Aşırı reaktif kaldırmak için, (10 dk / yıkama) PBST iki kez embriyolar yıkayın
    5. Prehybridization 1.5 ml steril Eppendorf tüplerine sepet embriyolar transfer ve 70 ° C su banyosunda 2-4 saat için 200 ul hibridizasyon karışımı ile kuluçka embriyolar Prehybridize.
    6. Antikor Preadsorption sepetleri yaklaşık 50 embriyo çıkarın ve bir 1.5 ml steril Eppendorf tüpleri aktarabilirsiniz. Blokaj tamponu ile anti-DIG-AP (1:500) antikoru (1x PBST,% 2 dana serumu [hacim / hacim], 2 mg / ml sığır serum albumini [BSA]) 2-4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 4 ° C gecede de saklayın. Bir sabah inkübatör kaldırd embriyolar oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
    7. Hibridizasyon prehybridized embriyoların prob 100-200 ng ekleyin ve 70 gece boyunca inkübe ° C su banyosunda.
  2. 2. GÜN
    1. SSC (Tuzlu-sodyum sitrat) yıkar
      1. Hibridizasyon karışımı Sıra 50 ml tüpler (HM), bir 70 ° C su banyosu içinde, su ve en az 20 dakika boyunca bunların ön ısıtılması ile beher 2x SSC ve 0.2x SSC. Prob hibridizasyonu içeren reaksiyon karışımı, kaldırma, tüpler, ön ısıtmalı melezleme karışımı, 1 ml, 70 ° C'de 15 dakika inkübe ° C , Ayıraç fazlasını uzaklaştırmak için% 25 HM ile en az% 50 ile% 100 HM ile değiştirerek 2x SSC, önceden ısıtılmış HM çeşitli seyreltileri ile altı oyuklu plakalar doldurun.
      2. Beklerken, yıkama için 2x SSC ile altı kuyucuğu doldurmak ve 70 onları tutmak ° C
      3. 15 dakika sonra yere sepet tüpten embriyolar seyreltme ile dolu altı plaka tutulur2x SSC ile HM s ve bir sonraki (70 ° C su banyosunda 15 dk) iyi birinden sepeti taşıyarak melez embriyolar yıkayın. 70 100% 2x SSC embriyolar 2x, 15 dakika / yıkama, yıkama ° C
      4. 65 başka bir su banyosu ° C ayarlayın Yüksek darlığı için 0.2x SSC ile altı kuyucuğu doldurun prob ile transkript spesifik olmayan hibridizasyon önlemek için yıkar.
      5. Embriyolar 70 ° 2x SSC ile iki kere yıkandı, sonra ° C, 0.2x SSC, 65 ek olarak iki 30 dakika yıkama takip ° C
    2. PBST Yıkama aşağıdaki gibi PBST 0.2x SSC, art arda seyreltmeleri ile altı oyuklu plakalar hazırlayın:% 75 (hacim / hacim) 0,2 X SSC,% 50 (hacim / hacim) 0,2 X SSC,% 25 (hacim / hacim) 0.2x SSC, ve kalan iki kuyu% 100 PBST ile. (Bir rocker kullanılarak oda sıcaklığında her bir adım boyunca 5 dakika) de bir sonrakine hareket ettirerek, sepetin melezleştirilmiş embriyolar yıkayın.
    3. Blo oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca ön kuluçkalama Preincubate embriyolarcking tamponu (1x PBST,% 2 dana serumu [hacim / hacim], 2 mg / ml BSA).
    4. ° C'de hafifçe çalkalanarak gece boyunca 4 ° tampon engelleme anti-DIG-AP antikoru (1:5,000) içindeki bir çözeltisi ile bir anti-DIG antikor inkübe embriyolar ile inkübasyon.
  3. 3. GÜN
    1. PBST Yıkama iyi 4 ml / PBST ile altı-iyi tabak hazırlayın. 15 dakikalık süre için 6x PBST ihtiva eden altı-plaka sepet hareket ederek inkübe edilmiş embriyolar yıkayın. Embriyolar, 4 ° C'de saklanan ve protokol ertesi gün devam edilebilir.
    2. BCIP varlığında (5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat) ve NBT (nitroblue tetrazolium) içinde kuluçkalamadan önce hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında prestaining tamponu ile 15 dakika boyunca 2 x yıkanarak embriyolar Prestain Prestaining. BCIP ve NBT alkalin fosfataz aktivitesinin renk gelişimi için kullanılan sübstratıdır. Sondalar Alkali fosfataz inci ile bağlı olduğundanmor renk e geliştirilmesi hedef genin ekspresyonunu gösterir. Embriyolar, 4 ° C'de saklanan ve protokol ertesi gün devam edilebilir.
    3. Boyanma
      1. 30 dakika boyunca BCIP ve NBT ile karanlıkta, oda sıcaklığında embriyolar inkübe edin.
      2. Boyama reaksiyon, bir stereo mikroskop kullanarak 30 dakika izler. Reaksiyon süresi genin ifade seviyesini bağlı olarak 15 dakika-16 saat arasında değişir. Reaksiyon süresi zayıf ifade genler için son derece olarak ifade edilen genlerin için daha kısa ve daha uzundur. Ilgi gen tamamlayıcı antisens (AS) transkript ifade ise Sense prob sinyalleri algılar.
    4. Arzu edilen boyama yoğunluğu sonra dur Reaksiyon ulaşıldığında, durdurma çözeltisi (1 x PBS, pH 5.5, 1 mM EDTA,% 0.1 Tween) ihtiva eden oyuklara embriyoları içeren sepet aktararak reaksiyonu durdurun. Bu renk daha da geliştirilmesi kaçınır. Nazik ag ile bir rocker 10 dakika 2x için embriyo durulamaOda sıcaklığında rehabilitasyonu amaçlayan.
    5. Postfiksasyon
      1. 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid (ağırlık / hacim) içinde embriyo inkübe edin.
      2. Kalıntı paraformaldehid çıkarmak için PBST ile embriyolar (5 dak / yıkama) üç kez yıkayın. 4 ° C de karanlıkta durdurma çözeltisi içinde sabitlenmiş embriyolar saklayın
    6. , Montaj Gözlem ve Resim Alma
      1. PBS mümkün olan en düşük hacmi ile% 100 gliserol ihtiva eden bir altı-plaka embriyolar aktarın. Bir rocker altı plaka koyun ve karanlıkta, oda sıcaklığında gece boyunca çalkalayın.
      2. % 100 gliserol embriyo yerleştirin ve daha sonra bir stereomikroskop altında sinyal gözlemlemek.
      3. Görüntüler Edinme ve TIFF dosya biçimi veya Photoshop (Şekil 3-6) olarak görüntü yazılımı aracılığıyla yüksek kaliteli görüntüler üretiminde izin başka bir türü olarak kaydedin.

2. Çift ben n Situ Hibridizasyon

  1. Çift elde etmek için 1.1 'den yukarıda tarif edilen yönteme markalama - 1.3.1.7 kullanılabilir, ancak hibridizasyon sırasında digoxygenin ve floresan işaretli problar eşzamanlı olarak inkübasyon içerir.
  2. Sonrası hibridizasyon yani SSC ve PBST yıkar (adımları 1.3.2.1 ve 1.3.2.2) ve engelleme inkubasyon (adım 1.3.2.3) yıkar için aynı prosedürü izleyin. Sıralı olarak aşağıda tarif edildiği gibi antikor ve boyama reaksiyonları gerçekleştirmek.
  3. 4 de AP çiftli-anti-digoxigenin antikor (1:5,000) ° yavaşça sallanarak C ile embriyolar inkübe edin.
  4. Yıkama ve BCIP-NBT (adımları 1.3.3.1 - 1.3.3.6) ile kuluçkaya yatmaktadır.
  5. Algılama ardından, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında iki kez PBST ile embriyolar yıkayın.
  6. Anti-digoksigenin antikor etkisiz hale getirmek için 30 dakika boyunca 1 mM EDTA ile 65 ° C 'de PBST embriyolar inkübe edin.
  7. % 75,% 50, ve% 25 metanol zekâ rehidrasyon takip% 100 metanol embriyolar inkübe1 saat için PBST geri saat PBST ve.
  8. 4 ° C sıcaklıkta hafifçe çalkalanarak tampon engelleme AP çiftli floresein (1:2,000) ile gece boyunca inkübe embriyolar.
  9. PBST (adım 1.3.3.1) ve 2 kez önceden lekeleme tampon maddesi ile 15 dakika boyunca ön-leke embriyolar embriyo yıkayın hızlı kırmızı varlığında önceden kuluçkaya hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında (0.1 M Tris-HCI, pH 8.2) . Protokol durdurulabilir ve embriyolar saklanabilir 4 ° C sıcaklıkta hafifçe çalkalanarak ve ertesi gün devam etti.
  10. Kullanımdan hemen önce, tampon boyama, 2 ml bir Hızlı Kırmızı tablet çözülür.
  11. Hızlı Kırmızı reaktif ile boyama tamponu embriyolar yerleştirerek boyama reaksiyon başlar.
  12. Istenen boyama yoğunluğu ulaşıldığında boyama reaksiyonu durdurun. 4 boyanması zaman gece boyunca bir ya da iki gün için oda sıcaklığında bir kaç saat arasında sürebilir ° C Boyama yoğunluğu daha da geliştirmek veya spesifik olmayan göstermeye başlar yoksa hemen reaksiyon durdurunanlamda kontrol ile karşılaştırıldığında Sığ.
  13. Yani kalan adımları sonrası tespit için yukarıda belirtilen işlemleri, montaj, gözlem ve görüntü elde etme (steps1.3.3.5 ve 1.3.3.6) izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sepet başına 50 embriyo (gen / başına deneysel koşul için) söz konusu genin ifade deseni bir deneyde elde edilebilir olan protokolü kullanarak. Hemen hemen tüm embriyolar belirli bir gen için benzer ekspresyonu göstermektedir. In situ hibridizasyon boyama için temsili örnekler Şekil 3-6 'de gösterilmektedir.

Anlamında ve anti-anlamda hem riboprobes PC5.1 karşılık gelen cDNAs, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, flk / kdrl ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz yüksek çözünürlüklü RNA görselleştirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirdik. In situ hibridizasyon prosedürlerinde gözenekli alt (Şekil 1) ile basit bir ölçüye sepet ile gerçekleştirilmektedir. Embriyolar, steril koşullar altında, oda sıcaklığında 6 oyuklu plakalarda RNase içermeyen çözeltiler kullanılarak işlenir.

Ayırmak için embriyolar sepetleri farklı renkli Eppendorf tüpleri yapılır. Ya da bir ağız olmadan Sepetler kolay yönlendirme için kulla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Taq PolimerazInvitrogen10342053
TopoTA Klonlama Kiti - Çift Promotör pCRII-TOPOInvitrogenK4650-01
HQ Mini Plazmid Saflaştırma KitiInvitrogenK2100-01
AgarozRoche11 685 660 001
Not1 ve HindIII Restriksiyon EnzimleriInvitrogen15441-025, 15207-012
Tampon Doymuş Fenol, ultra safInvitrojen155130394 ° C'de saklayın. Gözler, cilt ve solunum yolları tahriş edici ve şüpheli kanserojendir. Kullanım sırasında dikkatli olunmalıdır.
KloroformFisherC607-1Toksik ve şüpheli kanserojen. Çeker ocak altında çalışın.
RNaz içermeyen DNAse IRoche4716728001Küçük alikotlar hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
Sp6, T7 ve T3 RNA Polimeraz ile DIG-RNA Etiketleme KarışımıRoche11277073910
RNaz İnhibitörüRoche10777-019
3.0 M Sodyum Asetat (pH 5.5)Fisher50-751-7355
%100 EtanolTicari alkoller
Dietil Pirokarbonat (DEPC)Sigma40718-25MLDEPC göz, cilt ve solunum yolu tahriş edicidir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Koruyucu gözlük, eldiven ve maske kullanın.
NaOHFisherSS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0)Fisher50-751-7404
Anında Okyanus TuzuAkvaryum SistemleriN/A
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)FisherFL-03-0900
Paraformaldehit (PFA)SigmaP6148-1KG-20 ° C'de hazırlayın ve saklayın; Daha sonra kullanmak üzere 40 ml alikot olarak C. PFA toksiktir. Koruyucu gözlük, eldiven ve toz maskesi kullanın.
Feniltiyokarbomid (PTC)SigmaP7629-25GPTC oldukça toksiktir. Koruyucu gözlük, eldiven ve toz maskesi kullanın.
MetanolFisherA947-4
Dumont (Saatçi ' s) Forseps deseni no. 5İnce Bilim Araçları
Altı Kuyulu Hücre Kültürü KümesiSarstedt83.1839
Sepetler naylon ağ ve Eppendorf tüplerinden yapılmıştırŞirket içi hazırlıkSepetleri yapmak için, konik ucu çıkarmak için kenarlı veya kenarsız Eppendorf tüplerini (1,5 ml) kesin. Naylon ağı, boyutuna karşılık gelen küçük parçalar halinde kesin  Eppendorf tüplerinin kesik uçları. Kesilen ucu kaplayan naylon ağ ile tüpleri bir elektrik santralinin üzerine yerleştirin  hem tüp hem de naylon ağ birbirine yapışana kadar sıcak plaka (çeker ocakta gerçekleştirin). Sepetlerdeki fazla ağı kesin ve kullanılana kadar %100 metanol içinde saklayın.
Polioksietilenorbitan Monolaurat (Tween 20)SigmaP1379-500ML
Proteinaz KFermentasEO0491
Asetik AnhidritSigma242845
TrietanolaminSigma90279-100ML
Formamid, yüksek saflık derecesiSigmaF9037
AG501-X8 ReçineBio Rad142-6424
Sitrik Asit monohidratSigmaC0706-500G
Heparin Sodyum TuzuSigmaH3393-25KU
Salin-sodyum Sitrat Tamponu (SSC)SigmaS6639
fırıncı mayası tip X'ten tRNASigmaR5636-1ML
NaClFisherS640-500
Tris-HClFisherBP153-1
MgCl2FisherS25403
Levamizol HidroklorürSigma31742
N, N-Dimetilformamid < br / > susuz (DMF)Sigma227056Tahriş edici, toksik, yanıcı ve şüpheli teratojen. Eldiven ve gözlük de dahil olmak üzere uygun güvenlik kıyafetleri ile tutun.
5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP)SigmaN6639Bu çözeltiyi ışıktan koruyun.
Nitroblue tetrazolium (NBT)Sigma840WBu çözeltiyi ışıktan koruyun.
Sığır Serumundan Albümin, saflaştırılmış fraksiyon V (BSA)SigmaA8806
Koyun Anti-digoxigenin-AP Fab ParçalarıRoche1093274910
GliserolSigmaG5516-500ML
96 oyuklu hücre kültürü plakalarıSarstedt83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2ZIRCTg(mnx1:GFP)ml2
Anında OkyanusAkvaryum SistemleriN/A

Kaynaklar

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
  3. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
  4. Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
  5. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  6. Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
  7. Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
  8. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
  9. Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
  10. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
  11. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  12. Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
  13. Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
  14. Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
  15. Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
  16. Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
  17. Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
  18. Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156(2005).
  19. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
  20. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Gen Ekspresyon AnaliziAntisense RNA ProblarıDigoksinin İşaretlemeAlkalen Fosfataz DeteksiyonuKorionun UzaklaştırılmasıProteinaz K UygulamasıHibritleme Yıkama ProsedürüBCIP NBT Boyama
Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.