Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit edilebilir In situ Melezleme. Bizim geliştirilmiş protokol düşük spesifik olmayan arka plan sinyal düşük bol transkript tespiti için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Bu makale Zebra balığı embriyolarının in situ hibridizasyon (DİLERİZ) in tüm montaj odaklanır. WISH teknoloji doku dağılım ve gelişim aşamasında açısından hem de gen ifadesinin değerlendirilmesi kolaylaştırır. Protokoller digoksijenin ile etiketlenmiş antisens RNA probları kullanılarak zebrabalıkları embriyoların WISH kullanımı tarif edilmektedir. Problar klonlanmış ve lineerize edilmiş gen şablonlar in vitro transkripsiyon yoluyla digoksigenin-bağlı nükleotit ilave edilerek oluşturulur. Belirlenen gelişim aşamalarında hasat embriyoların chorions spesifik problar ile inkübasyondan önce kaldırılır. Aşırı prob kaldırmak için bir yıkama işlemi sonrasında, embriyolar alkalin fosfataz ile konjuge edilmiş anti-digoksigenin antikor ile inkübe edilir. Alkalin fosfataz için bir kromojenik substrat kullanılarak, belirli bir gen ekspresyonu tespit edilebilir. Gen ifade seviyesine bağlı olarak tüm işlem 2-3 gün içinde tamamlanabilir.
Giriş
Zebra balığı (Br.rerio) omurgalı geliştirme, hastalık, davranış çalışma için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya, ve-ilaç tarama 1-3 oldu. Balığı embriyolar, tek bir geçiş yerinden çok sayıda temin edilebilir. Gübreleme ve geliştirme eski rahim ve optik açık embriyoların hızla geliştirmek oluşur. Kritik gelişimsel olaylar ilk 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) meydana gelir. Bu organın taslakları ortaya ve hücre farklılaşması ve başlanması. Proteinlerin demonte veya aşırı ifadesi, morfolino antisens (MO) oligonükleotidlerle embriyoların mikroenjeksiyon yoluyla elde ya da bir ya da iki hücreli aşamada (0,75 HPF) sırasıyla mRNA olabilir.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Zebra balığı Embriyolar Yerinde Hibridizasyon Tüm montaj
Embriyolar 1.1 hazırlanması
- Gerekli gelişim aşamalarında embriyolar toplayın. Embriyonik aşamada açıklaması için Kimmel ve ark. 5 bakınız.
- Elle forseps (Dumont Saatçiler yok. 5 Forceps) kullanarak chorions çıkarın.
- PBS içinde yapılan paraformaldehid% 4 çözelti (PFA) embriyolar saptamak 4 ° C de bir gece (fosfat tamponlu tuzlu eriyik)
- En az 3 kat, oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca PBS ile embriyolar yıkayın.
- In situ hibridizasyon bütün montaj dahil olmak üzere ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sepet başına 50 embriyo (gen / başına deneysel koşul için) söz konusu genin ifade deseni bir deneyde elde edilebilir olan protokolü kullanarak. Hemen hemen tüm embriyolar belirli bir gen için benzer ekspresyonu göstermektedir. In situ hibridizasyon boyama için temsili örnekler Şekil 3-6 'de gösterilmektedir.
Anlamında ve anti-anlamda hem riboprobes PC5.1 karşılık gelen cDNAs, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, flk / kdrl .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz yüksek çözünürlüklü RNA görselleştirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirdik. In situ hibridizasyon prosedürlerinde gözenekli alt (Şekil 1) ile basit bir ölçüye sepet ile gerçekleştirilmektedir. Embriyolar, steril koşullar altında, oda sıcaklığında 6 oyuklu plakalarda RNase içermeyen çözeltiler kullanılarak işlenir.
Ayırmak için embriyolar sepetleri farklı renkli Eppendorf tüpleri yapılır. Ya da bir ağız olmadan Sepetler kolay yönlendirme için kulla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Taq Polimeraz | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Klonlama Kiti - Çift Promotör pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plazmid Saflaştırma Kiti | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agaroz | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 ve HindIII Restriksiyon Enzimleri | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Tampon Doymuş Fenol, ultra saf | Invitrojen | 15513039 | 4 ° C'de saklayın. Gözler, cilt ve solunum yolları tahriş edici ve şüpheli kanserojendir. Kullanım sırasında dikkatli olunmalıdır. |
| Kloroform | Fisher | C607-1 | Toksik ve şüpheli kanserojen. Çeker ocak altında çalışın. |
| RNaz içermeyen DNAse I | Roche | 4716728001 | Küçük alikotlar hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. |
| Sp6, T7 ve T3 RNA Polimeraz ile DIG-RNA Etiketleme Karışımı | Roche | 11277073910 | |
| RNaz İnhibitörü | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodyum Asetat (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| %100 Etanol | Ticari alkoller | ||
| Dietil Pirokarbonat (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC göz, cilt ve solunum yolu tahriş edicidir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Koruyucu gözlük, eldiven ve maske kullanın. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Anında Okyanus Tuzu | Akvaryum Sistemleri | N/A | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehit (PFA) | Sigma | P6148-1KG | -20 ° C'de hazırlayın ve saklayın; Daha sonra kullanmak üzere 40 ml alikot olarak C. PFA toksiktir. Koruyucu gözlük, eldiven ve toz maskesi kullanın. |
| Feniltiyokarbomid (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC oldukça toksiktir. Koruyucu gözlük, eldiven ve toz maskesi kullanın. |
| Metanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Saatçi ' s) Forseps deseni no. 5 | İnce Bilim Araçları | ||
| Altı Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi | Sarstedt | 83.1839 | |
| Sepetler naylon ağ ve Eppendorf tüplerinden yapılmıştır | Şirket içi hazırlık | Sepetleri yapmak için, konik ucu çıkarmak için kenarlı veya kenarsız Eppendorf tüplerini (1,5 ml) kesin. Naylon ağı, boyutuna karşılık gelen küçük parçalar halinde kesin Eppendorf tüplerinin kesik uçları. Kesilen ucu kaplayan naylon ağ ile tüpleri bir elektrik santralinin üzerine yerleştirin hem tüp hem de naylon ağ birbirine yapışana kadar sıcak plaka (çeker ocakta gerçekleştirin). Sepetlerdeki fazla ağı kesin ve kullanılana kadar %100 metanol içinde saklayın. | |
| Polioksietilenorbitan Monolaurat (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinaz K | Fermentas | EO0491 | |
| Asetik Anhidrit | Sigma | 242845 | |
| Trietanolamin | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamid, yüksek saflık derecesi | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Reçine | Bio Rad | 142-6424 | |
| Sitrik Asit monohidrat | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodyum Tuzu | Sigma | H3393-25KU | |
| Salin-sodyum Sitrat Tamponu (SSC) | Sigma | S6639 | |
| fırıncı mayası tip X'ten tRNA | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamizol Hidroklorür | Sigma | 31742 | |
| N, N-Dimetilformamid < br / > susuz (DMF) | Sigma | 227056 | Tahriş edici, toksik, yanıcı ve şüpheli teratojen. Eldiven ve gözlük de dahil olmak üzere uygun güvenlik kıyafetleri ile tutun. |
| 5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) | Sigma | N6639 | Bu çözeltiyi ışıktan koruyun. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Bu çözeltiyi ışıktan koruyun. |
| Sığır Serumundan Albümin, saflaştırılmış fraksiyon V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Koyun Anti-digoxigenin-AP Fab Parçaları | Roche | 1093274910 | |
| Gliserol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96 oyuklu hücre kültürü plakaları | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Anında Okyanus | Akvaryum Sistemleri | N/A |
Kaynaklar
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
