Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Summary

Faj gösterimi, bir ilgi hareketsiz molekülü ile etkileşen proteinleri ya da protein parçaları yakalamak için güçlü bir tekniktir. Oluşturmak için faj cDNA kütüphanesi türüne ve ekranın bir karar yapıldıktan sonra, burada açıklanan protokol interactors tanımlanmasına yol açan verimli benzeşim seçimine izin verir.

Abstract

Hareketsiz yem moleküllerine yönde klonlanmış bir cDNA kütüphanesi ile kodlanan çeşitli protein kısımlarını sunmak için bir iskele olarak yeniden birleştirici faj kullanılarak etkileşimleri keşfetmek için etkili bir araçtır. Bu teknik, büyük ölçüde, protein-protein etkileşimleri keşfetmek için kullanılmıştır ama meydan için yem molekül proteinleri ile sınırlı olmak zorunda değildir. Burada sunulan protokol yemler mütevazı bir dizi aynı protein sunum bağımsız klonların belirlenmesini maksimize etmek için tekrardan ekranlı izin vermek için optimize edilmiştir. Bu tespit etkileşen proteinlerin yem molekülün yasal Uygulayıcılar olduğu daha büyük bir güven izin verir. Her afinite seçimden sonra faj titresi İzleme yuvarlak yakınlık seçme negatif kontrollerin etkinliği yanı sıra nasıl ilerlediğini bilgi sağlar. Bir faj titering ve nasıl anlamına gelir ve ne bu süreç verimli olarak ilerleme sağlamak için önceden hazırlamakMümkün olduğunda, sunulmuştur. Bağımsız plak izolasyonu aşağıdaki alınan amplikonların Özellikler afinite seçimi ilerlemiştir ne kadar iyi belirlemek için kullanılabileceğini vurgulanır. Sorun yanlış pozitif veya en aza indirmek için ısrarla fajının geri atlamak için çekim teknikleri açıklanmıştır. Viral bulaşma nöbetini azaltılması araçlar tartışılmıştır.

Introduction

Neden bunun yerine diğer moleküllerle protein etkileşimleri keşfetmek ve araştırmak için kullanılabilir sayısız diğer tekniklerin faj ekran ve afinite seçimi kullanmak? Faj görüntüleme dahil olmak üzere şu protein-ligand etkileşimleri ^1-3 saptanmasında diğer yöntemlere göre bazı benzersiz avantajlar iddia edemez:

Yem moleküllerin çok geniş repertuarı

Önde gelen nedeni yakınlık seçimi ⁴ yem olarak etki edebilme yeteneğine sahip moleküllerin çeşitliliği bulunmaktadır. Faj gösterimi, bir polimer / molekül, elde edilebilir bir desteğe bağlı olabilir Esasen, bu faj gösterilen proteinlerle yakınlı....

Protocol

B) saflaştırılmış bir rekombinant yem, A) bir faj görüntüleme cDNA yem için afiniteye sahip proteinleri kodlayan muhtemel kütüphane ve (Şekil 1), aşağıda tarif edilen prosedüre gösteren bir grafik temsildir bir faj görüntüleme kitaplığı kullanılarak yakınlık seçimi için iki temel bileşeni vurgulamaktadır protein. Yem (rekombinant protein) üretimi yaygın incelenmiş ve literatür E. çözünebilen aktif rekombinant proteinin sağlanması için en iyi uygulamaları özetleyen coli ^12-13, ökaryot maya ^14, böcek ^15-16, bitki ^{17-18, 19-20} veya memeli hücreleri boldur.

Aşağıda....

Results

(Metabolik yem zehirlenmesi) Faj gösterimli proteinleri ile etkileşim için yem kapasitesini olumsuz yönde mümkün olan bu tekniği için güçlü bir negatif kontrol sağlamaktadır. Bu, yem, iyi mikrotiter plakaya bağlandığı zaman, kendi işlevini korur olmadığını belirlemek de tavsiye edilir. Bu kontrollerin Hem nonpoisoned yem tarafından kurtarıldı etkileşim, faj görüntülenen proteinler meşru olduğunu güveni artacaktır.

Her bir kuyudan üç triplicates örnekleme afinite seçiminde bir rol oynar zaman.......

Discussion

Üç çoğaltılmış kuyularda deneyi çalıştırarak, yem bağlanma aynı proteinin, bağımsız bir şekilde edinilen faj aynı klon elde edilmiş olan CDS bölgenin nükleotid dizisi içinde (yani, hiç bir fark ancak bu olması bile ayırt edilebilir ) bağımsız kuyulardan alınan. Aksi takdirde, yem bağlanmasının, aynı proteini kodlayan faj arasında ayırt etmek için tek yoldur bunlar bağımsız bir şekilde, söz konusu nükleotid dizinin bir bölümünde farklı bölgeleri ters transkribe ise.

Seçilen faj afini.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tripton	Becton Dickinson Co.
Maya Özü	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Sodyum Klorür	Fisher Scientific	BP358-10
Agaroz	Araştırma Ürünleri Uluslararası	A20090
Bloke Reaktif	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Sodyum Hidroksit	Fisher Scientific	BP359-212
Sodyum Dodesil Sülfat	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Baz	Fisher Scientific	BP152-5
Kloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Kimyasallar A.Ş.	BLT5403	Genotip: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampisilin, Sodyum Tuzu	Araştırma Ürünleri Uluslararası	A40040
Etidyum bromür	Fisher Scientific	BP102-1
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS birincil antikoru	Qiagen Inc.	34660
Keçi anti-fare alkalin fosfataz konjugatı	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrofenilfosfat	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP astar	EMD Kimyasallar A.Ş.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-AŞAĞI
astar	EMD Kimyasallar A.Ş.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR Arıtma kiti	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Jel Ekstraksiyon kiti	Qiagen Inc.	28706
Büyük Boya Sonlandırıcı v3.1 Döngü Sıralama Kiti	Invitrogen Life Technologies	4336917
Isıtma Bloğu	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96 kuyulu Hücre Kültürü Plakaları	Corning	Costar 3590
Isotemp İnkübatör Fırını	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipetleri, 5 & # 190; Fisher	Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Kalkanı	Oberon	071AF
Eldiven, Nitril	Fisher Scientific	19-170-010C
Steril 1.5 ml tüpler	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml Borosilikat Pipetler	Fisher Scientific	13-678-25E
Borosilikat kültür tüpleri	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA plaka okuyucu	Labsystem ve Flow Laboratuvarları, Helsinki, Finlandiya	Tip 362