Method Article

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/50680

⸱

December 9th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yerelleştirme tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi, onlarca nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip bir numune içindeki tek tek floresan etiketli tek moleküllerin dağılımının uzamsal bir haritasını (görüntüsünü) elde etmek için uygulanabilir. İlgilenilen proteinlere kaynaşmış fotoaktif (PAFP) veya foto değiştirilebilir (PSFP) floresan proteinleri veya antikorlara veya diğer ilgili moleküllere konjuge organik boyaları kullanarak, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (FPALM), tek hücreler içinde aynı anda birden fazla molekül türünü görüntüleyebilir. Aşağıdaki yaklaşımı kullanarak, çok sayıda (binlerce ila yüz binlerce) bireysel molekül popülasyonları tek hücrelerde görüntülenir ve ~ 10-30 nm hassasiyetle lokalize edilir. Elde edilen veriler, bir hücre içindeki çoklu protein türlerinin nano ölçekli uzamsal dağılımlarını anlamak için uygulanabilir. Bu tekniğin birincil avantajlarından biri, uzamsal çözünürlükteki dramatik artıştır: kırınım, geleneksel ışık mikroskobunda çözünürlüğü ~ 200-250 nm ile sınırlarken, FPALM, uzunluk ölçeklerini daha küçük bir büyüklük sırasından daha fazla görüntüleyebilir. Birçok biyolojik hipotez, farklı biyomoleküller arasındaki mekansal ilişkilerle ilgili olduğundan, FPALM'ın geliştirilmiş çözünürlüğü, daha önce geleneksel floresan mikroskobu tarafından erişilemeyen hücresel organizasyon sorularına ışık tutabilir. Numune hazırlama ve veri toplama yöntemlerini detaylandırmanın yanı sıra, burada FPALM için optik kurulumu açıklıyoruz. Süper çözünürlüklü mikroskopi yapmak isteyen araştırmacılar için ek bir husus da maliyettir: şirket içi kurulumlar, ticari olarak mevcut görüntüleme makinelerinin çoğundan önemli ölçüde daha ucuzdur. Bu tekniğin sınırlamaları arasında, hücre numuneleri içindeki ilgili moleküllerin etiketlenmesinin optimize edilmesi ihtiyacı ve sonuçları görselleştirmek için son işlem yazılımına duyulan ihtiyaç yer alır. Burada, sabit hücrelerde iki protein türünü görüntülemek için PAFP ve PSFP ekspresyonunun kullanımını açıklıyoruz. Tekniğin canlı hücrelere genişletilmesi de açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel yapılar çok çeşitli uzamsal ölçeklerde bulunurken, ~250 nm'den daha küçük uzunluk ölçeklerinde hücresel organizasyonun floresan görüntülemesi, kırınım sınırının fiziksel kısıtlaması nedeniyle geleneksel mikroskopide sınırlıdır. Bu sınır, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (FPALM1) ve birkaç on nanometre çözünürlüğe sahip görüntüler oluşturmak için çok sayıda bireysel molekülü ~ 10 nm hassasiyetle lokalize edebilen benzer tekniklerin2,3 ortaya çıkmasıyla aşıldı. FPALM, moleküllerin alt kümelerini aktive etmek ve etkisiz hale getirmek için optik kontrolün kullanılmasına dayanır (FPALM'nin tam bir açıklaması ve bu görüntüleme s....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lütfen dikkat: Bu protokolde atıfta bulunulan optik bileşenlerin diyagramatik bir gösterimi Şekil 1'de bulunabilir.

1. Hücre Örneği Hazırlama

  1. 8 oyuklu bir odanın kuyucuklarında optimize edilmiş bir yoğunlukta plaka hücreleri (NIH-3T3 hücreleri için bu kabaca 2-5 x 104 hücre /cm2'dir). Hücreler, hücre tipine uygun tam ortamda kaplanmalıdır, ancak ortam antibiyotiksiz ve fenol kırmızısı olmadan yapılmalıdır, bu da arka plan floresansına katkıda bulunur. En uygun geçiş sayıları aralığı gibi hücre deneyi koşullarının, tek tek hücre hatları için farklılık gösterebileceğini unutmayın.
  2. H....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnfluenza hemaglutinin (HA), onlarca nanometre ila mikrometre mertebesinde kümeler oluşturur ve bu kümeler aktin ile değişken bir şekilde kolokalize olur (Şekil 5). Bu uzamsal dağılımlar, bu iki proteinin28 daha kaba ölçekli görüntülemesini ve HA uzamsal dağılımlarının aktin19'a bağımlılığını doğrulamaktadır. Çok renkli FPALM görüntüleri, bu kümelerin yoğunluğunu, alanını ve çevresini ve hem nano hem de mikro ölçekte iki tür arasındaki kolokalizasyon derecesini tanımlamak için daha .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü görüntüleme, biyolojik görüntüleme için birçok güçlü yetenek sağlar. Masaya yerleştirilen bireysel optik bileşenlerden, biyolojik bir numunedeki birden fazla floresan türünü aynı anda görüntüleyebilen işlevsel bir süper çözünürlüklü mikroskoba giden yol, bir dizi zorluğu beraberinde getirir. Hizalamanın bazı yönleri diğerlerinden daha kritiktir; Aşağıda, rotanın en zor yönleriyle uğraşan potansiyel kullanıcılara rehberlik sağlamaya çalışıyoruz.

Kritik Adıml.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STH ve MJM, süper çözünürlüklü mikroskopide patentlere sahiptir. S.T.H. Vutara, Inc.'in bilimsel danışma kurulunda görev yapmaktadır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bilgisayar programlama, teknik yardım ve faydalı konuşmalar için Philip Andresen, Matthew Parent ve Sean Carter'a ve idari yardım için Pat Byard'a teşekkür eder. Bu çalışma NIH Kariyer Ödülü K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Teknoloji Enstitüsü MTAF 1106 ve 2061 ve Maine Ekonomik İyileştirme Fonu tarafından finanse edilmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LabTek II odalarıNunc
Floresan boncuklarInvitrogenF-8801Kalibrasyon için boncuklar
Tetraspeck boncuklarInvitrogenT-7279Kalibrasyon için dört renkli boncuklar
Objektif daldırma yağıZeiss518FYüksek NA hedefi için daldırma yağı (objektif seçimine bağlı olarak)
HPLC suFisher BilimselW5-4
MedyaATCC30-2003Veya Cellgro 10-090
AntibiyotiklerGIBCO15070-063
serumTermo BilimselSH30087.03
LipofektaminInvitrogen52887
Optimem IGIBCO11058-021
TripsinMPBiomedicals
paraformaldehitFisher ScientificAA433689MDİKKAT: Toksik
1689149

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  2. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Photoactivation Localization MicroscopyMulticolor ImagingSuper Resolution MicroscopyPhotoactivatable Fluorescent ProteinsPhotoswitchable Fluorescent ProteinsTotal Internal Reflection FluorescenceNanometer Precision ImagingLive Cell ImagingFixed Cell ImagingOptical Setup Alignment

Related Articles