Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Summary

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Abstract

Yerelleştirme tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi, onlarca nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip bir numune içindeki tek tek floresan etiketli tek moleküllerin dağılımının uzamsal bir haritasını (görüntüsünü) elde etmek için uygulanabilir. İlgilenilen proteinlere kaynaşmış fotoaktif (PAFP) veya foto değiştirilebilir (PSFP) floresan proteinleri veya antikorlara veya diğer ilgili moleküllere konjuge organik boyaları kullanarak, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (FPALM), tek hücreler içinde aynı anda birden fazla molekül türünü görüntüleyebilir. Aşağıdaki yaklaşımı kullanarak, çok sayıda (binlerce ila yüz binlerce) bireysel molekül popülasyonları tek hücrelerde görüntülenir ve ~ 10-30 nm hassasiyetle lokalize edilir. Elde edilen veriler, bir hücre içindeki çoklu protein türlerinin nano ölçekli uzamsal dağılımlarını anlamak için uygulanabilir. Bu tekniğin birincil avantajlarından biri, uzamsal çözünürlükteki dramatik artıştır: kırınım, geleneksel ışık mikroskobunda çözünürlüğü ~ 200-250 nm ile sınırlarken, FPALM, uzunluk ölçeklerini daha küçük bir büyüklük sırasından daha fazla görüntüleyebilir. Birçok biyolojik hipotez, farklı biyomoleküller arasındaki mekansal ilişkilerle ilgili olduğundan, FPALM'ın geliştirilmiş çözünürlüğü, daha önce geleneksel floresan mikroskobu tarafından erişilemeyen hücresel organizasyon sorularına ışık tutabilir. Numune hazırlama ve veri toplama yöntemlerini detaylandırmanın yanı sıra, burada FPALM için optik kurulumu açıklıyoruz. Süper çözünürlüklü mikroskopi yapmak isteyen araştırmacılar için ek bir husus da maliyettir: şirket içi kurulumlar, ticari olarak mevcut görüntüleme makinelerinin çoğundan önemli ölçüde daha ucuzdur. Bu tekniğin sınırlamaları arasında, hücre numuneleri içindeki ilgili moleküllerin etiketlenmesinin optimize edilmesi ihtiyacı ve sonuçları görselleştirmek için son işlem yazılımına duyulan ihtiyaç yer alır. Burada, sabit hücrelerde iki protein türünü görüntülemek için PAFP ve PSFP ekspresyonunun kullanımını açıklıyoruz. Tekniğin canlı hücrelere genişletilmesi de açıklanmaktadır.

Introduction

Hücresel yapılar çok çeşitli uzamsal ölçeklerde bulunurken, ~250 nm'den daha küçük uzunluk ölçeklerinde hücresel organizasyonun floresan görüntülemesi, kırınım sınırının fiziksel kısıtlaması nedeniyle geleneksel mikroskopide sınırlıdır. Bu sınır, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (FPALM¹) ve birkaç on nanometre çözünürlüğe sahip görüntüler oluşturmak için çok sayıda bireysel molekülü ~ 10 nm hassasiyetle lokalize edebilen benzer tekniklerin^2,3 ortaya çıkmasıyla aşıldı. FPALM, moleküllerin alt kümelerini aktive etmek ve etkisiz hale getirmek için optik kontrolün kullanılmasına dayanır (FPALM'nin tam bir açıklaması ve bu görüntüleme sisteminin nasıl uygulanacağına ilişkin talimatlar için, bakınız Gould et al.⁴). Bu teknik, tek moleküllerin tüm popülasyonlarının mekansal dağılımlarının haritalanmasına izin verir, böylece onlarca nanometreden onlarca mikrona kadar uzanan uzunluk ölçeklerinde biyolojik yapıları aydınlatır. Lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi (bundan böyle lokalizasyon mikroskobu olarak anılacaktır), örneğin polarizasyon FPALM veya P-FPALM⁵ ile bireysel moleküler yönelimlerin görüntülenmesine, Biplane FPALM⁶ veya diğer teknikler^7-9 ile üç boyutlu tek moleküllerin floresan görüntülemesine izin veren teknolojik gelişmelerle birlikte bir dizi biyolojik soruyu ele almak için uyarlanmıştırve canlı hücrelerde tek moleküllerin süper çözünürlüklü floresan görüntülemesi^10-12. Lokalizasyon mikroskobu, sabit hücrelerde birden fazla türün^{görüntülenmesine de uygulanmıştır 13-16}. Son zamanlarda, hem sabit hem de canlı hücrelerde FPALM ile aynı anda üç protein türü görüntülenmiştir¹⁷. Lokalizasyon mikroskobu, çeşitli şekillerde etiketlenmiş örnekleri görüntüleyebilir: örnekler arasında PAFP veya PSFP füzyon etiketleri ile eksprese edilen proteinler, kafesli organik boyalarla etiketlenmiş antikorlar veya moleküller veya geleneksel organik boyalar bulunur. Konvansiyonel floresan boyaların kullanımı, bir füzyon-protein etiketinin yokluğunda proteinlerin etiketlenmesine izin verirken, süper çözünürlüklü görüntülemede kafessiz organik boyaların kullanımı için genellikle gerekli olan koşullar, numunelerin indirgeyici tamponlara daldırılmasını gerektirir². Ek olarak, antikor-boya konjugatlarının hücre içi iletimi tipik olarak hücrelerin sabitlenmesini ve zarlarının geçirgen hale getirilmesini gerektirir, veya canlı hücrelerin elektroporasyon veya başka yollarla geçirgen hale getirilmesini gerektirir. Tampon koşullarının azaltılması ve membran geçirgenliği için gereklilikler, organik boyaların canlı hücre görüntüleme için uygunluğunu sınırlar, ancak son gelişmeler HaloTags ve FPALM'ın membran yapılarını görüntülemek için etkili bir şekilde kullanılmasına izin vermiştir¹⁸.

FPALM, canlı hücrelere uygulanan ilk lokalizasyon mikroskobu tekniğiydi¹⁰. Canlı hücrelerde, etiketli moleküllerin konumlarının zamana bağlı bir uzamsal haritasını sağlamanın yanı sıra, FPALM, tek molekülleri birden fazla çerçeve üzerinde ve milisaniye¹⁹ zaman ölçeklerinde belirlenen moleküler yörüngeleri izleyebilir. Böylece, FPALM oldukça kısa zaman ölçeklerine ve nano ölçekli çözünürlüğe erişim sağlar.

Çok renkli FPALM, fotoaktif proteinler ve organik kafesli veya kafessiz boyalar dahil olmak üzere çeşitli farklı problar için kullanılabilir. Burada, iki floresan protein türü olan Dendra2 ve PAmCherry'nin aynı anda görüntülenmesi için protokol ve kurulum hakkında ayrıntılı bilgi veriyoruz. NIH-3T3 fibroblastlarında beta aktin (PAmCherry-actin) ile konjuge PAmCherry ve influenza hemaglutinin (Dendra2-HA) ile konjuge Dendra2 görüntüleme sonuçlarını sunuyoruz. Kurulumda açıklanan bileşenler, diğer probların görüntülenmesi için daha uygun olan diğer donanımlarla değiştirilebilir. Bu durum söz konusu olduğunda, metinde açık olmaya çalıştık.

Çok renkli FPALM, canlı veya sabit hücrelerdeki çoklu protein türlerinin uzamsal dağılımlarını raporlamak için idealdir. Bu teknik, özellikle nanometre uzunluktaki uzamsal ölçeklerde uzamsal ve/veya dinamik ilişkileri araştırmak için uygundur, ancak görüntüler onlarca nanometreden onlarca mikrona kadar çeşitli uzunluk ölçeklerinde yerelleştirmeyi rapor edecektir. Çok renkli FPALM'ın en büyük avantajlarından biri, kurulumun nispeten ucuz olması ve çeşitli prob kombinasyonlarıyla kullanım için çok esnek olmasıdır. Sistemin bileşenlerden oluşturulması ve kalibre edilmesi süreci, verilerin kalitesini ve yorumlanabilirliğini ve dolayısıyla araştırma sonucunu tehlikeye atabilecek faktörlerin önemli ölçüde anlaşılmasını sağlar. Burada, FPALM kullanarak PSFP ve PAFP füzyon yapıları ile birden fazla protein türünün optik kurulumu, numune hazırlama ve veri toplama yöntemlerini detaylandırıyoruz. Bu protokol sabit hücrelerin analizini tanımlarken, bu prosedürler canlı hücrelerin görüntülenmesine kolayca uygulanabilir.

Burada açıklanan optik kurulum, PSFP Dendra2 ve PAFP PAmCherry'nin eş zamanlı görüntülenmesi için idealdir. Çok renkli görüntüleme için başka birçok prob kullanılabilir; Bununla birlikte, gerekli olan kesin bileşenler, seçilen probların uyarma ve emisyon spektrumlarına bağlı olarak değişebilir. Dikroik aynalar, filtreler ve lazer dalga boyları seçimleri bu hususlara göre yapılmalıdır.

Protocol

Lütfen dikkat: Bu protokolde atıfta bulunulan optik bileşenlerin diyagramatik bir gösterimi Şekil 1'de bulunabilir.

1. Hücre Örneği Hazırlama

1. 8 oyuklu bir odanın kuyucuklarında optimize edilmiş bir yoğunlukta plaka hücreleri (NIH-3T3 hücreleri için bu kabaca 2-5 x 10⁴ hücre /^cm2'dir). Hücreler, hücre tipine uygun tam ortamda kaplanmalıdır, ancak ortam antibiyotiksiz ve fenol kırmızısı olmadan yapılmalıdır, bu da arka plan floresansına katkıda bulunur. En uygun geçiş sayıları aralığı gibi hücre deneyi koşullarının, tek tek hücre hatları için farklılık gösterebileceğini unutmayın.
2. Hücrelerin lamele yapışmasını sağlamak için hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de (veya hücre tipine uygun koşullarda) 24 saat inkübe edin. İki protein türü yapısının her biri için endotoksin içermeyen DNA'ya sahip hücreleri transfekte edin (bu durumda, PAmCherry-aktin ve Dendra2-HA için DNA). Numuneyi alüminyum folyo gibi ışık geçirimsiz malzeme ile kaplayın. Transfeksiyon, her iki DNA yapısına sahip kuyuları ve bu yapıların her birinden yalnızca birine sahip kuyuları içermelidir.
3. Tam ortama geçmeden önce (antibiyotikli, fenol kırmızısı olmadan) 4-6 saat, 37 ° C ve% 5 CO₂ (veya hücre tipine uygun koşullarda) inkübe edin ve hücrelerin istenen proteinleri ifade etmesine izin vermek için 16-48 saat daha fazla inkübe edin.
   1. Hücreler, fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkanarak, daha sonra RT'de 15 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) (DİKKAT: Toksik) ile inkübe edilerek ve ardından PBS ile 3 kez daha yıkanarak sabitlenebilir. Bununla birlikte, ilgilenilen proteinlere bağlı olarak, bu fiksasyon, hala hareketli olan oldukça büyük bir etiketli molekül havuzuna neden olabilir. Hareketliliği daha da azaltmak için, alternatif fiksasyon yöntemleri arasında PBS'de 25 ° C'de >30 dakika boyunca soğutulmuş% 100 metanol ve% 0.2 gluteraldehit ve% 4 PFA kullanımı bulunur²⁰. Her iki yöntemde de hücreler yukarıdaki gibi PBS ile yıkanmalıdır. Gluteraldehit kullanımının bazı görüntüleme koşulları altında arka plan floresansını veya otofloresansını artırabileceğini ve sodyum borohidrür²¹ ile fiksasyon sonrası tedavi gerektirebileceğini unutmayın.
4. Numune 4 °C'de tutulabilir, PBS'ye daldırılabilir, kendinden sızdırmaz bir filmle kapatılabilir, görüntülemeden önce 7 güne kadar saklanabilir.

2. Mikroskop Hizalama

1. Mikroskop tablasına bir kalibrasyon ölçeği (retikül) yerleştirin. 10X'lik bir objektif ve iletilen ışık için lamba kullanarak, retikülü görüş alanının (FOV) merkezinde ortalayın.
2. Köhler Aydınlatma. Köhler aydınlatması için mikroskobu ayarlayın²². Başlamak için, alan açıklığını kapatın ve oküler kısımdan bakarak retiküle odaklanın. Alan açıklığının kenarları odak dışındaysa, hem alan açıklığı hem de nişangah odak haline gelene kadar kondansatörün yüksekliğini ayarlayın.
3. Alan açıklığının yanal konumunu, FOV'a göre ortalanana kadar ayarlayın. Alan açıklığını, yalnızca retikül üzerindeki orta ızgara yanana kadar kapatın.
4. Kamera konumunun kaba bir şekilde hizalanması için (yani kurulum ilk kez hizalandığında), kamera deklanşörü KAPALI durumdayken yüksek bir lamba yoğunluğu kullanın ve adım 1'e ulaşılana kadar B kutusuna (Şekil 2.5) optik yola herhangi bir bileşen yerleştirmeyin. Kamerayı ilk kez hizalarken L2 ve L3'ü algılama yoluna yerleştirmeyin. Kameranın dikey ve yatay konumunu ayarlayarak nişangah görüntüsünü kamera deklanşörü üzerinde kabaca ortalayın (Şekil 2B). EM kazancını devre dışı bırakın, oda ışıklarını kapatın ve kamera deklanşörünü açın.
5. Lamba yoğunluğunu kamera sensörüne zarar vermeyecek bir seviyeye düşürdükten sonra, nişangah görüntüsünden gelen ışığı doğrudan kamera sensörüne yansıtın (Şekil 2A). Görüntüyü çekim yazılımında canlı video modunda görüntülerken mikroskop odak düğmesini ayarlayarak nişangahı odaklayın. Kameranın dikey ve yatay konumunu ayarlayarak nişangah görüntüsünü kamera sensörüne ortalayın (Şekil 2B).
6. L2 ve L3'ü diyafram açıklığı ile kamera arasındaki algılama yoluna yerleştirin (Şekil 2C). L2 ve L3'ü, L2 mikroskop çıkış portunun odak noktasından bir odak uzaklığı ve L3 kamera sensöründen bir odak uzaklığı olacak şekilde hizalayın. L2 ve L3 arasındaki mesafe ideal olarak L2 ve L3'ün odak uzunluklarının toplamına eşit olmalıdır, ancak alan kısıtlamalarına uyum sağlamak için bir şekilde ayarlanabilir. Kamera ve lensler, çıkış portu ile aynı yükseklikte olmalıdır.
7. Mikroskoptan yayılan ışığın L2 ve L3'te ortalanması gerektiğini unutmayın. Nişangah görüntüsünün hem kamerada hem de oküler aracılığıyla net bir şekilde odaklandığından emin olmak için L2 ile mikroskop arasındaki mesafeyi ayarlayın.
8. Gerekirse, nişangah görüntüsünü kamera sensörüne ortalamak için L2 ve L3'ün küçük çevirileri (örn. <1 mm) kullanılabilir.
9. İki renkli modül. Kamera konumu optimize edildikten sonra, B kutusunda (Şekil 1) gösterilen bileşenleri algılama yoluna yapıştırın. Bu bileşenler çıkarılabilir bir yuvaya takılabilir, böylece tüm modül çok renkli FPALM için takılabilir veya gerektirmeyen diğer FPALM uygulamaları için çıkarılabilir.
10. Bu bileşenler ilk kez monte edildiğinde, her kanalın yol uzunluklarını eşit olacak şekilde ayarlayın. Nişangahı kamera çipine yansıtın, M7 ve M9'u ayarlayın ve/veya iki kanal arasındaki uzamsal örtüşmeyi önlemek için algılama açıklığını (AP) kapatın. Retikülün görüntüsünü yansıyan ışık kanalına odaklayın.
11. İletilen ışık kanalındaki görüntü odakta değilse, retikül görüntüsü her iki kanalda aynı anda odakta olana kadar M9'u çevirin (ve gerekirse döndürün). İki kanalın birbirinden yanal olarak yer değiştirmesi gerektiğini unutmayın (Şekil 2D). Bu yer değiştirme, ister yatay ister dikey olsun, edinme hızını etkileyebilir. Daha fazla bilgi için fotoğraf makinesinin kullanım kılavuzuna bakın.
12. Retikül ölçeğinin bir anlık görüntüsünü kaydedin (daha sonra genel büyütmeyi hesaplarken kullanmak için). Kamera yazılımını kullanarak istediğiniz ilgi alanını seçin. Daha küçük bir ilgi alanı için genellikle daha yüksek kare hızları mümkün olacaktır.

3. Lazer Hizalama

1. Okuma ve aktivasyon lazerlerini açın. (DİKKAT: Lazerler yalnızca operatörler lazer güvenliği eğitiminden geçtikten sonra kullanılmalıdır.) Laboratuvarın tüm kapıları kapalı kalmalı ve lazerler hizalanırken laboratuvarda yalnızca eğitimli temel personel bulunmalıdır. Kullanılmadığında okuma ve aktivasyon ışınlarını engellemek için SH1 ve SH2 panjurlarını ve lazer güçlerini güvenli seviyelere (<1 mW) düşürmek için ND filtrelerini kullanın. Güvenlik için gerekli olan aydınlatma dışında, hizalama sırasında tüm oda aydınlatmasını en aza indirmek faydalı olacaktır.
2. Aktivasyon ve okuma ışınlarını engelleyin. L1'i lazer yolundan çıkarın.
3. M4'e karşı aynı hizada beyaz bir kart yerleştirin. Çoğu ticari bileşik mikroskop, gelen aydınlatmayı engellemek için yerleşik bir deklanşöre sahiptir. Varsa, mikroskop kapağını açın ve nişangah görüntüsü M4'e yansıyana kadar odaklanın. Dahili bir mikroskop kapağı mevcut değilse, tüm lazer ışınlarının mikroskoba girmesini engelleyen uygun bir yerde harici bir kapak kullanın.
4. FOV'da merkezleme okuma lazeri. Okuma ışınının engelini kaldırın. M4'i ayarlayarak okuma ışınını M1'teki retikül görüntüsünün artı işaretine ortalayın.
5. Retikül görüntüsünü M5'e yansıtın ve ışın M4 üzerindeki görüntü artı işaretinde ortalanana kadar ayna M5'ü ayarlayın, böylece okuma ışını hem M4 hem de M5'te retikül artı işareti ile ortalanır. Okuma ışınını engelleyin.
6. FOV'da merkezleme aktivasyon lazeri. Nişangah görüntüsünü M3'e yansıtın ve ışın genişleticiyi (BE) lazer yolundan çıkarın. Aktivasyon ışınının engelini kaldırın.
7. Aktivasyon ışınını M2'teki retikül görüntüsünün artı işaretlerine ortalamak için M3'yi ayarlayın. Ortalandıktan sonra, BE'yi M2 ve M3 arasında değiştirin ve ışın M3'teki retikül görüntüsünün artı işaretlerine ortalanana kadar BE'nin konumunu ayarlayın.
8. 10X'lik bir objektif kullanarak, nişangah görüntüsünü M5'e yansıtın ve odak elde etmek için gerekirse mikroskop odak düğmesini ayarlayın. Aktivasyon ışını oradaki retikül görüntüsünün ortasına gelene kadar DM1'in açısını ayarlayın. Her iki ışını da engelleyin.
9. Yerinde bir objektif yokken ve mikroskop deklanşörü açıkken, okuma lazerini mikroskobun arka açıklığından yansıtın. (DİKKAT: Bu adım, paralel bir lazer ışınını engellenmemiş bir dikey yola yönlendirerek bir lazer güvenliği tehlikesi oluşturur.) Işın doğrudan mikroskoptan çıkana ve doğrudan yukarıdaki tavana inene veya taretteki objektif yuvasına yerleştirilmiş bir kartın ortasına gelene kadar M5'i ayarlayın.
10. İSTEĞE BAĞLI: Doğru hizalamanın belirlenmesi, çözelti içinde bir boya numunesinin kullanılmasıyla kolaylaştırılabilir (bu durumda, suda ~100 μM'de Rhodamine B veya görsel amaçlar için >0,5 cm) derinliğe sahip metanol), 60X objektif lensi yerindeyken numune aşamasına yerleştirilir. Işın doğru şekilde hizalanırsa, objektif, objektif ve mikroskobun ekseni ile hizalanmış bir floresan konisi yansıtacaktır. Objektif arka açıklığındaki lazer ışını yerleşimindeki küçük sapmalar, koninin tamamen dikey bir hizalamadan ayrılmasına neden olacaktır.
11. Her iki ışını da engelleyin. L1'i, objektif merceğin arka diyafram açıklığından uygun mesafede (yani bir odak uzaklığı) lazer yoluna monte edin. 60X objektif yerindeyken, okuma ışınının tavana yansıma yapmasına izin verin. Işın mikroskobun üzerinde ortalanana kadar L1'in yatay ve dikey konumunu (lazer yayılma yönüne dik) ayarlayın. Not: Bu adımda, ışın önceki adımdan daha büyük bir nokta oluşturacaktır.
12. L1'in eksenel konumu ve odak uzaklığı, numunedeki aydınlatılan alanın boyutunu etkileyecektir. Açıkça söylemek gerekirse, numunedeki aydınlatma profilinin hesaplanmasında kırınım²³ dikkate alınmalıdır. Bununla birlikte, kabaca söylemek gerekirse, L1'i objektif arka odak düzleminden bir odak uzaklığından farklı bir eksenel mesafeye yerleştirmek, çoğu durumda L1'in arka odak düzleminden tam olarak bir odak uzaklığında olduğundan daha küçük, daha yoğun bir lazer aydınlatma profiline neden olacaktır. Örneğin, yüksek hızlı görüntüleme gibi belirli uygulamalar için daha yüksek bir lazer yoğunluğu üretmek için daha küçük bir aydınlatılmış alan kullanılabilir.
13. Okuma ışın profilinin ölçümü. L1 yerindeyken, uygun konsantre boya çözeltisinden bir numune (bu durumda, suda ~ 100 μM'de Rhodamine B) sahneye yerleştirin.
14. Aktivasyon lazeri engellenmiş durumdayken, okuma lazerini (açıkta kalan tüm ışınlar için <<1 mW) bir güç elde etmek için ND1'i ayarlayın) 60X objektiften boyaya yansıtın ve (EM kazancı devre dışı bırakıldığında) bu görüntüyü kameraya gönderin.
15. Hedefi örneğe odaklayın. Bu adım için, tam huzme profilinin görüntülenmesine izin vermek için yeterince büyük bir diyafram açıklığı gereklidir.
16. AP'yi, ışın profilinin merkezi ve AP eş merkezli olacak şekilde yanal olarak çevirin. Kamera yazılımını kullanarak, her iki kanalı da kapsayan en küçük kamera okuma bölgesine izin vermek için ilgilenilen bölgeyi seçin. Bu koordinatları kaydedin. Tek bir anlık görüntü kaydedin (bu, okuma ışını profilidir).
17. Odak düzlemindeki lazer profilini daha doğru yansıtan görüntüler, boya çözeltisi numunesi mümkün olduğunca ince olduğunda elde edilecektir. Böyle ince bir numune, bir mikroskop lamı ile bir lamel arasına bir damla ~ 5 ul boya çözeltisi yerleştirilerek oluşturulabilir.
18. Aktivasyon ışını profilinin ölçümü. Okuma lazerini bloke edin. Aktivasyon lazerini numuneye yansıtın; ve bu görüntüyü kameraya yansıtın.
19. Gerekirse, EM kazancı <100'ü kullanın ve ışın her FOV'da ortalanana kadar DM1'i ayarlayın. Aktivasyon ışını profilinin anlık görüntüsünü kaydedin.
20. Her ışının gücünü ölçün. Boya solüsyonunu çıkarın ve 60X objektifin üzerine bir güç ölçer sensörü yerleştirin (daldırma ortamı olmadan). Her bir ışının gücünü (aktivasyon ve okuma) ayrı ayrı ölçün. Yayılan tüm lazer gücünün güç ölçer sensörüne çarpmasını sağlamak için güç ölçerin konumunun dikkatli bir şekilde ayarlanması gerektiğini unutmayın.
21. Her lazer için, deney için uygun numunede yoğunlukları elde etmek için gücü ayarlamak için nötr yoğunluk filtreleri (ND1 ve ND2) kullanın.
22. Görüntü elde etmek için okuma lazerinin yoğunluğu. Okuma lazer yoğunluğu, birkaç karelik zaman dilimi içinde tek molekülleri uyarmak ve foto-ağartmak için yeterince yüksek yapılmalıdır. Tipik değerler 10^{3-10 4} W/^cm2'dir (ayrıca bakınız Gould et al.⁴). Numunedeki yoğunluk, görüntü alanının boyutuna bağlıdır, bu nedenle istenen yoğunluğu elde etmek için gereken güç sistemden sisteme değişecektir.
23. Aktivasyon lazerinin yoğunluğu. Aktivasyon lazer yoğunluğu, herhangi bir edinim çerçevesinde aktif molekül sayısı küçük (örn. 1-100) olacak şekilde seçilmelidir. Kabaca söylemek gerekirse, istenen yoğunluğa, aktif moleküller arasındaki en yakın mesafe, kırınım sınırlı çözünürlüğünden biraz daha büyük olduğunda ulaşılır (Ayrıca bakınız Bölüm 6, Görüntüleme). Aktif olmayan tek moleküllerin popülasyonu azaldıkça, aktivasyon lazerinin daha yüksek yoğunlukları gereklidir. Tipik yoğunluklar ^{10-1-10 2} W/^cm2'dir.
24. Çeyrek dalga plakasını optimize edin. Çeyrek dalga plakası (QWP) isteğe bağlıdır, ancak bir QWP ile okuma ve aktivasyon lazerlerinin dairesel polarizasyon derecesinin arttırılması, nihai görüntülerde molekül yoğunluğunu artırabilir. QWP'yi optimize etmek için QWP ile M5 arasına bir polarizör yerleştirin. Aktivasyon lazerini engelleyin. Okuma lazerini kuru 60X objektif üzerinden bir güç ölçere yansıtın.
25. QWP'nin açısını kaydedin. Polarizörü maksimuma kadar ayarlayın ve ardından minimum güçler elde edilir. Bu değerlerin her birini kaydedin ve minimum/maksimum oranını hesaplayın. QWP'nin açısını ayarlayın ve bu ölçümleri tekrarlayın. 1.0'a yakın değerler elde edilmek istenirken, görüntüleme için >0.8'lik bir oran yeterlidir.

4. Kanal hizalaması için dayanıklı bir boncuk örneği oluşturma

1. Bir floresan boncuk örneğini (çapı 40-100 nm arasında) 1:70 oranında HPLC sınıfı suya seyreltin. Suda 200 μl boncuk süspansiyonunun nihai hacmi için bu stok çözeltisini HPLC suyunda 1:15 oranında daha da seyreltin.
2. Bir lamel sıvı poli-L-lizin ile kaplayın. RT'de 30 dakika inkübe edin. Solüsyonu çıkarmak için aspire edin ve lameli HPLC dereceli su ile üç kez yıkayın. Lameldeki tüm su izlerini aspire edin ve RT'de kurumaya bırakın.
3. Lamel üzerine 200 μl boncuk süspansiyonu pipetleyin. HPLC su ile üç kez yıkamadan önce bu lamel RT'de 20 dakika bekletin. Alternatif olarak, süspansiyonun kurumasını sağlamak için lamel O/N'yi RT'de bırakın.
4. ~20 μl HPLC su veya montaj ortamı kullanarak, lamel bir cam kızak üzerine monte edin. Lamelin çevresini şeffaf oje ile kapatın. Cila kuruduktan sonra, lamel (ve uygun objektif daldırma ortamı; su veya yağ) 60X objektifin üzerine yerleştirin.

5. Görüntü Elde Etme: Algılama Kanallarının Hizalanması için Görüntüleme Boncuğu Örneği

1. Boncuk numunesini, görüntüleme için kullanılacak olandan yaklaşık 10 kat daha düşük bir yoğunlukta okuma lazer ışını ile aydınlatın. EM kazancı 100 olarak ayarlandığında, görüntüyü kameraya yansıtın ve her iki kanalda da boncuklar görünene kadar odağı ayarlayın.
2. Boncuklar loşsa, ya lazer gücünü ya da EM kazancını artırın. Boncuk görüntülerindeki gürültünün en aza indirilmesi (çok sayıda foton, yani her boncuktan toplamda en az 5.000 foton tespit edilerek) doğru kanal kaydı için kritik öneme sahiptir. Kamerayı, sonraki FPALM görüntüleme için kullanılacak pozlama süresiyle aynı pozlama süresiyle 100 kare kaydedecek şekilde yapılandırın.
3. Boncukların kanalların hem merkezinde hem de çevresinde dağıtıldığı ve boncuk yoğunluğunun, tek tek boncukların iyi bir şekilde ayrıldığı ve ayrı ayrı tanımlanabildiği kadar düşük olduğu bölgeleri arayın.
4. Bu boncuk yoğunluklarında farklı bölgelerin 10-20 set görüntüsünü elde edin. Kanal kalibrasyonu için boncuk görüntülerinin kullanılmasıyla ilgili ayrıntılar için sonuçlar bölümüne bakın.

6. Görüntü Alımı: Çok Renkli FPALM

1. Yapıların her birinden yalnızca biri ile transfekte edilmiş hücrelerin görüntülenmesi ve tüm yapılara sahip hücrelerin görüntülerinin kaydedilmesi önemlidir. Bu veriler, kullanılan probların her birinin alfa histogramlarının oluşturulmasına yardımcı olacaktır ve çok renkli verilerin yorumlanması için gereklidir.
2. Kullanılıyorsa, foto değiştirilebilir probları ifade eden hücreleri bulun. Tüm oda aydınlatmasını ortadan kaldırın. Cıva lambasını, çevirmeli montaj (FM) aracılığıyla numuneye (transfekte edilmiş hücreler içeren) yansıtın. Etiketin ön foto anahtarlamalı durumunun uyarılmasına izin vermek için taret filtre küpünü uygun dikroik ayna/filtre kombinasyonunu içeren bir küple değiştirin. Örneğin, ön fotoanahtarlamalı Dendra2'yi veya yeşil önceden anahtarlamalı emisyona sahip probları görüntülemek için, DM4 için bir seçenek, mavi ışığı (<488 nm) yansıtan bir dikroiktir ve F5 için ışığı ~500-570 nm'den geçirirken bu aralığın dışındaki ışığı engelleyen bir filtredir.
3. Oküler kullanarak, önceden fotoğraflanmış probu ifade eden hücreleri arayın. Örneğin, Dendra2'yi ifade eden hücreler yeşil görünecektir. Tüm probların foto değiştirilebilir olmadığını ve önceden anahtarlanmış emisyon spektrumlarına bağlı olarak, burada listelenenlerden farklı DM4 / F5 kombinasyonları gerektirebileceğini unutmayın.
4. Bir hücre seçildikten sonra, lazerlerin mikroskoba geçmesine izin vermek için FM'yi aşağı hareket ettirin (cıva ışığını yoldan engelleyin). Filtre taretini, görüntüleme için uygun dikroik içeren taretle değiştirin (bu durumda, DM2 daha uzun dalga boylarını iletirken hem okuma hem de aktivasyon lazerini yansıtmalı ve F1 dalga boylarını lazerin kırmızısına iletmeli ve ideal olarak lazer dalga boyunda yüksek bastırma özelliğine sahip olmalıdır).
5. Hücreler foto değiştirilebilir bir prob ifade etmiyorsa, görüntüyü kameraya yansıtarak ve numuneyi aydınlatmak için okuma lazerini kullanarak hücreleri arayın. Tek moleküller muhtemelen birçok hücrede görünür olacaktır (bkz. Şekil 3).
6. Kesilen hücreleri arka plan floresansından (hala ayrı ayrı yanıp sönen moleküller olarak görünebilir) ayırt etmek ve moleküllerin fotoaktif olduğunu doğrulamak için, numuneyi aktivasyon lazerinin düşük gücüyle (tipik olarak mikrowatt mertebesinde) kısaca aydınlatın. Okuma ışını altında görülebilen fotoaktive edilebilir moleküllerin sayısı, aktivasyon aydınlatması bir kez daha bloke edildikten sonra bile önemli ölçüde artmalı ve kısa bir süre için yüksek kalmalıdır. Farklı probların parlaklıkları, fotodönüşüm verimliliği ve^{aktivasyon 24-27} için gereken lazer gücü açısından önemli ölçüde değişebileceğini unutmayın.
7. EM kazancını 200'e ayarlayarak ve istenen kare sayısını (tipik olarak 5.000-10.000) ve pozlama süresini (tipik olarak 10-30 msn uygundur) seçerek kamera yazılımını kinetik seri alımı için hazırlayın. EM kazancı 200'den daha yükseğe ayarlanabilirken, belirli bir noktadan sonra EM kazancının artırılması gürültüyü artırabilir.
8. Aktivasyon ışınını engelleyin. Okuma ışınının engelini kaldırın ve aydınlatılmış hücrenin görüntüsünü kameraya yansıtın.
9. Hücrenin transfekte edildiğini onaylayın (adım 6.6). Hücreyi görüntülerken, istenen odak düzlemi görünene ve moleküller keskin odakta olana kadar odağı ayarlayın.
10. Alt hücre zarının yakınında görüntü veren bir odak düzlemi seçmek için, tek tek moleküller artık görünmeyene kadar odağı aşağı kaydırın. Ardından, moleküller ilk görünür hale gelene kadar odağı kademeli olarak yukarı doğru hareket ettirin.
11. Üst hücresel zarın yakınında görüntü almak için, mikroskop odak düğmesini veya otomatik odaklamayı kullanarak mesafeyi not ederek odağı istenen miktarda yukarı kaydırmaya devam edin. Bu iki sınır arasında bir odak bölgesi seçmek, hücrenin ortasındaki bir bölgenin görüntülenmesine neden olacaktır.
12. Aktivasyon ışınının engelini kaldırın ve numuneyi düşük yoğunlukta aydınlatın (ışını çok düşük bir yoğunluğa, numunede kabaca <1 W/^cm2) düşürmek için ND2 filtrelerini kullanın).
13. Veri toplamaya başlayın. Yüksek yoğunluklu aktif moleküller arzu edilir; Ancak bu moleküllerin mekansal olarak örtüşmemesi analiz adımları için kritik öneme sahiptir.
14. ND2'yi ayarlayarak görünür fotoaktive edilebilir moleküllerin yoğunluğunu ~ 0.1-1 ^μm-2 'de tutmaya çalışın. Tipik olarak, çapı ~10-20 μm olan bir görüntü bölgesi için, aynı anda ~10-100 molekül görünür olacaktır (referans için Şekil 3 ve 4'e bakınız). Edinim sırasında kalan aktif olmayan moleküllerin sayısı azaldıkça, yoğunluğu korumak için aktivasyon lazer gücünün kademeli olarak artması gerekebilir.
15. TIRF görüntüleme isteniyorsa*, M5 ve L1'in her ikisi de yanal olarak hareket ettirilmek üzere (yani mikroskop girişinin hemen arkasındaki lazere dik bir yönde) tek bir translasyon aşamasına (TS, Şekil 1) monte edilmelidir. M5 ve L1 çevrilirken, numuneden yukarı doğru objektiften çıkan lazerler yavaş yavaş bir tarafa devrilecektir (DİKKAT: lazer güvenlik tehlikesi).
16. Lazerlerin açısı dikeyden 90 ° 'ye ulaştığında, ortaya çıkan lazerin kendisi kaybolacak, gelen okuma lazeri geri yansıyacak, objektif arka açıklığından dışarı çıkan, gelen ışına anti-paralel olan bir ışın olarak ortaya çıkacak ve yana doğru yer değiştirecektir.
17. Eşzamanlı olarak, arka plan floresansı neredeyse tamamen zayıflayacak ve fark edilebilir, odaklanmış tek moleküller içeren numune bölgesinin kalınlığı büyük ölçüde azalacaktır.
    *TIRF, lamel üzerinde ~100-500 nm olan numunenin ince bir bölümünün görüntülenmesine izin verecektir. Numunenin daha ilerisindeki odak düzlemlerinin görüntülenmesi, geniş alan aydınlatması kullanılarak kolayca elde edilir (Bölüm 3), ancak TIRF.
    
18. Edinme işlemi tamamlandıktan sonra, mikroskop kapağını hemen kapatın ve her iki ışını da bloke edin. EM kazancını devre dışı bırakın, kamerayı bir kare kaydedecek şekilde ayarlayın ve kamera okuma bölgesini maksimum boyutuna ayarlayın.
19. F3 veya F4'ün üzerine bir kart yerleştirerek bir kanalı engelleyin. Mikroskop lambasına monte edilmiş uzun geçirgen bir filtre (>580 nm) ile numuneyi aydınlatın ve bu görüntüyü kameraya yansıtın. Hücrenin anlık görüntüsünü kaydedin.
20. İSTEĞE BAĞLI: Bir kanal hala tıkalıyken, iletilen ışık aydınlatması ile numunenin geniş bir alanı görünecek şekilde açıklığı açın. Bir anlık görüntü kaydedin. İletilen bu ışık görüntüleri, karşılık gelen FPALM görüntülerinin bağlamını görüntülemek için çok yararlıdır.
21. Canlı hücre görüntüleme. Canlı hücreleri görüntülemek için, hücreleri 1.1-1.3 adımlarına göre transfekte edin, ancak bu örnekleri düzeltmeyin. Bunun yerine, kurulumu yukarıda açıklandığı gibi tam olarak hizalayın, ancak numuneleri görüntülemeden önce, bunları 37 °C ve% 5 CO_2'den çıkarın, 3x'i PBS'de yıkayın ve numuneyi görüntüleme ortamına daldırın (örn. 20 mM glikozlu PBS). Kültür ortamının çıkarılması ve yıkanması, çoğu hücresel ortamla ilişkili arka planı azaltacaktır.
22. Numuneler, istenirse sabit hücreler gibi RT'de veya mikroskop aşamasına monte edilmiş bir inkübasyon aşaması kullanılarak 37 ° C ve% 5 CO_2'de görüntülenebilir. Tek bir NIH 3T3 hücresi numunesi, yaklaşık 1 saatten fazla olmamak üzere görüntüleme ortamına daldırılmalıdır. Bu tür deneylere hazırlanmadan önce hücrelerin görüntüleme ortamına daldırmaya nasıl tepki verdiğini izlemek, hücrelerin bozulmasını azaltmak için daldırma süresini ve potansiyel olarak görüntüleme ortamının bileşimini optimize etmek yararlı olabilir.

Results

İnfluenza hemaglutinin (HA), onlarca nanometre ila mikrometre mertebesinde kümeler oluşturur ve bu kümeler aktin ile değişken bir şekilde kolokalize olur (Şekil 5). Bu uzamsal dağılımlar, bu iki proteinin²⁸ daha kaba ölçekli görüntülemesini ve HA uzamsal dağılımlarının aktin^19'a bağımlılığını doğrulamaktadır. Çok renkli FPALM görüntüleri, bu kümelerin yoğunluğunu, alanını ve çevresini ve hem nano hem de mikro ölçekte iki tür arasındaki kolokalizasyon derecesini tanımlamak için daha ...

Discussion

Lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü görüntüleme, biyolojik görüntüleme için birçok güçlü yetenek sağlar. Masaya yerleştirilen bireysel optik bileşenlerden, biyolojik bir numunedeki birden fazla floresan türünü aynı anda görüntüleyebilen işlevsel bir süper çözünürlüklü mikroskoba giden yol, bir dizi zorluğu beraberinde getirir. Hizalamanın bazı yönleri diğerlerinden daha kritiktir; Aşağıda, rotanın en zor yönleriyle uğraşan potansiyel kullanıcılara rehberlik sağlamaya çalışıyoruz.

Kritik Adıml...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek II odaları	Nunc
Floresan boncuklar	Invitrogen	F-8801	Kalibrasyon için boncuklar
Tetraspeck boncuklar	Invitrogen	T-7279	Kalibrasyon için dört renkli boncuklar
Objektif daldırma yağı	Zeiss	518F	Yüksek NA hedefi için daldırma yağı (objektif seçimine bağlı olarak)
HPLC su	Fisher Bilimsel	W5-4
Medya	ATCC	30-2003	Veya Cellgro 10-090
Antibiyotikler	GIBCO	15070-063
serum	Termo Bilimsel	SH30087.03
Lipofektamin	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Tripsin	MPBiomedicals
paraformaldehit	Fisher Scientific	AA433689M	DİKKAT: Toksik