Yöntem makalesi

Yetişkin Zebra Balığının Bireysel ve Sürülerini Kaydetmek için Otomatik Bir 3D İzleme Sistemi Kullanma

12.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50681

⸱

5 Aralık 2013

 ,  , 
1R&D, xyZfish

Bu makalede

Özet

Zebra balığının tek tek ve gruplarını izleyebilen bir 3D otomatik video sisteminin kullanımı anlatılmaktadır. Uygulama örneği olarak, NMDA reseptör antagonisti MK-801'in zebra balığı sürüleri üzerindeki etkilerini araştırıyoruz.

Özet

Birçok su hayvanı gibi, zebra balığı (Danio rerio) da 3B bir alanda hareket eder. Bu nedenle, davranışını incelemek için bir 3D kayıt sisteminin kullanılması tercih edilir. Sunulan otomatik video izleme sistemi, bunu bir ayna sistemi ve ışığın sudan havaya geçişinin neden olduğu önemli hatayı düzelten bir kalibrasyon prosedürü kullanarak gerçekleştirir. Bu sistem ile yetişkin zebra balıklarının hem tek hem de grup halinde kayıt altına alınması mümkündür. Kullanmadan önce sistemin kalibre edilmesi gerekir. Sistem üç modülden oluşur: Kayıt, Yol Yeniden Yapılandırma ve Veri İşleme. Kalibrasyon ve üç modülün kullanımı için adım adım protokoller sunulmaktadır. Deney düzeneğine bağlı olarak, sistem neofobi, beyaz nefreti, sosyal uyum, motor bozukluklar, yeni nesne keşfi vb. test etmek için kullanılabilir. İlaçların veya mutasyonların temel davranış kalıpları üzerindeki etkilerini incelemek için ilk adım bir araç olarak özellikle umut vericidir. Sistem, zebra balığının dikey ve yatay dağılımı, kinematik parametrelerin xyz bileşenleri (hareket, hız, ivme ve dönüş açısı gibi) hakkında bilgi sağlar ve sürüleri test ederken sosyal uyum parametrelerini hesaplamak için gerekli verileri sağlar.

Giriş

Zebra balığı biyolojik ve farmakolojik araştırmalar için önemli bir model haline gelmiştir1-3. Bireysel zebra balıklarının ve zebra balığı sürülerinin hareket ve mekansal dağılım modellerinin izlenmesi paha biçilmezdir. Daha eski çalışmalar, kaydedilen görüntülere dayalı olarak manuel niceleme uygular4. Şimdi, 2D otomatik video izleme sistemleri yaygın olarak kullanılmaktadır5. Bununla birlikte, zebra balığı ve diğer birçok suda yaşayan ve olmayan hayvan üç boyutlu bir uzayda hareket ettiğinden, 3D sistemlere olan ilgi artmaktadır6. Açıklanan 3D sistem ilk olarak 2007 yılında yayınlanmıştır7. Teknik detaylar ve diğer sistemlerle karşılaştırmalar için bakınız8. Bu sistemin diğer sistemlere kıyasla temel avantajı, bir yansıtma sistemi kullanarak iki (isteğe bağlı olarak üç) senkron ve bağımsız görünüm elde etmesi ve iki aşamalı bir kalibrasyon protokolü kullanmasıdır. İlk adımda, stereo sistemin 3D geometrisi (kamera ve aynalar tarafından oluşturulan) kalibre edilir. İkinci adımda, ışık kırılmasının neden olduğu doğrusal olmayan hatalar düzeltilir. Suda yaşayan hayvanları incelerken, ışık kırılmasının etkisi düzeltilmeden bırakıldığında önemli olabilir. Şimdiye kadar yayınlanan diğer sistemler (hatta daha yeni gelişmeler9) iki aşamalı kalibrasyon prosedürünü atlıyor. Nesne tanımlama, çoklu nesne izleme ile oklüzyon, jigging gürültüsü vb. hakkında teknik ayrıntılar için. Okuyucu orijinal yayınlarayönlendirilir 8,9. Sistem, kaygı benzeri davranışsal tepkilerin10,11, sürü8,11,12 incelenmesi ve bir ön çalışmada zebra balığı13'te antagonistik davranış için doğrulanmıştır. Ayrıca diğer balık türleri (Japon balığı8, kılıçkuyruk, kaplan dikeni) ve fareler9 için test edilmiştir.

Aşağıda, kalibrasyon ve sistemin kullanımı için protokoller açıklanmış ve NMDA-reseptörü rekabetçi olmayan antagonist MK-801'in sürü zebra balığı üzerindeki etkilerini test eden bir deneyin sonuçları, sistemle elde edilebilecek veri türünü göstermek için temsili bir örnek olarak sunulmuştur.

Hem doğal ortamda hem de akvaryumlarda, zebra balığı genellikle sürüler halinde yüzer14. Sürü tercihleri, yetiştirme, cinsiyet ve yiyecek mevcudiyeti gibi çeşitli faktörlere bağlı gibi görünmektedir14,15. İlginç bir şekilde, bir sürüdeki tek tek zebra balığı arasındaki mesafe, alarm feromonları16 veya yenilik11 gibi potansiyel tehlike sinyalleri mevcut olduğunda küçülür. Bu nedenle sığlaşma paradigması, anksiyolitik ilaçları test etmek için de kullanılmaktadır17. Baskınlık hiyerarşileri18 ve sosyal öğrenme19, zebra balığı davranışının büyüleyici yönüdür. Oldukça gelişmiş sosyal davranışsal karakteri nedeniyle, zebra balığı otizm araştırmaları için de ilgi çekici hale gelmiştir20,21.

MK-801'in zebra balığı5,22,23'te sosyal davranışı değiştirdiği bildirilmiştir, bu da memeliler üzerindeki etkilerini anımsatır24. Bununla birlikte, MK-801'in diğer davranışlar üzerinde başka birçok etkisi de vardır (yüzme davranışı, engelleyici kaçınma ve yer tercihi25-27 gibi). Bu nedenle, ilk deneylerde temel gözlemlerden mümkün olduğunca fazla bilgi elde etmek çok önemlidir. Bu, daha hedefli deneyler tasarlamak için temel sağlayacaktır.

Kayıt cihazı ve yazılımının incelenmesi

Mevcut konfigürasyonunda, zebra balığını tutan gözlem kabı (25 cm x 25 cm x 18 cm, U x G x Y), gözlem odasına (91 cm x 46 cm x 56 cm, U x G x Y) yerleştirilmiştir. Haznede ayrıca bir kamera, kabın üzerinde yaklaşık >45° açıyla asılı duran bir ayna ve LED ışık çubukları bulunur. Şekil 1'de basitleştirilmiş bir diyagram gösterilmektedir. Kamera, zebra balığının x, y ve z koordinatlarını belirleyerek 3 boyutlu yörüngelerini oluşturmak için hem önden görünümü hem de üstten görünümü (ayna) kaydeder. Oryantasyon amacıyla, koordinat vektörleri, Yol Yeniden Yapılandırma Modülü tarafından oluşturulan 3B görünümlerde (örn. Şekil 15) sunulan vektörlere karşılık gelen gözlem kabının sol ön köşesinde (kameraya göre konum) sunulur (aşağıya daha fazla bakın). Örnekleme hızı fotoğraf makinesine ve bilgisayara bağlıdır. Deneylerimizde yaklaşık olarak 40 kare/sn'dir (fps). Kaydedilen karelerin uzamsal çözünürlüğü 640 x 480 pikseldir (bu konfigürasyon, uzamsal ve zamansal çözünürlük arasında en uygun denge olarak seçilmiştir). Windows XP veya üstü gereklidir.

İlk kayıttan önce, sistemin konteynerin duvarlarının ve su yüzeyinin konumlarını belirlemek, kaydedilen karelerin ölçekleme faktörünü belirlemek ve sudan havaya geçerken ışığın kırılmasından kaynaklanan büyük hatayı ayarlamak için kalibre edilmesi gerekir. Prensip olarak, kalibrasyon yalnızca ilk kurulum sırasında ve kurulumun kamera veya ayna gibi parçaları taşındıktan veya değiştirildikten sonra yapılmalıdır. Bununla birlikte, zaman zaman kalibrasyonun hala doğru olup olmadığını kontrol etmek ve gerekirse yeniden kalibre etmek iyi bir uygulamadır.

Yazılım üç modülden oluşmaktadır. Kayıt Modülü kareleri kaydeder (Şekil 2'de iki örnek çerçeve gösterilmiştir). Yörünge Modülü, her zebra balığı için yolları yeniden oluşturur. Veri İşleme Modülü, bir dizi standart kinematik ve uzamsal parametreyi hesaplar. Daha fazla analiz amacıyla, veriler elektronik tabloya veya istatistiksel yazılıma aktarılabilir.

Protokol

Tüm deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yapılmıştır.

1. Kalibrasyon

  1. Hazneye boş bir gözlem kabı yerleştirin, böylece kabın ayakları doğru hizalama için sağlanan deliklere yerleştirilir. Kabı, yarı saydam duvarlar (yapılarının amacı yansımaları azaltmaktır) kameranın uzak tarafına ve sağına bakacak şekilde yönlendirin.
  2. Kayıt Modülünü açın, 'Kamera kontrolü'nü seçin ve görüntünün net olması için 'kazanç' ve 'deklanşör'ü ayarlayın (seçimlerini kaldırdıktan sonra sağdaki kutular). Yan aynayı, bilgisayar monitöründeki kabın yandan görünümü tam olarak görünecek şekilde gözlem kabının sol tarafına yaklaşık 45°'lik bir açıyla yerleştirin. Ayrıca, ayna, kabın ön duvarı tek bir çizgi olarak görülecek şekilde hizalanmalıdır (Şekil 3'teki okla gösterildiği gibi).
  3. Kalibrasyon panelini paralel bağlantı noktasına (kamera kartının) bağlayın ve LED'leri açmak için Kayıt Modülündeki 'LED panel açma/kapama' düğmesine basın.
  4. Kalibrasyon panelini, Şekil 3'teki gibi bilgisayar monitöründe ön, üst ve yan görünümlerde 5 LED görülebilecek şekilde boş gözlem kabına yerleştirin (bazen kablo görünümü engeller, bu durumda hareket ettirin). Ayrıca LED'lerin su seviyesi işaretlerinin altında olduğundan (bu işaretler, tankın iç tabanından 135 mm uzakta gözlem kaplarına kazınmıştır) ve panelin konumunun sabit olduğundan emin olun (böylece kabı suyla doldururken hareket etmez adım 1.9).
  5. Gözlem odasındaki ışıkları kapatın ve perdeyi kapatın (kalibrasyon panelinin kablosuna veya yan aynaya dokunmamaya dikkat edin).
  6. 'Veri konumu' düğmesine basın ve kalibrasyon dosyaları için bir klasör oluşturun veya seçin. Bu dosyalar, yeniden kalibrasyon gerekli hale gelene kadar sonraki tüm kayıtlar (veya deneyler) için kullanılacaktır. Bu nedenle, ideal olarak kalibrasyon verilerini kalibrasyon klasörünün adının bir parçası haline getirin.
  7. Bilgisayar ekranındaki üç kırmızı kutuyu, her biri üç görünümden herhangi birindeki 5 LED'i kapsayacak şekilde ayarlayın (Şekil 4, sol panel). Şekil 4, sağ panelde olduğu gibi, diğer ışık noktalarının görüntüleri (kabın duvarındaki gürültü, yansımalar veya su damlacıkları nedeniyle) olmadan LED'lerin net görüntülerini elde etmek için yine 'Kamera kontrolü' altındaki 'kazanç' ve 'deklanşör'ü kullanın.
  8. LED'leri kapatın ve 'Kalibrasyonu su olmadan topla' düğmesine basın. Bilgisayar ekranında 0-4 arasında numaralandırılmış 5 adet etiket ('x') görünür. Paneli açın. Etiketlerin konumları LED'lerle aynı olmalıdır. Değilse, adım 1.7'yi tekrarlayın (sol panelde yanlış etiket ataması ve sağ panelde doğru etiket ataması için Şekil 4'e bakın).
  9. Gözlem odasını işarete kadar suyla doldurun. LED'ler su seviyesinin altında olmalıdır (adım 1.4'te açıklandığı gibi). Su seviyesinin üzerindeyseler, kabı boşaltın ve adım 1.4'e geri dönün. Suyu kabın içine doldururken LED panelin hareket etmemesine dikkat edin. Ancak, bu olursa, kabı boşaltın ve adım 1.4'e geri dönün. Bu önemlidir, çünkü kalibrasyon, kaydedilen LED'lerin susuz ve susuz konumları arasındaki farkların belirlenmesine dayanır.
  10. 'Kalibrasyonu suyla topla' düğmesine basın. Yine, adım 1.8'de olduğu gibi, ekranda çoğu durumda susuz kalibrasyon sırasında elde edilenlerden biraz kaydırılacak olan beş etiket görünecektir. Bu adımda, kazanç ve deklanşörün yeniden ayarlanması gerekebilir. Etiketler LED'lerin üzerine doğru şekilde yerleştirilene kadar tekrarlayın (Şekil 4, sağ paneldeki gibi).
  11. Gözlem odasındaki ışıkları açın, kazancı ve deklanşörü ('Kamera Kontrolü' altında) görüntünün aşırı parlak olmaması için ayarlayın.
  12. Şekil 5, fareye sağ tıklanarak sırayla seçilmesi gereken altı noktayı göstermektedir. Noktaların belirtilen çizgiler üzerinde olduğundan emin olun: 1. önden görünüm su seviyesi, 2. üstten görünümde kabın sol üst sırtı, 3. yandan görünümde ön duvarı özetleyen dikey çizgi. Hattın uzunluğu önemli değildir. 1 ve 2, 3 ve 4 ve 5 ve 6 tıklama konumları arasında düz çizgiler görünecektir (sayılar aslında ekranda görünmeyecektir). Bu bilgileri kaydetmek için 'Kapsayıcı bilgilerini topla'ya basın.
  13. Hem yan aynayı hem de LED paneli çıkarın ve suyu tam olarak işarete kadar doldurun. 'Kaydı Başlat'ı seçin. Yeni bir pencere, süreyi dakika cinsinden sorar. Mevcut amaç için 1 dakika yeterlidir. Tamam'a basın.
  14. Kayıttan sonra, Kayıt Modülünden çıkın, Yörünge Modülünü açın, 'Veri Konumu' ile kalibrasyon klasörünü (adım 1.6'da yapılmıştır) seçin (dosyanın yüklenmesi biraz zaman alabilir). Bu klasör, kalibrasyon dosyalarını ve yeni kaydedilen verilerin dosyalarını içerir (adım 1.13).
  15. 'Arka Plan Al' düğmesine basın. Yeni bir pencere açılır, hiçbir şeyi değiştirmeden Tamam'a basın. Monitörde gözlem tankının (baş aşağı) bir görüntüsü görünene kadar bekleyin. Ardından 'Arka Planı Yükle'ye basın. Arka plan resmi düzeltilecektir. Kutuların ayarlanmasını isteyen yeni bir pencere açılır. Tamam'a basmanız yeterlidir.
  16. Üçüncü düğmeden yedinci düğmeye sırayla basın: 'Yazışmaları su olmadan yükle', 'Sanal kameraları kalibre et', 'Kırılan yazışmaları yükle', 'Konteyner geometrilerini topla', 'Hayvan konteyner bilgilerini al'. Bu son adım birkaç dakika sürebilir. Ekranda üç beyaz çizgi göründüğünde tamamlanır (bunlar adım 1.12'de çizilen çizgilerdir). "Konteyner bilgilerini kaydet" düğmesine basın.
  17. 'Sesi topla' düğmesine basın. Şimdi, Şekil 6'da gösterildiği gibi, bir küboid olan su kütlesinin 8 köşesini art arda işaretleyin. Her nokta için önce ön görünümde, sonra da üst görünümde tıklayın.
  18. Pencerenin sol köşesindeki '3D'yi seçin. Şimdi, beyaz tabanlı bir kutunun ana hatlarını gösteren yeni bir pencere açılır (Şekil 15'teki gibi, ancak yörünge olmadan). Kutu görünümünün dönüşlerini ve çevirilerini seçmek için fareye sağ tıklayın. Hiçbir görüntü görünmüyorsa veya görüntü bir küboide ait değilse (yani, adım 1.17'de köşeler yanlış sırada sağ tıklanmışsa), aşağıdakileri yapın: ayrılırken, ancak Yörünge Modülünü kapatmazsanız, Windows'u kullanarak kalibrasyon klasörüne gidin (adım 1.6'da yapılmıştır), 'Hayvan kabı verileri' alt klasörünü seçin ve TankVertices adlı dosyayı silin ve adım 1.17'yi tekrarlayın.
  19. Tebrikler, kalibrasyon tamamlandı. İdeal olarak, her şeyin yolunda gidip gitmediğini kontrol etmek için kukla bir balıkla bir test çalışması yapılmalıdır. İyi haber şu ki, yeniden kalibrasyon yalnızca ayna veya kameranın konumları (çok az da olsa) değiştiğinde veya izleme ile ilgili sorunlar olduğunda yapılmalıdır (bkz. bölüm 3).

2. Kayıt

  1. İşaretlere kadar su ile doldurulmuş gözlem kabını, kabın ayakları doğru hizalama için sağlanan deliklere sokulacak şekilde gözlem odasına yerleştirin. Kabı, yarı saydam duvarlar (veya örneğimizdeki beyaz duvarlar - Tartışmaya bakın) kameradan görüldüğü gibi uzak tarafa ve sağa bakacak şekilde yönlendirin.
  2. Bölmedeki ışıkları açın, (deneysel veya kukla) balığı kabın içine koyun ve perdeleri kapatın. Not: sistem birden fazla balık kaydedebilir (Temsili Sonuçlar bölümüne bakın); Bununla birlikte, önce tek bir balığı kaydederek sistemle ilgili biraz deneyim kazanmanız önerilir.
  3. Kayıt modülünü açın. Ekranda, kabın ön ve üst (ayna) görünümünün görüntüsü görünür. Görüntü ideal olmayabilir (örn. aşırı pozlanmış, örn. Şekil 7) ve balık ile arka plan arasında iyi bir kontrast elde etmek için ayarlanması gerekebilir (örn. Şekil 8).
  4. 'Kamera kontrolü'nü seçin ve açılan 'Genel Ayarlar' penceresinde, 'Deklanşör' ve 'Kazanç'ı (sağdaki ilgili kutuların seçimini kaldırdıktan sonra, bkz. Şekil 9) görüntü aşırı pozlanmayacak ve balık ile arka plan arasında iyi bir kontrast olacak şekilde ayarlayın.
  5. 'Kamera kontrolü' penceresinin sol tarafında, 'Beyaz Dengesi/Renk'i seçin ve yeni pencerede 'Otomatik' kutusunun işaretini kaldırın ve hem önden hem de üstten en iyi renk kontrastını elde etmek için Kırmızı ve Mavi değerlerini ayarlayın (bkz. Şekil 10).
  6. En iyi kamera ayarını elde etmek için renk ayarlama ('Beyaz Dengesi/Renk' altında) ve kazanç ve deklanşör ayarlama ('Genel Ayarlar' altında) arasında birkaç kez geçiş yapmanız gerekebilir. Herhangi bir ayarlama yapmadan memnun kalsanız bile, 'Deklanşör', 'Kazanç' ve 'Otomatik' kutularının seçimini kaldırmanın çok önemli olduğunu unutmayın (adım 2.4 ve 2.5'te açıklandığı gibi), aksi takdirde arka plan kayıt boyunca dalgalanacak ve bu da yörüngeleri çıkarmayı imkansız hale getirecektir. Diğer ayarların hiçbirini değiştirmeyin. İşiniz bittiğinde 'Kamera Kontrolü' penceresini kapatın.
  7. Kayıt Modülünün ana menüsünden, daha önce yapılmış bir klasörü oluşturmak veya açmak için 'Veri konumu'nu seçin. Her kaydın (örneğin balık veya sürü), ideal olarak deney klasörünün bir alt klasörü olması gereken kendi klasörüne sahip olduğunu unutmayın.
  8. 'Kaydı başlat'a basın. Kaydın süresini dakika cinsinden soran bir pencere açılır (yalnızca tam sayıları girin). Gerçek kayıt oturumunu başlatan 'Tamam'a basın.
  9. Kayıt tamamlanırsa programdan çıkın. Bir sonraki balığı kaydetmeden önce bilgisayarı yeniden başlatmanız önerilir. Kamera ayarlarını korumak için Windows'taki Yeniden Başlat seçeneğini kullanın (2.4 ve 2.5 adımlarından). Kayıtlar arasında bilgisayarı yeniden başlatma gerekliliği, kamera kartındaki bazı sorunlardan kaynaklanmaktadır.
  10. Yolun yeniden yapılandırılması için Yörünge Modülüne gitmeden önce, kalibrasyon klasöründen (bu protokolün birinci bölümünde yapılmıştır) 'Hayvan kabı verileri' ve 'Yazışma verileri' alt klasörlerini kopyalayıp kayıt sırasında oluşturulan her klasöre yapıştırın. Bu son klasörlerde, 'Ham veriler' ve 'Zaman damgaları' olmak üzere iki alt klasör daha bulunur. İlki, JPEG formatında kaydedilen tüm kareleri içerir; İkincisi, toplam kare sayısı ve çerçeveler arasındaki aralıklar (msn cinsinden) hakkında bilgi içerir.

3. Yol Yeniden Yapılandırması

  1. Yörünge Modülünü açın, Kayıt Modülü ile oluşturulan klasörü seçmek için 'Veri konumu'na basın ve ardından 'Parametreler'i açmak için 'Sistem Kurulumu' düğmesine basın (bkz. Şekil 11).
  2. Üst ve alt görünüm renk eşiklerini seçin. İyi bir başlangıç değeri 1.000'dir. Bu değer düşükse, yazılımın gürültü kaydetme olasılığı daha yüksektir. Bununla birlikte, değer çok yüksekse, balık algılama aralığının altında olabilir. Daha sonra (3.11 ve 3.12 adımları) renk eşiklerini yeniden ayarlamak gerekebilir. Ayrıca, üst ve alt renk eşiklerinin aynı olması gerekmediğini unutmayın.
  3. Üst ve Alt Görünüm Boyutu Eşikleri'ni seçin. Orta büyüklükteki bir zebra balığı için iyi bir başlangıç değeri 10, çok büyük olan için 20 ve çok küçük olan için 5'tir. Boyut eşiği ne kadar yüksek olursa, gürültü alma olasılığı o kadar düşük olur. Ancak, çok yüksekse, yazılım da balığı algılayamayabilir. Yine, adım 3.11 ve 3.12'de boyut eşiklerinin yeniden ayarlanması gerekebilir. Ayrıca, üst ve alt boyut eşiklerinin aynı olması gerekmediğini unutmayın.
  4. 'Üst Boyut Eşiği' için 3.000 değeri genellikle iyidir ve 'Belirli Uzunluk' için bunu 220'de bırakın (önceden ayarlanmış). 'Balık sayısı', gözlem tankındaki balık sayısını ifade eder. 'Maksimum Nokta Sayısı', toplam kare sayısını ifade eder. Bu sayıyı veya biraz daha düşük bir sayıyı hatırlayın (veya not edin) (örneğin, 45.703, 45.000 olarak ezberlenebilir). Tamam'a basın.
  5. Sırayla 'Yazışmaları su olmadan yükle', 'Sanal kamera(lar)ı kalibre et' ve 'Hayvan kabı bilgilerini yükle' düğmelerine basın. 'Hayvan kabı verileri' ve 'Karşılık gelen veriler' kalibrasyon alt klasörleri mevcut deney klasörüne kopyalanmadıysa bir hata mesajı oluşturulur (bkz. adım 2.10). Öyleyse, bu alt klasörleri şimdi kopyalayıp yapıştırın ve düğmelere tekrar basın.
  6. 'Arka plan al' düğmesine basın. Yeni bir pencere, 'başlangıç' ve 'bitiş' ifadelerinin sırasıyla 0 ve 100 varsayılan değerleriyle doldurulmasını isteyecektir. 100'ü maksimum kare sayısına değiştirin (adım 3.4'te verilen örnekte bu, 45.000 olarak basitleştirilebilir). Tamam'a basın.
  7. (Bozuk) bir görüntü görünene kadar bekleyin. Ardından, doğru arka plan resminin oluşturulmasına neden olacak 'Arka planı yükle'ye basın. Balıklar bu arka plan resminde görünmemelidir. Balık görünüyorsa, diğer kayıt segmentlerinden daha iyi bir arka plan elde etmeye çalışın (örneğin, adım 3.6'da 0-1.000, 1.000-2.000 vb. deneyin).
  8. Balık kayıt oturumu sırasında hiç hareket etmediyse, arka plan elde etmenin tek yolu balığı çıkarmak ve balık olmadan, ancak aynı 'Kamera Kontrolleri' ayarlarıyla (bu önemlidir) yeni bir kısa kayıt yapmaktır. Arka planı alın ve 'Arka plan verileri' alt klasörünü geçerli deneysel klasöre kopyalayın. Şimdi 'Arka planı yükle'ye basın, 'Arka planı al'a basmayın. Perdeyi açıp kapatmanın genellikle arka planın biraz değişmesine neden olduğunu, bu nedenle gürültüyü azaltmak için 3.2 ve 3.3 adımlarındaki eşikleri ayarlamanın gerekli olabileceğini unutmayın. Adım 3.11, gürültünün nasıl kontrol edileceğini gösterir.
  9. Arka planı yükledikten sonra, üç kırmızı kutuyu (fare yardımıyla) Şekil 12'de gösterildiği gibi ayarlayın. Kutular, yazılımın balıkları aradığı alanları işaretler. Soldaki kutuyu kapatın (yani bir çizgiye veya bir noktaya düşürün) çünkü yan görünüm yalnızca kalibrasyon için kullanılır (adım 1.7'de açıklandığı gibi).
  10. 'Yörünge oluşturmaya başla' düğmesine basın. Başlangıç çerçeve numarasını soran bir pencere açılır. Varsayılan '0' ile gidin. 'Tamam'a bastıktan sonra, 'Etiket atamaları' penceresi açılır (bkz. Şekil 13). Ekranda etiket ('X0') görünene kadar 'İleri adım'a basın. Etiket balığın görüntüsünün üzerine yerleştirilmemişse, doğru şekilde yerleştirilene kadar 'Hayır'a basın. Ardından 'Git'e basın. Hiçbir zaman doğru atanmamışsa (veya hiç), yine de 'Git'e basın ve sorunu arayın (sonraki adım).
  11. Yolun yeniden inşası başlar. İdeal olarak, etiket her zaman (veya en azından çoğu zaman) balığın görüntüsüne yerleştirilmelidir. Sık sık yanlış yerleştiriliyorsa, 'Bilgi' penceresini açın (video ekranının üzerindeki ikinci seçenek). Şekil 14A, balığın sadece ana hatlarının görüldüğü ideal durumu göstermektedir. Şekil 14B, doğru etiket atamasını engelleyen aşırı gürültü durumunu göstermektedir. Balığın gürültüsüz net bir görüntüsünü görüyorsanız (Şekil 14A'daki gibi), ancak etiket hiçbir zaman veya nadiren doğru şekilde atanmayacaksa, bunun en olası nedeni kalibrasyonun kapalı olmasıdır. Yol yeniden yapılandırmasını yeniden kalibre edin ve yeniden yapın. Kalibrasyon sırasında ayna ve kameralar hareket ettirilmezse, yeni kalibrasyon verileri daha önce gerçekleştirilen kayıtlar için kullanılabilir.
  12. Aşırı gürültü durumunda (Şekil 14B'deki gibi), ana menüde 'Durdur'a basın ve yeni renk ve boyut eşikleri seçin (adım 3.2 ve 3.3). Ayrıca kırmızı kutuların (adım 3.9) biraz azaltılıp azaltılamayacağını kontrol edin (örneğin, üstteki su hareketlerinin oluşturduğu gürültüyü hariç tutmak için). Bazen programın 'takıldığını' unutmayın (eğer hiç etiket tahsis edilememişse): bu durumda programı yeniden başlatın.
  13. 3D ekranda yörüngeyi izleyin (ekranın üzerindeki üçüncü seçenek). Şekil 15. bir yörünge örneğini temsil eder. Fareyi sağ tıklatarak, 3D konfigürasyonun döndürme ve çevirileri arasında seçim yapın.
  14. Yörünge tamamlandığında, sırayla 'Kaydet' (yörüngeyi silen 'Durdur' değil!), 'Yörünge temizleme' ve 'Yörünge yumuşatma' düğmelerine basın. Yumuşatma için filtre parametrelerini gösteren yeni bir pencere açılır (Şekil 16). Sistemle daha fazla deneyim kazanmadan önce varsayılan değerleri değiştirmeyin. 'Tamam'a basın.
  15. Kayıttan önce iyi bir kamera ayarı (balık ve arka plan arasında iyi kontrast sağlayan) seçmenin (bkz. adım 2.4-2.6) neden bu kadar önemli olduğu şimdiye kadar anlaşılmış olmalı. Veri işlemeye devam edin.

4. Veri İşleme

  1. İlk olarak, balığı kaydetmek için kullanılan klasöre bir göz atın (Şekil 17). Kalibrasyon klasöründen kopyalanan 'Hayvan konteyner verileri' ve 'Yazışma verileri' alt klasörlerini (adım 2.10), balığın kaydı sırasında oluşturulan 'Zaman damgaları' ve 'Ham veriler' alt klasörlerini ve yolun yeniden yapılandırılması sırasında oluşturulan 'Arka plan verileri' ve 'Yörüngeler' alt klasörlerini içerir.
  2. Şekil 17 ayrıca 'Yörüngeler' alt klasörünün üç dosya içerdiğini gösterir. point.smoothed-file, daha fazla veri işleme için kullanılacak dosyadır. Birden fazla balık kaydı olması durumunda (örn. sürü avlama deneyi), her balık için ayrı bir point.smoothed-file oluşturulacaktır.
  3. Şekil 18'de örnek bir point.smoothed-file'ın üst kısmı gösterilmektedir. İlk satır toplam numune veya kare sayısını, ikinci satır kayıt süresini (dakika cinsinden) ve üçüncü satır kameraya göre su kütlesinin merkezinin koordinatlarını (sıra: x, z, y) verir. Bunu, balık için x-, y-, z-koordinatlarını (mm cinsinden) ve bu örneğin süresini (saniye cinsinden) veren her kare için bir satır takip eder.
  4. point.smoothed-files'da sağlanan verileri işlemenin iki yolu vardır: Veri İşleme Modülünü kullanın veya (henüz) Veri İşleme Modülüne dahil edilmemiş hesaplamaları yapmak için Excel veya MATLAB gibi başka bir yazılım kullanın.
  5. Veri İşleme Modülü'nü açın, araç çubuğunda 'Proje'yi seçin, ardından açılır menüden 'Yeni'yi seçin ve ardından deney için bir ad girin. Araç çubuğunda 'Projeyi Düzenle'yi seçin, açılır menüden 'Projeye Ekle'yi seçin, ardından 'Yeni grup'u seçin ve grup için bir ad girin (ör. 'Kontroller'). Şu anda proje ve grup adlarının gerçekten kullanılmadığını, ancak adların doldurulması gerektiğini unutmayın. Oluşturulan klasörler çıktı dosyalarını saklamak için kullanılabilir (bkz. adım 4.10).
  6. Sağ pencerede bir grup seçin (ör. 'Kontroller') (bkz. Şekil 19). Araç çubuğu değişecektir. "Grubu düzenle"yi, ardından açılır menüden "Gruba ekle"yi ve ardından "Yeni ölçümler"i seçin. Bu bir tarayıcı açacaktır. Kayıt sırasında yapılan klasörü açın (adım 2.7), 'yörüngeler' alt klasörünü ve ardından point.smoothed-file'ı seçin. Şekil 19'da sunulan örnekte, Grup-A için altı dosya, Grup-B için dört dosya yüklenmiştir. (Resimli örnekte düzleştirilmiş dosyaların 0 ve 1 uzantılarına sahip olduğunu unutmayın, çünkü bu deneyde iki Japon balığı aynı anda test edilmiştir).
  7. Analiz için, sağ pencerede nokta düzleştirilmiş dosyayı seçin, 'Veri İşleme'yi seçin, açılır menüden 'Tek Uç Noktalar'ı seçin ve örnek olarak 'Süre dondurma'yı seçin (Şekil 20). Hız eşiği ve süre eşiği açısından donmayı belirtmek için bir pencere açılır. Örnekte, balık gözlem süresinin %25,86'sını donma için harcamaktadır.
  8. Kendinizi program içinde tanımak için, Seyahat mesafesi, Derinlik Dağılımı (derinlik seviyelerinin sayısını belirlemenize olanak tanır) ve Seri çekim frekansı gibi diğer örnekleri deneyin.
  9. Örneğin ivmenin z bileşeninin spektral analizi gibi daha gelişmiş hesaplamalar vardır. Bu durumda, 'Zaman serisi özellikleri'ni, ardından 'TD frekans alanı analizi'ni', 'Spektral analiz'i ve 'Z ivme spektrumu'nu seçin. Belirtilen parametre üzerinde Fourier analizi yapılacaktır (açıklama7 için). Menüde görüntülenen tüm seçenekler henüz tam olarak uygulanmamıştır. Örneğin, 'Yol kıvrımı' yalnızca deneysel olarak eklendi.
  10. 'Varsayılan eşiği kullanarak toplu işleme' seçeneği belirlendiğinde, yaklaşık 200 uç nokta hesaplanacaktır. Bu bağlamda, 'varsayılan', sınırlayıcıların ayarlandığı anlamına gelir. Örneğin, şu anda derinlik dağılımı üç derinlik seviyesi için hesaplanmaktadır, açısal dağılım dört bölüm (yani kadranlar) vb. için hesaplanmaktadır. Parametreleri oluşturduktan sonra, oluşturulacak dosyanın konumunu ve adını soran yeni bir pencere açılır. Bunlar CSV formatında kaydedilecek ve daha sonraki işlemler için Excel gibi diğer yazılımlara aktarılabilir.
  11. Kayıt Modülü ve Yörünge Modülünün aksine, Veri İşleme Modülü, araştırmacıların gereksinimlerine daha fazla uyarlanacak olan gelişen bir modüldür.

Sonuçlar

Altı aylık dişi zebra balığı (Danio reriobelirlenmemiş ('kısa yüzgeçli') bir vahşi tip suşuna ait olan zebrafishlar, Aquatica Tropicals, Inc.'den satın alınmıştır. Toplamda 120 zebrafish kullanılmıştır. Deneylere başlanmadan önce, 38 L'lik akvaryumlarda yaklaşık 8 hafta boyunca laboratuvar koşullarına alıştırılmışlardır. Su sıcaklığı, oda sıcaklığına (~23° C). Işık rejimi: 14 saat ışık açık (06:00-20:00), 10 saat ışık kapalı. Zebrafishler günde üç kez beslendi: 08:00'de Tetra tropikal pul yemler; 12:00'de canlı brine shrimp larvaları; 15:00'de Tetra tropikal pul yemler. Deney günlerinde zebrafishler sadece saat 08:00'de pul yemle beslendi. İkinci kayıttan hemen sonra zebrafishler, 300 mg/L trikain metansülfat (MS-222) ile ötanize edildi.

Kontrol grubu için 14 dörtlü (i.e. dört zebrafish'ten oluşan gruplar) (n = 14), MK-801 grubu için ise 16 dörtlü (n = 16) kullanılmıştır. 1 L'lik kaplarda 10 µM MK-801'e 1 saat boyunca maruz bırakıldıktan sonra (saat 9:30'da başlayarak), dörtlüler gözlem kaplarına aktarılmıştır. Kayıt hemen başlatılmış (saat 10:30'da) ve 20 dk sürmüştür. Ardından, zebrafish'ler kaplarda 3,5 saat bırakılmıştır. Bu süre zarfında, bir hava pompasına bağlı bir tüp aracılığıyla havalandırma sağlanmıştır. Saat 14:00'te ikinci bir 20 dk'lık kayıt yapılmıştır. İki kaydın amacı, alışma etkilerini ve/veya ilaçların azalan etkilerini incelemekti (MK-801'in sıçanlardaki yarı ömrü yaklaşık 2 saattir28). Sosyal bağlılığın bir ölçüsü olarak (1) ortalama sosyal mesafeleri (inter-individual mesafeler olarak da adlandırılır11,29), (2) on derinlik seviyesi üzerindeki dikey dağılımı, (3) dört radyal bölge (bölgelerin konumları için Şekil 24A, içteki görsele bakınız) ve kadranlar üzerindeki (kadranların konumları için Şekil 24B, içteki görsele bakınız) yatay dağılımı ve (4) kat edilen mesafenin üç bileşenini (x,y,z) analiz ettik. Veriler sürü başına ortalanmıştır. Shapiro-Wilkins testleri tüm değişkenlerin normal dağılmadığını gösterdikten sonra, kontrol ve MK-801 gruplarının ortalamalarını karşılaştırmak için tüm değişkenlere Mann-Whitney U-testleri uygulanmıştır. Bu karşılaştırmalar sabah ve öğleden sonra oturumları için ayrı ayrı gerçekleştirilmiştir. Dört (değişken grubu) kullanıldığı için (yukarıya bakınız) α = 0,05/4 = 0,0125 olarak alınmıştır.

Şekil 2A kontrol grubundaki zebra balıkları için tipik bir örnek kareyi, Şekil 2B ise sabah oturumu sırasında kaydedilen MK-801 ile işlem görmüş zebra balıkları için tipik bir örnek kareyi göstermektedir. Kontrol grubundaki zebra balıklarının tabana yakın, ön duvara yakın (yani kameraya en yakın taraf) oldukları ve birbirlerine yakın durdukları (yani sosyal kohezyonun yüksek olduğu) görülmektedir. Buna karşılık, MK-801 ile işlem görmüş zebra balıkları üst kısma yakındı, yatay düzlemde herhangi bir tercih göstermediler ve birbirlerinden önemli ölçüde uzak yüzdüler (yani sosyal kohezyon düşüktü). Şekil 21 temsili yörüngeleri göstermektedir. Kontrol grubundaki zebra balıkları, gözlem kabının ön tarafında kalmaya yönelik belirgin bir eğilim göstermiştir. Ayrıca, zamanın çoğunda tabana yakın kalmışlardır. Öte yandan, MK801 ile işlem görmüş zebra balıkları yatay düzlemin her yerinde yüzmüşlerdir. Ancak, saat 10:30'da üst derinlik seviyelerine yönelik belirgin bir tercih göstermişlerdir. Saat 14:00'te dikey dağılımları daha homojen hale gelmiştir.

Verilerin nicel analizi, tanımlamamızı doğrulamıştır. Şekil 22A ortalama sosyal mesafenin ... olduğunu göstermektediryani (dörtlü gruplardaki dört zebrafish arasındaki ortalama bireyler arası mesafeler), sabah saatlerinde (10:30'da) MK-801 uygulanan zebrafishler için kontrol grubu zebrafishlere kıyasla üç kattan daha fazlaydı (U = 0 ve p)<0,00001. 3,5 saatlik alışma sürecinden sonra (saat 14:00'te), kontrol grubu zebra balıklarında sosyal mesafe artarken, MK-801 uygulanan zebra balıklarında bu mesafe aşağı yukarı aynı kalmıştır. Bununla birlikte, her iki grup için de anlamlı düzeyde farklı kalmaya devam etmiştir (U = 19, p<0.0005) Şekil 22B iki deney grubu için hem 10:30 hem de 14:00 saatleri için sosyal mesafe zaman çizelgelerini göstermektedir.

Dikey dağılım her iki grup için de oldukça farklıydı. Şekil 23, hem sabah (10:30) hem de öğleden sonra (14:00) kontrol grubu zebra balıklarının zamanlarının çoğunu en düşük iki ila üç derinlik seviyesinde (yani gözlem kabının tabanına en yakın seviyelerde) geçirdiklerini göstermektedir. Öte yandan, MK-801 uygulanan zebra balıkları, saat 10:30'da zamanlarının çoğunu su yüzeyine yakın şekilde yüzerek geçirmişlerdir (Şekil 23A). 3.5 saatlik alışma sürecinin ardından, saat 14:00'te tüm derinlik seviyelerine aşağı yukarı eşit şekilde dağılmışlardır.

Yatay dağılım da her iki deney grubu için oldukça farklıydı. Şekil 24A MK-801 uygulanan zebra balıklarının, kontrol grubundaki zebra balıklarına kıyasla dış bölgede daha az, orta ve merkez bölgelerde ise daha fazla zaman geçirdiğini görüyoruz. Gruplar arasındaki farklar, kadranlar açısından değerlendirildiğinde daha da belirgindi (Şekil 24B). Kontrol zebra balıkları, ön iki kadrana (1 ve 4) çok güçlü bir tercih göstermiştir, yanikapın kameraya en yakın olan tarafı. Öte yandan, MK-801 uygulanan zebra balıkları dört kadran arasında aşağı yukarı eşit şekilde dağılmıştır.

Kinematik parametreler açısından, buradaki tartışmayı kat edilen mesafe ile sınırlandırıyoruz (Şekil 25). MK-801 uygulanan zebrafishler, kontrol grubu zebrafishlerden daha fazla hareket etmiştir. İlginç bir şekilde, bu fark özellikle kat edilen mesafenin y-bileşeni için anlamlıydı. Bu, kameranın yönüdür (bkz. Şekil 1). Nitekim, kontrol grubu zebrafishler zamanlarının çoğunu 1. ve 4. kadranlardaki ön duvara yakın bölgelerde geçirmişlerdir (Şekil 24A ve 24B'de görülebileceği üzere). Öte yandan, MK-801 uygulanan zebrafishler, kabın ön ve arka yarıları arasında ileri geri hareket etmişlerdir.

Burada, deney tarafından sağlanan verileri analiz etmenin olası yollarından yalnızca bir örneğini sunduk. Bu noktada, sonuçlara herhangi bir spesifik biyolojik yorum eklemekten kaçınıyoruz. Bununla birlikte, MK-801'in sıçanlarda sosyal geri çekilmeyi indüklediği30 ve sosyal araştırma davranışlarını azalttığı31 saptanmış olup, şizofreninin negatif semptomları için bir model olarak çalışılmıştır30. Ayrıca memelilerde hiperaktiviteye31, dönme davranışına32, duyusal bozulmaya33 ve azalmış prepuls inhibisyonuna34 neden olmuştur. Bu bozulmaları özel olarak test etmemiş olsak da, bulgularımız bunlarla tutarlı görünmektedir. Zebrafish'lerdeki MK-801 etkilerinin memelilerde tanımlananlarla karşılaştırılabilir olup olmadığını belirlemek için daha spesifik deneysel düzenekler gereklidir. Kaygı, solunum problemleri, mekansal oryantasyon bozukluğu, dikkat eksikliği, stereotipi vb. faktörlerin zebrafish'lerde MK-801 tarafından indüklenen değişmiş davranışlarda önemli roller oynayıp oynamadığını belirlemek için daha ileri analizler ve deneyler de gerekli olacaktır.

Kamera, bilgisayar, küp ve aynadan oluşan optik ölçüm düzeneği şeması; fotonik çalışması.
Şekil 1. Düzenek şematik diyagramı. Kamera, gözlem tankının hem ön hem de üst görünümünü gösteren kareler (yani sabit görüntüler) yakalar. Kareler, daha sonraki işlemler için bilgisayarda saklanır. Zebrafish'lerin hareketlerinin ve konumlarının 3D özelliklerini tanımlamak için önemli olan xyz boyutlarının konumlarına dikkat ediniz. Şekildeki iki gölgeli duvar (ve tankın altı), deneyimizde (Temsili Sonuçlara bakınız) beyaza boyanmışken, diğer iki duvar şeffaftı. Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Balık tankı davranış deneyi, balık dağılımıyla iki tank, davranışsal çalışma düzeneği.
Şekil 2. Örnek kareler. Sadece ön veya üst görünümlerin bilgi kaybıyla karakterize edildiğine dikkat edin. Bu durum, özellikle panel B'de belirgindir; burada soldaki üç zebrafish ön görünüme bakıldığında birbirine yakın görünürken, üst görünüm bunun doğru olmadığını göstermektedir. Öte yandan, üst görünüm tabandan olan mesafeye dair herhangi bir bilgi vermez. A) Kontrol zebrafish. B) 10 µM MK-801 ile tedavi edilmiş zebrafish. Arka plan renginin (mavi), kayıt yazılımı tarafından oluşturulduğuna ve iyi bir kontrast elde etmek için seçildiğine dikkat edin. Arka ve sağdaki duvarların ve tabanın gerçek rengi beyazdı. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Sucul hayvan davranış izleme sistemi; video analiz düzeneği; kalibrasyon paneli; izleme süreci.
Şekil 3. Yan aynanın hizalanması. Soldaki beyaz ok, yan aynadaki ön duvarı (kameraya en yakın olanı) göstermektedir. Eğer iki çizgi görünüyorsa, yalnızca tek bir çizgi görünene kadar yan aynanın konumunu düzeltin (adım 1.2). Kalibrasyon panelindeki 5 LED, her üç görünümde de net bir şekilde görülmektedir. Haznedeki ışıklar açık olduğu için LED panelinde birçok başka yansımanın görüldüğüne dikkat edin (adım 1.4). Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Parçacık tespit süreci, kırmızı ile işaretlenmiş kutular, optik analiz diyagramı, düşük ışık koşulları.
Şekil 4. LED'lerin etiketlenmesi. Sol panel, kalibrasyon prosedürü ile belirlenen beş etiketin (0-4 arası numaralandırılmış) gerçek LED'lerle örtüşmediğini göstermektedir. LED'lerin yanı sıra diğer ışık noktaları (aslında yansımalar) görülebilmektedir. Sağ panelde, yalnızca LED'lerin görünür olması için kazanç ve perde süresi azaltılmıştır. Artık beş etiket doğru şekilde atanmıştır (adım 1.7-1.10'da açıklandığı gibi). Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Kamera kontrolü ve kalibrasyon kurulumunu gösteren sucul hayvan davranış takip yazılımı arayüzü.
Şekil 5. Kap bilgilerini toplayın. Seçilecek altı noktanın (fareyle sağ tıklanarak) sırası sunulmuştur. Çizgiler otomatik olarak çizilecektir. Buradaki numaraların ekranda görünmediğine dikkat edin. İşlem tamamlandığında, 'Collect container info' düğmesine basın (adım 1.12'de açıklandığı gibi). Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Hidrodinamik deney diyagramı; akışkanlar dinamiği ve kaldırma tankı düzeneği; açıklamalı bileşenler.
Şekil 6. Hacim toplama. Su kütlesinin köşelerini belirten işaretli konumlarda fareyle sağ tıklayın: önce ön görünümdeki köşeyi, ardından üst görünümdeki köşeyi işaretleyin. Sonra bir sonraki köşeye geçin (1-8 arası). Sekiz noktanın tankın değil, su kütlesinin dış hatlarını belirlediğine dikkat edin. Ayrıca, fareyle sağ tıkladığınızda yalnızca 'x0' ifadesinin göründüğünü ve bir sonraki noktaya tıklandığında bu ifadenin tekrar kaybolacağını unutmayın (bu nedenle 1-8 arası sayılar ekranda gerçekte görünmez). Prosedür adım 1.17'de açıklanmıştır. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Kamera kontrolü ile su tankındaki hayvan hareketlerini izleyen sucul hayvan davranış takip düzeneği.
Şekil 7. Düzeltilmemiş kontrast. Görüntü aşırı pozlanmıştır ve balık ile arka plan arasındaki kontrast (özellikle ön görünümde) düşüktür. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Statik denge çalışmasında kullanılan balıklarla su düzenek kurulumu; akışkanlar dinamiği deneyi.

Şekil 8. Düzeltilmiş kontrast. Kontrast, Şekil 7 ile karşılaştırıldığında iyileştirilmiştir. Ekrandaki renklerin yalancı renkler olduğuna dikkat ediniz. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Bumblebee2 BB2-03S2C için parlaklık, pozlama ve doygunluk ayarlarını gösteren kamera ayarları arayüzü.
Şekil 9. Genel Ayarlar. Ana menüden 'Camera control' seçildiğinde, 'General Settings' penceresi açılır. 'Shutter' ve 'Gain' kutucuklarının seçimini kaldırın ve balık ile arka plan arasındaki en iyi kontrastı bulmak için sürgüleri kullanın. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Kamera beyaz dengesi ayarı GUI; kırmızı/mavi sürgüler; görüntü işleme optimizasyonu.
Şekil 10. Renk ayarları. 'White Balance/Color' penceresinde 'Auto' kutusundaki seçimi kaldırın ve balık ile arka plan arasında iyi bir kontrast elde etmek için en uygun kombinasyonu bulmak üzere 'Red' ve 'Blue' sürgülerini kullanın. Parametreler. Trajectory Module açıldıktan sonra, 'Data location' ile deneysel dosyayı seçin ve ardından 'System Setup' ile 'Parameters' penceresini açın. Parametrelere burada uygun başlangıç değerleri atanmıştır. Daha büyük görüntüye bakmak için buraya tıklayın.

Sucul hayvan davranış izleme yazılımı arayüzü; kalibrasyon parametreleri; video analiz kurulumu.
Şekil 11. Parametreler. Trajectory Module açıldıktan sonra, ‘Data location’ ile deneysel dosya seçilir ve ardından ‘System Setup’ ile ‘Parameters’ penceresi açılır. Burada parametreler için uygun başlangıç değerleri atanmıştır. .Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Sucul davranış takip düzeneği, 3D sistem kalibrasyonu, yazılım arayüzü, yörünge analizi.
Şekil 12. Kutu hizalaması. Üst ve ön görünüm için kırmızı kutuların, balıkların bulunabileceği alanları nasıl tanımladığına dikkat edin. Soldaki kutu, bu alanı aramadan hariç tutmak için bir çizgiye indirgenmiştir. Daha büyük görüntüyü görüntülemek için buraya tıklayın.

Davranış analizi için kalibrasyon ve izleme kurulumunu gösteren sucul hayvan takip yazılımı arayüzü.

Şekil 13. Etiket atamaları. 'Start generating trajectories' düğmesine basılıp başlangıç karesi (normalde 0. kare) seçildikten sonra 'Tag assignments' penceresi açılır. Etiket ('X0') ekranda görünene kadar 'Step forward' düğmesine basın. Etiket balık görüntüsü üzerine yerleşmemişse, doğru yerleşene kadar 'No' düğmesine basın. Ardından 'Go' düğmesine basın. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Kuvvet vektörü ve stres konsantrasyonu ile dinamik analiz diyagramı; A ve B olarak etiketlenmiş bileşenler.
Şekil 14. Bilgi ekranı. Panel (A) doğru etiket atamasını göstermektedir. Etiket ('X0'), her iki görünümdeki balık görüntüsünün üzerine yerleştirilmiştir. Genellikle etiket üzerinden bir çizgi geçer. Panel (B) aşırı gürültüyü ve etiket atamasının yokluğunu göstermektedir. Kareler, aynı kayıttan, renk ve boyut eşikleri (adım 2.2'de) sırasıyla 1.000-50 ve 10-5 olarak değiştirilerek elde edilmiştir. Büyük resme bakmak için buraya tıklayın.

3B yörünge analizi, Kartezyen koordinatlarda parçacık hareketini gösteren vektör diyagramı.
Şekil 15. Yeniden oluşturulan yolun üç boyutlu gösterimi. Okların başlangıç noktası, yönlendirme amacıyla tankın sol ön köşesine yerleştirilmiştir (ayrıca bkz. Şekil 1). Bu nedenle, bu örnekte balık sol duvara (kameraya göre) yakın durmaktadır. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Yörünge düzeltme parametre ayarları penceresi; filtre ayarları: gürültü eşikleri, pencere boyutu.
Şekil 16. Yörünge düzeltme. Bu pencere, 'Trajectory smoothing' butonuna basıldıktan sonra açılır. Şimdilik 'OK' butonuna basarak varsayılan değeri kabul edin. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

"fish1" klasöründen "Trajectories" alt klasörüne veri aktarımını gösteren dosya organizasyon diyagramı.
Şekil 17. Alt klasörler. Kayıt sırasında oluşturulan klasör yukarıda gösterilmiştir. Yol yeniden yapılandırmasından sonra belirtilen altı alt klasörü içerir. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

İstatistiki analiz için metin formatındaki sayısal veriler.
Şekil 18. Düzeltilmiş dosya. Örnek bir point.smoothed-file dosyasının üst kısmı; kare sayısı, kayıt süresi (dakika cinsinden), su kütlesinin merkezinin kameraya göre koordinatları ve her bir kare için koordinatlar ile süreyi göstermektedir. Görüntüyü büyütmek için buraya tıklayın.

Yörünge verilerini analiz etmek için veri işleme yazılımı arayüzü; proje kurulumu ve grup atamaları.
Şekil 19. Veri işleme. Analiz edilecek dosyaların seçilmesi (sağ pencere). Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Yörünge değerlendirmesi için donma analizi kurulumunu görüntüleyen ABMT 3D veri işleme arayüzü.
Şekil 20. Örnek analiz. İlgilenilen uç noktalar, menüden seçilerek hesaplanabilir. Bu örnekte 'Duration Freezing' (Donma Süresi) seçilmiştir. Program, donmayı tanımlayan hız ve süre eşik değerlerinin girilmesini ister. Sonuç, kaydın toplam süresinin yüzdesi olarak ifade edilir. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Lokomosyon analiz diyagramı, kontrol ve MK-801 farelerinde zaman aralıkları boyunca izleme yolları.
Şekil 21. Temsili yörüngeler. Kontrol zebrafishler için iki temsili yörünge ve 10 µM MK-801 ile tedavi edilen zebrafishler için iki temsili yörünge, 10:30'da başlayan sabah oturumu (üst sıra) ve 14:00'te başlayan öğleden sonra oturumu (alt sıra) için sunulmuştur. Her dörtlü grup içindeki bireysel zebrafishlerin yörüngeleri farklı renklerle gösterilmiştir. Ancak, etiket değişimlerinin gerçekleşmiş olabileceği unutulmamalıdır. Bireysel hatların takip edilmesi kritikse manuel düzeltme gereklidir. Betimlenen kabın sol ön tarafı (ek okların başlangıç noktası), kameraya en yakın olan taraftır (tank yerleşimi için Şekil 1'e bakınız). Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Sosyal mesafe analizi; grafik; kontrol ve MK-801 etkisi; karşılaştırmalı oturum sonuçları; zaman serileri.
Şekil 22. Balıklar arasındaki ortalama sosyal mesafe. A) Kontrol zebrafishler ve 10 µM MK-801 ile işlem görmüş zebrafishler için sabah ve öğleden sonra oturumlarına ait ortalama sosyal mesafeler sunulmuştur. Ortalama ve S.E.M. verilmiştir. ***, p<0.001. B) Her iki grup için ortalama bireyler arası mesafelerin zaman çizelgeleri sunulmuştur. Daha büyük görüntüye bakmak için buraya tıklayın.

Derinlik analizi; çok değişkenli grafik; kontrol ile MK-801 karşılaştırması; yüzde zaman ile derinlik seviyeleri.
Şekil 23. Derinlik dağılımı. A) Sabah oturumu için zebra balığının on eşit derinlik seviyesindeki (seviye 1 tabana en yakın seviyedir) dağılımı. B) Öğleden sonra oturumu için zebra balığının dağılımı. Ortalama ve S.E.M. sunulmuştur. *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Radial zone and quadrant time proportion graph; data analysis; psychological experiment results.
Şekil 24. Yatay dağılımlar. (ADeney gruplarının dört radyal bölge üzerindeki zamansal dağılımı sunulmuştur. İç resim, bölgelerin merkezden çevreye doğru konumlarını göstermektedir: merkez, orta, dış ve kombine-köşe bölgeleri.BDeneysel grupların dört kadran üzerindeki zamansal dağılımı sunulmuştur. İç ek, kadranların konumunu göstermektedir. Çift çizgilerle belirtilen duvarlar beyaz duvarları, tek çizgilerle belirtilenler ise şeffaf duvarları temsil etmektedir. Kamera, iç ekin solunda yer almaktadır. yani1. ve 4. kadranlara en yakın (bkz. ayrıca Şekil 1). Ortalama ve S.E.M. verilmiştir. Siyah yıldızlar sabah oturumu için gruplar arası karşılaştırmaları, gri yıldızlar ise öğleden sonra oturumları için olanları belirtir: *, p<0,0125; **, p<0,005; ***, p<0.001. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Statik denge grafiği; kat edilen mesafe vs. koordinatlar; kontrol vs. MK-801; veri analizi.
Şekil 25. Kat edilen mesafe. Zebrafish'lerin sabah ve öğleden sonraki oturumlardaki kat edilen mesafelerinin xyz-bileşenleri gösterilmiştir. Ortalama ve S.E.M. sunulmuştur. Siyah yıldızlar sabah oturumu için gruplar arası karşılaştırmaları, gri yıldızlar ise öğleden sonraki oturumlar için karşılaştırmaları belirtir: *, p<0.0125; ***, p<0.001. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Tartışma

Burada gösterilen deneysel prosedür, tek tek zebra balığının, zebra balığı çiftlerinin (örneğin çiftleşme veya saldırganlığı incelemek için) ve zebra balığı sürülerinin (temsili örnekte gösterildiği gibi) kaydedilmesine izin verir. Sistem özellikle 3D (dikey ve yatay) dağılım, kinematik özellikler (örn. hız, ivme, dönüş açısı) ve sosyal parametreler (örn. sosyal uyum) hakkında aynı anda bilgi elde etmek için uygundur. Aşağıda, deneyleri planlarken göz önünde bulundurulması gereken birkaç önemli konuyu listeliyoruz.

Deneysel prosedüre bağlı olarak, farklı davranış sistemleri incelenebilir. Örneğin, neofobiyi (yani yeni ortamlar için korku) keşfetmek için, zebra balığını gözlem tankına soktuktan hemen sonra (gürültüyü azaltmak için suyun çökmesi için sadece birkaç saniye bekledikten sonra), önceden alışkanlık olmadan kayıt başlatılmalıdır11,17,37. Öte yandan, bazı araştırma konuları, örneğin alarm feromonlarının etkilerini incelerken zebra balığının iyi alışmasını gerektirebilir16. Zebra balığı gruplarını incelerken, deneyci, yazılımın etiketlerin değiştirilmesini en aza indirmesine rağmen, şu anda tek tek zebra balıklarını baştan sona takip etmenin mümkün olmadığının farkında olmalıdır. Bu, sosyal uyumun vurgulandığı sığlık çalışmaları için de önemli değildir, ancak saldırganlık veya çiftleşmeyi araştırırken çok önemli olacaktır. Etiketlerin manuel olarak yeniden atanması bir seçenektir, ancak çok zaman alabilir.

Gözlem kabının ve gözlem odasının duvarlarının rengi, zebra balığının davranışı üzerinde büyük etkiye sahip olabilir. Örneğin, beyaz duvarların tiksinti tepkilerini tetiklediği tanımlanmıştır36, 37. Farklı renkleri denerken iki şeyi aklınızda bulundurun: 1) ön duvarın (yani kameraya en yakın duvarın) şeffaf kalması ve bir kapağın (kullanılıyorsa) da şeffaf olması önemlidir; 2) Daha önce hiç kullanılmamış bir renk seçerken, önce zebra balığı ile arka plan arasındaki kontrastın kayıt için uygun olup olmadığını belirleyin. Bir test çalıştırması yapın. Kayıt için kamera ayarlarının (2.5 ve 2.6. adımlarda açıklandığı gibi Kazanç, Deklanşör, Kırmızı ve Mavi) ve yörünge yeniden yapılandırma ayarlarının (örn. 3.3, 3.5, 3.11 ve 3.12. adımlarda açıklandığı gibi renk ve boyut eşikleri) değiştirilmesi büyük bir fark yaratabilir. Yine, sistemle ilgili deneyim, neyin mümkün olduğuna karar vermek için uzun bir yol kat edecektir.

Deneyin amacına bağlı olarak, farklı özelliklere (örn. spektrum, yoğunluk) sahip bir ışık kaynağı istenebilir. LED çubuklar kolayca değiştirilebilir. Işığın kabın her yerine ulaştığından emin olun.

Deney, zebra balığının gözlem kabında birkaç saat kalmasını gerektiriyorsa, havalandırma sağladığınızdan emin olun. Bir klips kullanılarak sağ arka köşeye bir hava tüpü takılabilir. Bilgisayar ekranında klibin kaydı engellemediğini kontrol edin, yani. zebra balığının hiçbir zaman gözden gizlenmediğini. Şekil 2A ve 2B'de siyah klips üstten görünümde görülebilir. İdeal olarak, gürültüyü önlemek için kayıtlardan önce veya kayıtlar arasında havalandırma sağlanmalı, ancak kayıt sırasında havalandırma sağlanmamalıdır. Ayrıca, güçlü havalandırmayı açıp kapatmanın zebra balığını ürkütebileceğini unutmayın.

Deney, zebra balığının gece boyunca kapta tutulmasını gerektiriyorsa, zebra balığının dışarı sıçramasını önlemek için gözlem odasını şeffaf bir kapakla kapatmakta fayda vardır (ki bu çok yaygın bir durumdur). Kayıttan önce kapak çıkarılmazsa (zebra balığını rahatsız etmemek için), aşağıdaki iki noktayı göz önünde bulundurun: 1) ışık kaynaklarının ayna görüntülerinin kaydı engellemediğinden emin olun (örneğin, ışık kaynaklarını kaydırarak veya ışığı yalnızca minimum düzeyde yansıtan bir kapak seçerek); 2) gece boyunca kullanıldığında kapağın buğulanabileceğini göz önünde bulundurun, özellikle bu durumda havalandırmanın da sağlanması gerektiğinden; Bunu azaltmanın bir yolu, içinde küçük delikler olan bir kapak seçmektir.

Bazı deneyler için, bir ilacı uygulamadan önce zebra balığının temel davranışını belirlemek gerekli olabilir. Bu durumda, ilaç seanslar arasında bir tüp yoluyla eklenebilir (yukarıda tartışılan havalandırma tüpüne benzer).

Burada odak noktası zebra balığı (Danio rerio) kaydı olsa da, diğer balık türleri de elbette sistemle kaydedilebilir. (Genç) Japon balığı (Carassius auratus), kaplan dikeni (Barbus tetrazona) ve yeşil kılıçkuyruk (Xiphophorus helleri) davranışlarını incelemek için kullanılmıştır.

Son olarak, gözlem tanklarının diğer boyutlarının da prensip olarak mümkün olduğunu belirtmek gerekir. Ancak, çok daha büyük gözlem kapları kullanıldığında sistemin yeniden yapılandırılmasını ve uzamsal ve zamansal çözünürlük arasında iyi bir denge bulunmasını gerektirecektir. Ayrıca, kabın şekli küboid olmalıdır. Zebra balığı veya diğer deneysel deneklerin sayısı teorik olarak sınırsızdır; ancak etiket değişimi denek sayısı arttıkça artar.

Açıklamalar

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu ve Wei Weng, bu makalede kullanılan izleme sistemini üreten xyZfish, Ronkonkoma NY'nin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Yazarların hiçbir teşekkürü yok.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AABT-3D İzleme DonanımıxyZfishAABT IIKamera, ekran kartı, aynalı ve aydınlatmalı gözlem bölmesi içerir
AABT-3D Kalibrasyon ekipmanıxyZfishcalibKalibrasyon paneli ve yan ayna içerir
AABT-3D Gözlem kaplarıxyZfishküpleri 
AABT-3D İzleme yazılımıxyZfishv.1.0 
Bilgisayaristeğe bağlıYokWindows XP veya üstü
(+) - MK-801 hidrojen maleatSigmaM107 
Hava pompasıFusion500 
Hava hattı borusu 3/16"Lee' s Akvaryum ve Evcil Hayvan Ürünleri14508 
Orta Bağlayıcı KlipslerOfficeDepot561339Havayolunu gözlem kabına bağlamak için

Kaynaklar

  1. Brennan, C. H. Zebrafish behavioural assays of translational relevance for the study of psychiatric disease. Rev. Neurosci. 22, 37-48 (2011).
  2. Kabashi, E., Brustein, E., Champagne, N., Drapeau, P. Zebrafish models for the functional genomics of neurogenetic disorders. Biochim. Biophys. Acta. 1812, 335-345 (2011).
  3. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth. Defects. Res. C. Embryo Today. 93, 67-114 (2011).
  4. Kurta, A., Palestis, B. Effects of ethanol on the shoaling behavior of zebrafish (Danio rerio). Dose-Response. 8, 527-533 (2010).
  5. Sison, M., Gerlai, R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 220, 331-337 (2011).
  6. Delcourt, J., Denoël, M., Ylieff, M., Poncin, P. Video multitracking of fish behaviour: a synthesis and future perspectives. Fish Fish. 14, 186-204 (2013).
  7. Zhu, L., Weng, W. Catadioptric stereo-vision system for the real-time monitoring of 3D behavior in aquatic animals. Physiol. Behav. 91, 106-119 (2007).
  8. System for 3D monitoring and analysis of motion behavior of targets. US patent. , 8306260 (2012).
  9. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6, e17597(2011).
  10. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: a 3-D approach. Behav. Brain Res. 234, 365-374 (2012).
  11. Maaswinkel, H., Le, X., He, L., Zhu, L., Weng, W. Dissociating the effects of habituation, black walls, buspirone and ethanol on anxiety-like behavioral responses in shoaling zebrafish. A 3D approach to social behavior. Pharmacol. Biochem. Behav. 108, 16-27 (2013).
  12. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The advantages of a 3D-automatic recording system for the study of shoaling behavior in zebrafish. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  13. Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. An automatic recording system to quantify antagonistic interactions between zebrafish. Abstract. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).
  14. Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 83, 13-34 (2008).
  15. Krause, J., Hartmann, N., Pritchard, V. L. The influence of nutritional state on shoal choice in zebrafish, Danio rerio. Anim. Behav. 57, 771-775 (1999).
  16. Speedie, N., Gerlai, R. Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 188, 168-177 (2008).
  17. Gebauer, D. L., Pagnussat, N., Piato, A. L., Schaeffer, I. C., Bonan, C. D., Lara, D. R. Effects of anxiolytics in zebrafish: similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and. 99, 480-486 (2011).
  18. Paull, G. C., Filby, A. L., Giddins, H. G., Coe, T. S., Hamilton, P. B., Tyler, C. R. Dominance hierarchies in zebrafish (Danio rerio) and their relationship with reproductive success. Zebrafish. 7, 109-117 (2010).
  19. Engeszer, R. E., Ryan, M. J., Parichy, D. M. Learned social preference in zebrafish. Curr. Biol. 14, 881-884 (2004).
  20. Mathur, P., Guo, S. Use of zebrafish as a model to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes. Neurobiol. Dis. 40, 66-72 (2010).
  21. Tropepe, V., Sive, H. L. Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism. Genes Brain Behav. 2, 268-281 (2003).
  22. Echevarria, D. J., Hammack, C. M., Pratt, D. W., Hosemann, J. D. A novel behavioral test battery to assess global drug effects using zebrafish. Int. J. Comp. Psychol. 21, 19-34 (2008).
  23. Seibt, K. J., Piato, A. L., Luz Oliveira, da, Capiotti, R., Vianna, K. M., R, M., Bonan, C. D. Antipsychotic drugs reverse MK-801 induced cognitive and social interaction deficits in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain. Res. 224, 135-139 (2011).
  24. Zou, H., et al. Low dose MK-801 reduces social investigation in mice. Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 753-757 (2008).
  25. Ng, M. C., Hsu, C. P., Wu, Y. J., Wu, S. Y., Yang, Y. L., Lu, K. T. Effect of MK-801-induced impairment of inhibitory avoidance learning in zebrafish via inactivation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in telencephalon. Fish Physiol. Biochem. 38, 1099-1106 (2012).
  26. Sison, M., Gerlai, R. Associative learning performance is impaired in zebrafish (Danio rerio) by the NMDA-R antagonist MK-801. Neurobiol. Learn. Mem. 96, 230-237 (2011).
  27. Swain, H. A., Sigstad, C., Scalzo, F. M. Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio). Neurotox. Teratol. 26, 725-729 (2004).
  28. Vezzani, A., et al. Kinetics of MK-801 and its effect on quinolinic acid-induced seizures and neurotoxicity in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 249, 278-283 (1989).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. J. Neurosci. Methods. 210, 266-271 (2012).
  30. Rung, J. P., Carlsson, A., Rydén Markinhuhta, K., Carlsson, M. L. (+)-MK-801 induced social withdrawal in rats; a model for negative symptoms of schizophrenia. Prog. Neuro-psychopharmacol. Biol. Psych. 29, 827-832 (2005).
  31. Gururajan, A., Taylor, D. A., Malone, D. T. Cannabidiol and clozapine reverse MK-801-induced deficits in social interaction and hyperactivity in Sprague-Dawley rats. J. Psychopharmacol. 226, 1317-1332 (2012).
  32. Burket, J. A., Cannon, W. R., Jacome, L. F., Deutsch, S. I. MK-801, a noncompetitive NMDA receptor antagonist, elicits circling behavior in the genetically inbred Balb/c mouse strain. Brain Res. Bull. 83, 337-339 (2010).
  33. Saunders, J. A., Gandal, M. J., Roberts, T. P., Siegel, S. J. NMDA antagonist MK801 recreates auditory electrophysiology disruption present in autism and other neurodevelopmental disorders. Behav. Brain Res. 234, 233-237 (2012).
  34. Brosda, J., et al. Pharmacological and parametrical investigation of prepulse inhibition of startle and prepulse elicited reactions in Wistar rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 99, 22-28 (2011).
  35. Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behav. Brain Res. 208, 450-457 (2010).
  36. Maximino, C., et al. Parametric analyses of anxiety in zebrafish scototaxis. Behav. Brain Res. 210, 1-7 (2010).
  37. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, e36931(2012).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B Takip SistemiZebrafish Davran AnaliziOtomatik Video TakibiKinematik Parametre AnaliziSosyal Kohezyon l mK r lma D zeltme KalibrasyonuY r nge Yeniden Olu turma Yaz l mVeri leme Mod lDikey Yatay Da l mBireyler Aras Mesafe

İlgili makaleler