Nicel In vitro Testi

Vasküler endotel dolaşan kan ile doğrudan temas halinde olduğu için, bu benzersiz enfeksiyon veya yaralanma sırasında hızlı bir inflamatuvar yanıt başlatmak için yer almaktadır. Endotel hücreleri (EC) korunmuş bakteriyel bileşenleri ve tehlike moleküllerin çeşitli tanımak ifade örüntü tanıma reseptörleri ve bu TNF gibi ev sahibi yangı için reseptörleri. Bu reseptörlerin aktivasyonu EC sitokinler (örn., IL-6, IL-8, CXCL1 ve CCL2) salgılamaya ve hücrenin yüzeyinde ¹ yapışma molekülleri (örneğin, E / P-selektin, VCAM-1 ve ICAM-1) upregüle indükler ^{, 2.} Bu moleküller tüm bulaşıcı ajanların ev sahibi açık ve doku onarımı ^3,4 başlatmak için enfeksiyon ve yaralanma sitelere lökositlerin lokalizasyonu kolaylaştırmak. Enfeksiyona nötrofil yanıtı vasküler endotel ve yanıt arasında iyi koordine etkileşim içerir nötrofil. EM aktivasyonu üzerine, IL-8 salgılanan ve enfeksiyon veya yaralanma ^5,6 siteye ev için nötrofil sağlar endotel üzerindeki bir damar içi degrade oluşturur. E / P-selektinler aracılık nötrofil yakalama ve nötrofil hücre yüzeyinde glycomolecules ile nispeten zayıf dernekleri aracılığıyla haddeleme. Bu etkileşimler, bununla aynı soydan gelen reseptörlere IL-8, bağlayıcı ile birlikte, sağlam, integrin-aracılı bağlanma ve endotel hücre yüzeyi ^7-10 nötrofil nihai durması kolaylaştırır. Tutuklanmasından sonra, nötrofil doğrudan, patojenlerin ortadan kaldırmak patojenlerin yayılmasını önlemek için nötrofil hücre dışı tuzaklar oluşturmak, yaraların iyileşmesini sağlar ve bu monositler, makrofajlar ve dendritik gibi diğer lökosit işe ek faktörler serbest bırakmak için enfeksiyon belirli sitelere damar dışına geçirebilirsiniz hücreleri ^11-17.

Microv için nötrofil bağlılık ölçmek için bir in vitro bir yöntemdir Bu raporda açıklananascular TNF ev sahibi inflamatuar arabulucu tarafından aktif hale ECS. Bu deney, EC aktivasyonu, ve nötrofil değerlendirmek için tasarlanmıştır. Birincil insan nötrofil ilk yoğunluk gradiyenti ayırma kullanılarak izole, ve sonra Calcein asetoksimetil (AM) ile etiketlenir. Canlı hücreler hidrolize Calcein içinde esteraz 492-495 nm ve 513-516 nm ¹⁸ emisyon bir uyarma ile yüksek floresan Calcein molekülüne var. Floresan etiketli nötrofil sonra EM mono tabakaları ile inkübe edilir ve yapışkan olmayan nötrofil sonradan kaldırılır. Geriye kalan, bağlı nötrofil floresan sonra bir floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür ve oyuk başına toplam nötrofil floresan girişi bir yüzdesi olarak hesaplanır. Bu yöntem spektrofotometre kullanılan bağlı Calcein-etiketli nötrofil doğrudan AB ac okumak daha nitel vermek için floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi olabilir ek bir avantaja sahiptirtivasyon. Bu testte statik şartlar altında gerçekleştirilir, çünkü nötrofil yapışma kaskad ortaya yalnızca çok ilk olayların değerlendirilecektir. Bu TNF ile tedavi edilen insan akciğer mikrovasküler EC (HMVEC-Akciğer) bu nötrofil bağlılık E-selektin ile etkileşim bozulur zaman mono tabakaları büyük ölçüde azalır göstermek için E-selektin engelleme antikorlar kullanarak bu raporda teyit edilir.

TNF ek olarak, başarıyla Toll-benzeri reseptör 1/2 agonistleri peptidoglikan ile ilişkili lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) ve Pam3Cys ve insan umbilikal ven EC (HUVEC) aktivasyon boyutunu belirlemek için bu testte kullanmış Pam3Cys ^19,20 ile HMVEC-Akciğer aktivasyonu. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde bu metodoloji bir çeşitliliği ile uyumlu olduğunu düşündürmektedir, kinaz inhibitörleri ile ve HMVEC-Akciğer yüzeyi ve sitoplazmik proteinlerin RNAi aracılı demonte sonra bu testte kullanılabilir ve biyokimyasal screening deneyleri ^20. Özetle, bu testte in vitro yangı tarafından EC aktivasyon ölçüde erişmek için, tekrarlanabilir, daha işlevsel şekilde kullanmak için kolay sağlar.

1. Kaplama ve Mikrovasküler Endotel Hücreleri Bakımı

1. Çözülme ve üreticilerine göre mikrovasküler endotel hücreleri büyümek talimatları verilir. Bu protokol, hücreler EGM-2 PD ortamı (Lonza) açığa çıkaran yetiştirildi ve tüm deneyler pasaj sayısı nedeniyle herhangi bir varyasyonu en aza indirmek için çözülme iki hafta içinde yapılması tavsiye edilir. HMVEC-Akciğer ile deneyler 4 ile 9 pasajlar arasında yapılmaktadır.
2. 1. Gün: hücreleri% 80-90 confluency ulaştığınızda, trypsinize ve ml başına 120.000 hücre tekrar süspansiyon. 48-çukurlu, polistiren doku kültürü plakası (ler) içine Plaka oyuk başına 36,000 hücre (0.3 ml) eklenmiştir. Bir eşiğe okuma elde etmek amacıyla, nötrofiller ile inkübe olmayacak HMVEC kuyu içerir. Özellikle floresan testleri, alternatif satır veya sütun için tasarlanmış 48-iyi plakaları kullanarak sürece komşu kuyulardan herhangi bir ışık kirliliği en aza indirecektir. NOT: Wells poli-LYSI önceden kaplanmış olabilirKD, kolajen ya da fibronektin.
3. 2. Gün: taze medya ekleyin.
4. 3. Gün: faz kontrast mikroskobu olarak, hücreler (yani "arnavut" görünüm ve küçük hücre artıkları) sağlıklı onaylayın, ve% 100 konfluent (Şekil 1). Hücrelerin% 100 konfluent değilseniz onlar hazır olana kadar, her gün medya değiştirin.
5. HMVEC mono tabakaları tedavisi için hazır olduğunda, Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile bir kere hücreleri yıkama ve uygun kuyulara inflamatuar agonist içeren taze bir EGM-2 PD ortam ya da ortamın 0.3 ml ilave edilir. Bu protokolde HMVEC-Akciğer TNFa ile muamele edildi, 3 saat boyunca [100 ng / ml] (Peprotech, New Jersey), bu EC ²¹ arasında iyi tanımlanmış bir aktivatör olduğu. NOT: Bu aktive HMVEC hücreleri (Adım 4.1) ve Calcein etiketli nötrofil (Adım 3.5) AM böylece zaman denemenizi aynı anda kullanıma hazır önerilir. Bu neutroph izole ve etiketlemek için bize yaklaşık 2.5 saat sürerils.

2. Polymorphprep kullanarak Nötrofil İzolasyon

1. Daha önce ²² açıklandığı gibi nötrofil izole, ya da tam kandan polimorfonükleer granülositler izole etmek için hazır bir yoğunluk gradiyenti çözüm. Nuzzi ve arkadaşları tarafından protokolü takip Polymorphprep kullanılması. Tüm kan ²³ ml'si başına yaklaşık 2-3 x 10 ⁶ nötrofil verimi 2007 sonuçlanır. Not: kırmızı kan hücreleri çıkarmak için aşırı eritrosit lizis, bir dekstran sedimantasyonu önlemek için, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye ²⁴ önce gerçekleştirilebilir.
2. Oda sıcaklığına kadar Polymorphprep yoğunluk gradyanı çözüm getirmiştir.
3. Varlığında sağlıklı gönüllü insan tüm kan 30 ml arasında bir heparin, sitrat veya EDTA gibi anti-koagülan. Kan, 2 saat içinde kullanıldı, ve 18-22 ° C arasında tutulmalıdır
4. 15 ml konik bir tüp içinde yoğunluk gradyanı çözeltisi (5 ml 'den fazla bir tam kan Katman 5 mi
5. 18-22, 30 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin ° C Yavaş yavaş hızlandırmak ve aşağı santrifüj (yani santrifüj fren kapatın) ve nötrofil aktivasyonu azaltmak ve katmanları karıştırma önlemek için titreşimleri önlemek için de tüpler dengelemek için emin olun. Daha uzun santrifüj kez veya daha fazla santrifüj kuvveti pelet kırmızı kan hücrelerine karşı daha aşağı geçirmek için, nötrofil lökosit içeren alt tabaka ile sonuçlanacaktır.
6. Nötrofiller (Şekil 2B) içeren katman kirlenmesini önlemek için PBMC içeren plazma ve üst bant lökosit aspire.
7. Nötrofil içeren alt lökosit katmanı kaldırmak için bir 1-2 ml serolojik pipet kullanın. PBS, 30 ml içine nötrofil tabakalar birleştirildi, 50 ml (Ca kalmadan ^{2 +} ve ^{Mg2 +)}konik tüp.
8. PBS ile 50 ml (Ca ² olmadan ⁺ ve Mg ^{2 +)} 18-22 10 dakika 450 xg ve santrifüj ° C için ses getirmek

Not: Adım 2.9 ve 2.10 isteğe bağlıdır ama tavsiye.

9. Süpernatant aspire. Kırmızı kan hücreleri lyse 30 saniye boyunca steril su 8 ml nötrofil süspanse edin, hemen 5x 2 ml PBS (Ca ² olmadan ⁺ ve Mg ^{2 +)} ve hafifçe elle karıştırın. Hücreleri inkübe ETMEYİN için hücre süspansiyonu ekleyin daha uzun 30 saniye için su önemli nötrofil ölüm meydana gelebilir çünkü.
10. 18-22 5 dakika boyunca 250 x g santrifüj ° C
11. 10 ml PBS ^{(Ca2 +} olmadan ve ^{Mg2 +)} ve 18-22 az 5 dakika boyunca 250 x g'de tekrar santrifüj ° C ile bir kez yıkama hücreleri
12. RPMI-1640, 10 ml nötrofil süspanse (fenol kırmızısı olmadan) ve tripan blu kullanılarak canlı hücre sayımıE boyasıyla çıkarma metoduna. Bu da nötrofillerin aktivasyonunun neden olabileceği için, ml başına 5 x 10 ⁶ daha büyük hücre yoğunlukları, uzun süreler kaçının.

3. Calcein AM ile nötrofil Etiketleme

1. 6 x 10 ⁵ nötrofiller, 48-kuyulu plakanın oyuk başına kullanılır.
2. Hesapladıktan sonra, 50 ml konik bir tüp süspanse hücreleri aktarmak ve 2-4 fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640 ile, ml başına ⁶ x 10 hücreler, nötrofiller seyreltin.
3. Calcein 3 mcM (Calcein AM stok yani 2.98 ul (1 mg / ml) ml başına medya) için stok solüsyonu AM ekleyin ve yavaşça tüp hafifçe vurarak iyice karıştırın. 5'inden fazlasını mcM Calcein nötrofil sızıntı neden olacaktır AM Not:. Olmayan floresan Calcein AM son derece floresan molekül Calcein (yani ölü hücreleri floresan olmaz) üretmek için endojen esterazlarla hücre içinde parçalanır.
4. Alüminyum folyo ile tüp kapağı ve f inkübeveya 37 ° C'de 30 dakika karanlıkta Not C:. uzun inkübasyon süreleri yapışma deneyi boyunca nötrofillerden serbest bırakılır daha kalsein ile sonuçlanabilir.
5. 18-22 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve RPMI-1640 içinde 10 ml (fenol kırmızısı olmaksızın, 37 önceden ısıtılmış ° C) 2x nötrofil yıkayın. 40 uM steril filtre 18-22 de kümeleri kaldırmak ve daha sonra 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ile bir kez daha da ikinci yıkama için yeniden süspansiyona sonra ilk olarak nötrofiller geçmek ° C
6. , Ml başına 2 x 10 ⁶ nötrofil de.; (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış fenol kırmızısı olmadan) RPMI 1640 içerisinde yeniden süspanse nötrofil

4. Nötrofil Bağlama Deneyi

1. Filtre ile sterilize edilmiş (0.22 um) RPMI 1640 içinde 0.5 ml (fenol kırmızısı olmadan) oyuk başına% 3 BSA içeren 3x HMVEC mono tabakalar yıkayın.
2. Medya aspire ve 6 x 10 ⁵ Calcein-etiketli nötrofil (hücre suspensio 0.3 ml. 48-kaynak plaka Not uygun kuyulara nötrofil olmaksızın RPMI 1640 K) ya da 0.3 ml (fenol kırmızısı olmadan): Bu ^cm2 başına 8 x 10 ⁵ nötrofillerin eşdeğerdir.
3. 37 ° C 20 dakika,% 5 CO ₂ inkübatör inkübe edin.
4. Toplam Nötrofil Floresan (PRE yıkama): 485 nm dalgaboyu ve FLUOstar veya eşdeğer, spektrofotometrede 520 nm (floresein filtre seti) bir emisyon dalga boyu her kuyunun floresan ölçün. . Hemen önce inkübasyon son noktaya Bu adım yapın: Bu protokol, kalsein uyarılma ve yayılan ışık algılama ortaya kuyu üst yapıldı, ancak her ikisi de iki kuyu altından gerçekleştirilebilir.
5. PBS içinde çukur başına 0.5 ml 'si ile 5x HMVEC mono tabakaları ve nötrofiller içeren kuyu yıkayın (w / ^{Ca2 +} ve ^{Mg2 +).} Medya ve yıkar çıkarınters plaka ile ve kağıt havlu üzerine hafifçe okşamaya kalan sıvı kaldırmak için.
6. Geri de başına RPMI 1640 0.3 ml (fenol kırmızısı olmadan) ekleyin.
7. Yapışık Nötrofil Floresans (POST yıkama): Aşama 4.4 'de hem de her bir floresan yoğunluğu ölçün.
8. Yüzde bağlılık ve iyi başına göreceli bağlılık belirleyin:

Not: Bu aşamada, kalsein etiketli nötrofil görüntüler standart fluorescein filtre ile donatılmış bir floresan sahip mikroskobu kullanılarak elde edilebilir. Şekil 4'teki görüntü Pro7 yazılımı (Imaging S) Q-Yakalama kullanarak Retiga 2000R kamera (S Görüntüleme) ile donatılmış bir Olympus IX51 ters mikroskop ile elde edildi.

, Nötrofil bağlanma tahlili kullanılarak güvenilir, tekrar üretilebilir sonuçlar elde etmek amacıyla, Şekil 1 'de HMVEC-Akciğer ile gösterildiği gibi sağlık ve mikrovasküler endotel hücreleri konfluent, deney gününde uygun olması esastır. Buna ek olarak, düşük geçit sayısı mikrovasküler EC (az 9 geçitler gibi) kullanılmaktadır zorunludur, ve buna göre, biz çözülme iki hafta içinde tüm deneyler tavsiye ederiz. Nötrofil sağlık hücreleri bir biçimde oluşmaktadır halinde Calcein AM floresan kalsein moleküle metabolize edilmez, özellikle de büyük önem taşımaktadır. Biz tripan mavi dışlama yöntemini kullanın ve hücrelerin önemli bir bölümü (yani lekeli) ölü olup olmadığını tahlil ile devam etmeyin.

Orada yoğunluk gradyan ve antijen tabanlı sütun ayırma yöntemleri de dahil olmak üzere nötrofil izole etmek için çeşitli yollar vardır ve herhangi birBunlar, bu işlem için yeterlidir. Biz Eksen-Shield kupasında Polymorphprep hazır yoğunluk gradiyenti çözüm kullanmayı seçti. Şekil 2'de de görülebileceği gibi, nötrofil santrifüj sonra alt tabaka içinde iken, PBMC, üst tabaka içinde mevcut bulunmaktadır. Hücre katmanı onların kaldırılması üzerine granülosit kirlenmesini önlemek için aspire edilir. Su kalan kırmızı kan hücreleri eritmek için ilave edildiği adım 2.9, isteğe bağlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Tüm kirlenmesine neden eritrositler kaldırmak için idealdir Ancak, bu nötrofiller önemli ölüm meydana gelebilir sonra 30 saniye fazla saf suda oturmak değil önemlidir.

Son olarak, nötrofiller kalsein önceden ısıtılmış (37 ° C) içeren RPMI-1640 ortamı (fenol kırmızısı olmadan) ile yıkandı ve yeniden süspansiyon haline getirildi, 30 dakika boyunca AM ile inkübe edilir. Bu floresan okuma engelleyebilir fenol kırmızısı olmadan medya kullanmak önemlidir. Nötr sayısıophils oyuklara ilave floresans okumaları pre-ve post-yıkama spektrofotometre lineer aralığında olduğu sürece, yerine keyfidir ve ya nötrofil yapışma teşvik etmek ya da önlemek tedaviler arasındaki farklar (bkz. aşağıda) tekrarlanabilir şekilde tespit edilebilir. Biz 10.000 1.000.000 etiketli nötrofil (Şekil 3A) incelendiğinde floresan OD 520 nm doğrusal aralığında olduğunu bulmak. İlginç bir şekilde, aynı zamanda, daha nötrofiller, TNFa ile muamele HMVEC-Akciğer mono tabakaları eklenir olarak yüzde yapışma artar bulmak [100 ng / ml], 3 saat (Şekil 3B) için. Biz yapışma yüzdesi önemli ölçüde bu zaman noktasında (veriler gösterilmemiştir) sonra artmaz bulmak beri, 20 dakika birlikte HMVEC-Akciğer ve Calcein-etiketli nötrofil inkübe seçti. Not, bu deneyde biz standart, açık polistiren 48 oyuklu plakalar kullanılır ve bulunan bu t floresans çapraz okuma seviyesinio kuyu toplam floresan giriş (veriler gösterilmemiştir) fazla% 0.5 tutarında vermedi. Bununla birlikte varsa, biz, daha hassas deneyler için floresan spektrofotometre okumaları için bilerek yapılan 48-iyi plakaları kullanmanızı öneririz, ya da en azından, deneme tasarımı (Adım 1.2) çapraz okuma en aza indirmek için.

Oyuklara ilave nötrofil sayısının çok uzun ilave numara spektrofotometre doğrusal aralığı içinde olduğu gibi oldukça keyfi olduğunu göstermek için, P38'in mevcudiyetinde ya da yokluğunda TNFa ile tedavi edilen HMVEC-akciğer, nötrofil yapışma deneyi gerçekleştirilir nötrofil değişen giriş miktarda (yani 40.000 / iyi, 200.000 / iyi ya da 1.000.000 / da) 25 kullanılarak-MAPK inhibitörü BIRB7906,. , p38-MAPK önceden TNFa ile tedavi edilen insan EC E-selektin ekspresyon için gerekli olduğu gösterilmiştir, ve bu nedenle TNFa inhibisyonu ile aktive HMVEC-Akciğer nötrofil bağlayıcı azaltmalı26. Aslında, bu biz (Şekil 3C) gözlemlemek budur. Daha nötrofil eklendikçe, yüzde yapışma artar ve yüzde yapışma bu tür bir iç-verici çeşitleri, izdiham nötrofillerin kalitesi ve HMVEC yoğunluğu, bağıl yapışma özelliği gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak, deneyler arasında farklılıklar olabilir bulmak da koşullar arasında bağımsız olarak (Şekil 3C ve veri gösterilmemiştir) ilave nötrofil sayısının her biri bağımsız bir deneyde ise nispeten sabit kalmaktadır. Bu arası deneysel tutarlılık için bir pozitif kontrol göre olarak yapışma verileri görüntülemek için daha iyidir neden bu veriler de örnek.

Tam olarak bu tahlil nasıl çalıştığını göstermek için, biz, nötrofil yapışma tahlili gerçekleştirilebilir TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer ön kuluçkaya kontrol antikoru ya da bir e-selektin antikoru ile ya da bloke. E-selektin, TNFa ve yakalar nötr ile tedavi sonrası AT yüzeyinde ifade edilirglycomolecules ile elektrostatik etkileşim ile yataktan ophils nötrofil yüzeyinde 1,27 üzerinde mevcut. Şekil 4B ve görsel olarak Şekil 4C 'de grafik, Şekil 4A'da gösterilen sayısal olarak, TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer önceden inkübe göre ~% 75 daha az nötrofil bağlı E-selektin antikoru ile önceden inkübe kontrolü IgG ile. Bu E-selektin eden statik yapışma deneyinde HMVEC-Akciğer nötrofil bağlama önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Şekil 1. Sağlıklı, birleşik HMVEC-Akciğer mono tabakaları örneği. "Arnavut" görünüm ve mono tabakaları confluency toplam unutmayın. Görüntüler bir Fisher Scientific Micromaster ters dijital mikroskop 4X ve 10X büyütmede alınmıştır.

Şekil 3,. Nötrofil sayısı ve floresan OD 520 nm arasındaki ilişki doğrusaldır; daha nötrofil olarak TNF-tedavi HMVEC-Akciğer artar nötrofil yüzde yapışma eklenir; p38-MAPK TNF-aktif HMVEC-Akciğer mono tabakaları için nötrofil bağlılık teşvik (A) Grafik. linea tasviriki mertebe üzerinde floresan OD 520 nm ve nötrofil sayısı arasında r ilişkisi. 0,996 arasında bir R2 değeri 10,000 ile 1,000,000 nötrofil analiz edilir nötrofil sayısı ve floresan OD 520 nm arasında doğrusal bir ilişki olduğunu gösterir. Kalsein etiketli nötrofil değişen sayıda ilave edildi bağlılık oranında (B) grafiksel gösterimi edilmediği ya da TNFa ile tedavi edilen ( 100 ng / ml;. 48 gözlü levhalar içinde, 3 saat) HMVEC-Akciğer tek tabaka (C) HMVEC-Akciğer mono tabakaları için, p38-MAPK inhibitörü BIRB796 (10 mM) ile (Axon Medchem) ya da DMSO (kontrol) ile önceden inkübe edildi TNFa, önce 1 saat (100 ng / ml), 3 saat boyunca muamele BIRB796 (10 mm) arasında sürekli varlığında ise. Göreli yapışma adım 4.8 olarak hesaplandı. Veri ortalama ± SD olarak ifade edilir. GraphPad Prism eşleştirilmemiş t-testi istatistiksel analizi (n = 3) (TNFa ile tedavi edilen genel artı BIRB796 TNFa ile muamele edilmiş) dönüştürülmesi için kullanılmıştır. p-değeri ** <0.01; *** &# 60;. 0.001 büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,. E-selektin, nötrofil yapışma teşvik TNFa tedavi HMVEC-Akciğer. HMVEC-Akciğer TNFa ile muamele edilmiştir [100 ng / ml], 3 saat boyunca. % 3 BSA (adım 4.1), ya da koyun IgG, [50 ug / ml] ihtiva eden RPMI 1640 HMVEC-Akciğer yıkama işleminden sonra (5-001-A, R & D Systems) veya E-selektin poliklonal antikoru (PAB) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) 20 dakika boyunca, uygun oyuklara ilave edildi. 6 x 10 5 nötrofil ek bir 20 dakika boyunca oyuk başına ilave edilmesinden önce HMVEC-Akciğer mono tabakalar daha sonra bir kez daha RPMI-1640 ile yıkandı. (A) ve yüzde göreli yapışma belirlemek için hesaplamaları gösterilmektedir. Calceinışık emisyonu OD 520 nm de ölçülür. Arka Plan OD 520 nm ortalama TNFa işleme ve nötrofillerin yokluğunda HMVEC-Akciğer türetilmiştir. (B) işlenmemiş ya da TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer mono tabakalara kalsein etiketli nötrofil görece yüzde yapışma grafiksel gösterimi ön inkübasyondan sonra ya kontrol ile IgG veya E-selektin pAb engelleme. Veri ortalama ± SD olarak ifade edilir. GraphPad Prism eşleştirilmemiş t-testi istatistiksel analizi (n = 3) dönüştürülmesi için kullanılmıştır. Hesaplanan p-değeri <0.001 idi. (C), tedavi edilmemiş ve TNFa ile tedavi edilen HMVEC-Akciğer mono tabakaları kontrol IgG ya da, E-selektin pAb ile ya da ön-kuluçkaya bağlı kalsein etiketli nötrofillerin görüntüler. PBS ile yıkanmasından önce 6 x 10 5 nötrofil içeren bir örnek (PRE yıkama) gösterilmiştir. Referans aynı alanda floresan görüntüleri, bir floresein filtre kullanırken saydam ışık mikroskobu görüntüleri, sağ sütunda gösterilmiştirset, sol sütununda gösterilmiştir. Görüntüler bir Retiga 2000R kamera (Q Görüntüleme) ile donatılmış bir Olympus IX51 ters mikroskop 10X büyütmede alınmıştır. ÖN yıkama = toplam nötrofil floresan OD 520 nm (Adım 4.4); POST yıkama = yapışık nötrofil floresan OD 520 nm (Adım 4.7); PMN - polimorfonükleer granülositler, ort - ortalama, IgG - koyun IgG kontrolü; E-sel/α-E-selectin - E-selektin pAb engelleme. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.