Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

33.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50685

⸱

16 Şubat 2014

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

Bu makalede

Özet

Faj gösterimi, bir ilgi hareketsiz molekülü ile etkileşen proteinleri ya da protein parçaları yakalamak için güçlü bir tekniktir. Oluşturmak için faj cDNA kütüphanesi türüne ve ekranın bir karar yapıldıktan sonra, burada açıklanan protokol interactors tanımlanmasına yol açan verimli benzeşim seçimine izin verir.

Özet

Hareketsiz yem moleküllerine yönde klonlanmış bir cDNA kütüphanesi ile kodlanan çeşitli protein kısımlarını sunmak için bir iskele olarak yeniden birleştirici faj kullanılarak etkileşimleri keşfetmek için etkili bir araçtır. Bu teknik, büyük ölçüde, protein-protein etkileşimleri keşfetmek için kullanılmıştır ama meydan için yem molekül proteinleri ile sınırlı olmak zorunda değildir. Burada sunulan protokol yemler mütevazı bir dizi aynı protein sunum bağımsız klonların belirlenmesini maksimize etmek için tekrardan ekranlı izin vermek için optimize edilmiştir. Bu tespit etkileşen proteinlerin yem molekülün yasal Uygulayıcılar olduğu daha büyük bir güven izin verir. Her afinite seçimden sonra faj titresi İzleme yuvarlak yakınlık seçme negatif kontrollerin etkinliği yanı sıra nasıl ilerlediğini bilgi sağlar. Bir faj titering ve nasıl anlamına gelir ve ne bu süreç verimli olarak ilerleme sağlamak için önceden hazırlamakMümkün olduğunda, sunulmuştur. Bağımsız plak izolasyonu aşağıdaki alınan amplikonların Özellikler afinite seçimi ilerlemiştir ne kadar iyi belirlemek için kullanılabileceğini vurgulanır. Sorun yanlış pozitif veya en aza indirmek için ısrarla fajının geri atlamak için çekim teknikleri açıklanmıştır. Viral bulaşma nöbetini azaltılması araçlar tartışılmıştır.

Giriş

Neden bunun yerine diğer moleküllerle protein etkileşimleri keşfetmek ve araştırmak için kullanılabilir sayısız diğer tekniklerin faj ekran ve afinite seçimi kullanmak? Faj görüntüleme dahil olmak üzere şu protein-ligand etkileşimleri 1-3 saptanmasında diğer yöntemlere göre bazı benzersiz avantajlar iddia edemez:

Yem moleküllerin çok geniş repertuarı

Önde gelen nedeni yakınlık seçimi 4 yem olarak etki edebilme yeteneğine sahip moleküllerin çeşitliliği bulunmaktadır. Faj gösterimi, bir polimer / molekül, elde edilebilir bir desteğe bağlı olabilir Esasen, bu faj gösterilen proteinlerle yakınlık için taranmalıdır diğer proteinler, nükleotitler, karbonhidratlar vb 5 etkileşim protein fragmanlarının izole edilmesi için bir çok güçlü bir araçtır. R koşullar için kullanılan, ayrıca, yem molekülü, 6, hareketsiz olduğunda biyolojik aktivitesini muhafaza olup olmadığını belirlemek için erişilebiliretkinliğini ortadan kaldırmak / çıkarmak önce yakınlık seçimi için yem dönüşüm sonrası değişikliğe tanıtmak için, 6 ya da etkili bulunmaktadır.

Yabancı faktörlere faj direnç

Faj ekranı kullanarak ikinci bir sebebi, bazı yemler onların etkileşim proteinlerini yakalamak için çevresel stres (ısı, yüksek osmolite konsantrasyonları, belirli kofaktörler, vb.) Gerektirebilir mümkün olduğunu, ya da faj görüntülenen proteinler şekilde değiştirilmesi gerekebilir afinite seçimi öncesinde. Çalışılmaktadır birincil faktör yem ve protein değil, bu test organizması için ölümcül ise etkileşim meydana sağlar veya durum arasındaki etkileşimdir. O (T7 canlılığı için yayınlanan termik maksimum ~ 60 ° C 7 eg) sağlam ve kalıcı hem de sert deneysel koşullara dayanabilir, çünkü T7 faj tür çalışmalarda özellikle uygundur. Değiştiren faj bir örnek olarak gösterilen proonarım enzimi protein yüzeyler için Arabidopsis thaliana tohum proteomesini incelerken proteinlerden, protein Isoaspartyl Metil Transferaz (PIMT), bu çalışmalarda kullanılan virüs girmesini teşvik etmek, önce her bir yakınlık seçimi için yuvarlak, bir hafta boyunca "yaşlı" olmuştu isoaspartate of (IsoAsp) tanımak ve onarım / tür anormallikleri metabolize organizmalarda mümkün değildir duyarlı proteinlerin 6 artıkları.

Metabolik olarak atıl

Ayrıca, faj genellikle metabolik zehirler ve, en azından, metabolik açıdan aktif bir test organizmalar üzerinde pleitropik etkilere neden olur küçük moleküller müdahale dayanıklıdır. Sıkılık yıkama sonrasında, zehir zehir bakteri ya da daha sonraki faj replikasyon için zararsız bir aralığa seyreltilir böylece bakterilerin büyük bir hacmi enfeksiyonu için kabul edilmeden önce çıkarılır. PIMT onarım protein hedeflerini araştırırkenenzim, S-adenosil Metionin (AdoMet) enzimi inaktive ve yararlı bir negatif kontrol olarak sağlamak temin etmek üzere S-adenosil homosistein (AdoHcy) dayanarak iken bir hedef protein yakalama izin vermek için mikro titre plaka oyuklu hareketsizleştirilmiş enzimin aktive etmek için kullanıldı virüs olumsuz AdoMet veya AdoHcy 6 ya etkisinde değil ki bilgi. Ayrıca, bu laboratuarda araştırılmıştır bazı Geç Embriyo bol (LEA) protein ailesine ait üyeleri noktasında, soya fasulyesi tohumlannda 200 mM kadar yüksek konsantrasyonlar elde etmek için böyle 8 sakroz gibi katkı maddelerinin varlığında, kendi şeklini değiştirmek bilinmektedir fizyolojik olgunluk 9. Virüs bağımsız olarak uygun bir test organizmasının 10 için geçerli değil belirli LEA istemci-protein etkileşimleri için muhtemelen gerekli olan, her afinite seçimi yuvarlak, 200 mM sükroz ilave etkilendiği tahmin edilmez.

Bu laboratuvar açığa çıkarılması odaklanmıştırg protein-protein dehidrasyon 11 ya da tohum 6 batırılmış sonra IsoAsp oluşumuna yatkındır saklı proteomun bileşenlerinin onarımı sırasında depolanmış proteom koruma mekanizması altında yatan olgun, susuz ya da çimlenme tohumlarda etkileşimleri. Bu nedenle, üretim ve arıtma aktif halde yem olarak gerekli olan yeniden birleştirici proteinlerin, ve immobilize edilir önce ve sonra genellikle zordur, çalışmalarımız için bir köşe olmasına rağmen bunlar, çok kalmasını sağlamaktır. Her bir rekombinant protein üretim senaryo farklı olduğu, ancak, yeniden birleştirici protein üretimi için optimize koşullar burada ele alınmayacaktır. Kullanıcılar (bir enzim ise mikrotiter plaka kuyularda bir enzim tahlili yapmak gibi) hareketsiz protein hala işlevsel olup olmadığını belirlemek için, mümkün olan her yerde, denemek için teşvik edilmektedir. Bu herhangi keşfetti etkileşimleri olduğunu, yem nedenle biyolojik olarak aktif olduğunu ve bazı güven sağlayacakbiyolojik ilgisi var biraz daha olasıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

B) saflaştırılmış bir rekombinant yem, A) bir faj görüntüleme cDNA yem için afiniteye sahip proteinleri kodlayan muhtemel kütüphane ve (Şekil 1), aşağıda tarif edilen prosedüre gösteren bir grafik temsildir bir faj görüntüleme kitaplığı kullanılarak yakınlık seçimi için iki temel bileşeni vurgulamaktadır protein. Yem (rekombinant protein) üretimi yaygın incelenmiş ve literatür E. çözünebilen aktif rekombinant proteinin sağlanması için en iyi uygulamaları özetleyen coli 12-13, ökaryot maya 14, böcek 15-16, bitki 17-18, 19-20 veya memeli hücreleri boldur.

Aşağıdaki protokol, bir rekombinant protein hexahistidyl yem olarak kullanılmıştır etiketlendi. Bu, yem proteinler gece boyunca inkübasyon ve yıkama adımları sonra kuyularda kalmasını yapılmasına izin vermektedir.

1.. Mikro titre plaka kuyuları Rekombinant Protein Tutma için ELISA

  1. Markkalıcı mürekkep ve kuyular hangi protein konsantrasyonları içerecek adayı ile mikrotitir levha. Kuyu 3 katlama ve bu gerçekleştirin. (; BSA bu arka plan onay olarak iyi çalışır olmayan hexahistidyl-etiketli protein) bir negatif kontrol konsantrasyon serisi 3 tekrarlamalı içerir.
  2. Suyla iyice yıkayın ve plaka ters yıkamalar arasında 4 kat kağıt havlu üzerinde plaka şupur tarafından su çıkarmak.
  3. Tris, pH 7.5, (seçim ya da tampon) yeniden birleştirici protein (10 ug / ml) olan en yüksek konsantrasyon, 100 ul, ilk 3 kuyularda, hareketsiz. Sonraki üç kuyu aşağı 1.0 ng / ml vs (1.0 ug / ml), en rekombinant protein ekleyin. BSA konsantrasyon serisi ile aynı yapın.
  4. Plastik wrap ile yemekler örtün ve 4 ° C'de gece bekletin
  5. Ertesi sabah, baş aşağı 4-5 tabakalar, kağıt havlu üzerine tabak şupur tarafından protein kaldırmak.
  6. Yıkayın kuyuları tampon bırakarak, TBS 1x 200 ul her seferinde 5x'e~ 1 dakika her zaman ve baş aşağı her yıkamadan sonra kağıt havlu üzerinde plaka şupur tarafından tampon yıkama çıkarılması için kuyu.
  7. (W / v) BSA ve 200 ul 5% 200 ul,% 5, döner bir karıştırıcı üzerinde ELISA plakasını bloke (w / v) 2 saat oda sıcaklığında TBS içerisinde bloke edici tepkin madde (ya da 4 ° C 'de bir gece boyunca sabit oturan uygun olursa ) naylona sararak.
  8. Baş aşağı kağıt havlu üzerinde plaka şupur tarafından aşırı engelleme çözüm çıkarın. Ters plaka şapırtılı ile yıkama solüsyonu çıkarma, 1 x TBS 200 ul 4x 1 min her yıkayın.
  9. Bloke edici tampon içinde penta-HIS birincil antikor 1/2, 000 seyreltilir ve her bir oyuğa 100 ul sağlar. Plaka durur, oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
  10. Baş aşağı kağıt havlu üzerinde plaka şupur tarafından birincil antikor çıkarın. 1x TBST 200 ul 4x 1 min her yıkayın. Baş aşağı plaka şupur her yıkama kaldırmak.
  11. İkincil antikor seyreltinBloke edici tampon ve plaka, sabit haldeyken, oda sıcaklığında 1 saat boyunca her bir 100 ul içinde inkübe (keçi anti-fare alkalin fosfataz eşleniği).
  12. Baş aşağı kağıt havlu üzerinde plaka şupur tarafından ikincil antikor çıkarın. 1x TBST 200 ul 4x 1 min her yıkayın. Baş aşağı plaka şupur her yıkama kaldırmak.
  13. Her bir para-nitrofenilfosfat (pNPP) alt-tabaka çözeltisi 200 ul koyun. Alt tabaka yani numuneler oluşturun ve tamamen bu aşamada çözülmüş çok iyi vaktinden dondurucu üzerinden tespiti için gerekli alikotların gerekli sayıda almak -20 ° C'de bir katıdır.
  14. 30 dakika de her bir oyuğa 3 M NaOH, 50 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  15. Derhal ELISA plaka okuyucusu üzerinde 405 nm'de emicilik ile oku.

Not: ilgilenilen rekombinant protein oyuklara tutunmasını etmez, bu inci değiştirmek mümkündüre bileşim / tampon pH önemli ölçüde (karbonat tamponu pH 10.0) ya da mikro-titre plaka çukurlarına protein ek yardımcı girişimi çaotroplar (üre) ekleyin. 2) yüksek pH / kaotrop çıkarılması takip eden biyolojik aktivitesini muhafaza tavsiye edilir: 1) yakınlık seçimi için koşullar altında mikro titer plakal kuyuları bağlı kalır ve: Bununla birlikte, rekombinant protein, yeniden kurulması.

2. Titerlenmesi için Bakteriyel Sunucuyu (BLT5403) Büyüyen

  1. Otoklav (Şekil 2A), on 250 ml Erlenmeyer flasks ve 3 kültür tüpleri. LB sıvı ve katı ortam plakaları dökme için LB agar olun. Soğuk LB 50 ° C'ye kadar ve daha önce agar asceptically bir akış başlığı (Şekil 2B) Petri kapları içine dökülerek 100 ug / ml ampisilin ilave edin.
  2. Aynı zamanda, bir akış başlığı (Şekil 2B), bir çizgi LB içinde, stoktan BLT5403 tek koloniler için 100 ug / ml ampisilin (AMP100 LB) agar plaka% 15 tutulur (v / v)-80 ° C'de (Şekil 2C) gliserol. Büyüme için bir kuluçka makinesi (Şekil 2B) içinde gece boyunca 37 ° C de ters levha yerleştirin.
  3. Sabah, plakadan toplandı, tek bir koloni ile bir 250 ml Erlenmeyer şişesi içinde 50 ml LB AMP100 inoküle. 37 ° C, yatay çalkalayıcı (Şekil 2E ve 2F) 200 rpm'de inkübe ve = 0,5-0,6 (Şekil 2H), OD 600 hücre yoğunluğunu izlemek için bir spektrofotometre kullanmak.
  4. Bir 50 ml Falcon tüpü veya benzeri içine hücreleri dökün ve kullanım (Şekil 2G) kadar 4 ° C'de tutun. Hücreler genellikle ~ 1 hafta boyunca canlı kalır.
  5. 500 ml LB yapmak, şaşkın bir Fernbach şişeye koyun ve otoklav. Steril sonra, aşağıdaki "gün bir" en gece kadar 4 ° C '(Şekil 2G) ya da oda sıcaklığında şişe yerleştirin.

Not: konakçı bakteri hücreleriBLT5403, T7 orta ve düşük kopya vektörler başarılı bir çoğaltma onsuz T7 ana kapsid proteininin bir plasmid kaynaklı kaynağı ifade, virüse karşı son derece hassastırlar. Bu kirlenmeyi önlemek için zorunludur. Virüs / bulaşmış bakteri ile temas eden tüm yüzeyler% 70 (v / v) etanol ile silinir veya deterjan (Şekil 2I) kullanılarak temizlendi edilmesi gereken nokta kontaminasyon sonunda meydana gelecektir. Bu etkisiz ise, Envirocide (Şekil 2J) dayanabilir tüm yüzeylerde ayrıntılı bir dekontaminasyon gereklidir. 4 ° C stokunun kirlenmesini azaltmaya yardımcı olmak için dondurucu stoktan BLT5403 hücrelerin yakınlık seçimi her yeni yuvarlak başlayın ve güçlü hücreler protokolünde kullanılan sağlamak. Filtre pipet ipuçları önemlidir.

3. Affinity seçimi

BİRİNCİ GÜN

  1. Mark kuyular hangi prot içerecek bir mikrotitr kalıcı mürekkep ile plaka ve adayıeins / değişiklikler. (Nedeniyle kirlenme sorunları, plakaları yeniden asla). Her bir protein ve tedavi için oyuklara 3 katlama ve bu gerçekleştirin.
  2. Suyla iyice yıkayın ve plaka ters yıkamalar arasında 4 kat kağıt havlu üzerinde plaka şupur tarafından su çıkarmak. Ilk kez Tris, pH 7.5, altı kuyu (seçim ya da tampon) yeniden birleştirici protein (10 ug / ml) ya da BSA 9 kuyu olmak üzere toplam üç kuyu (10 ug / ml), 100 ul, hareketsiz yakınlık seçimi yuvarlak. Plastik wrap ile çanak Kapak ve 4 ° C (Şekil 2G) gece bekletin.
  3. Otoklav ve uygun şekilde etiketlenmiş temizlenmiş 9 x 250 ml Erlenmeyer matara (yukarıda 2.1), (renkli bant ile kodlama, iyi Şekil 2F çalışıyor) olmadığından emin olun.
  4. Her bir kullanılan kütüphanenin titresi ve taranması için faj sayısına göre kullanılacak faj lizatının hacmini hesaplar.
  5. Taze BLT5403 hücreleri kullanmaya hazır olduğundan emin olunyuvarlak bu yakınlık seçimi yarın (Şekil 3A) titering için.
  6. Yeterli 1x TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris baz, pH 7.6) ve 1 x TTBS (1x TBS +% 0.05 (v / v) Tween 20) sağlamak kuyu kullanılan sayısı için 10 x 200 ul yıkama gerçekleştirmek için kullanılabilir . Ek olarak, afinite seçimi sıcaklıkta TTBS Preincubate. Mühürlü bir yedekleme, 1x TTBS 50 ml Falcon tüp yeterli 1x TTBS ile yakınlık seçim sıcaklıkta bulunduğundan emin olun.
  7. LB 100 AMP her 990 ul ile 1.5 ml Eppendorf tüpleri (27 toplam) 3 tedavileri x 3 x 3 tekrarlamalı Triplikat hazırlayın ve uygun (örneğin 10 -2) etiketleyin. Bu yarın mikrotitre plaka çukurlarına alınan enfekte olmuş bakteri için bulunmaktadır. Tüpün (10-2) bir tarafında, seyreltmenin ve diğer tarafta bir artan numarası ("1") işaretleyin. Her Eppendorf tüp için, ayrıca bir borosilikat tüp ve bir LB 100 AMP plaka etiket. Bu Way, plakalar ve borosilikat test tüpleri, vb, 4, 3, 2, 5, 1 numaralandırılır. titerleme daha hızlı gitmek yapmak için. Daha sonra basit bir sayı Eppendorf tüp seyreltme ve tedavisi için uygun olabilir (örneğin, 12. 10 tüp seyreltme -5 için BSA kontrol ilk çoğaltma üçüncü, üçlü olarak). Mağaza Eppendorf tüpleri ve LB AMP 100 levhaları gece boyunca 4 ° C 'de (Şekil 2G ve 3B).

Örneğin, BSA çoğaltma bir de 1, 2 ve 3 (çoğaltma için bir faj titresi üç, üçlü okuma) ve ikinci faj üç adet 10 -2 dilüsyonları için 1.5 ml Eppendorf tüpler etiketleme, ve daha sonra test tüpleri 1 borosilikat işaretlemek Başlangıç enfekte edilmiş bakteriler LB AMP 100 agar plakaları (Şekil 3C) üzerine dökülmeden önce enfekte edilmemiş bakteri ve üst agaroz ile karıştırılmış edilecektir 2, ve 3'tür.

  1. Seri dher ilutions, etiket Eppendorf tüpleri ve, LB AMP 100 900 ul ekleyin. Ilk seyreltme enfekte olmuş bakteri (10-2) her bir protein / muamele, çoğaltma ve üç kopya halinde, yarın için yapılır, bunlar iyice karıştırıldı olacak ve 100 ul onlardan alınır ve LB-100 900 ul ihtiva eden uygun bir Eppendorf tüpüne eklenmiş (replikasyon, bir BSA kontrol için tüpler 4, 5 ve 6) 10 -3 seyreltme için AMP. Bunlar da iyice karıştırılır ve 10 -3 seyreltmeler 10 -4 dilüsyonları için kullanılacak (7, 8, 9). 10 -5 seyreltileri (10, 11, 12, vb) için 10 -4 dilüsyonları kullanın. Üç BSA tekrarlamalı (kuyu) ilk için titresi alır.
  2. Aynı BSA çoğaltma iki için yapılacaktır (iyi 2), BSA çoğaltma üç (iyi 3), zehirli yem üç tekrarlamalı ve nihayet yem kuyuların üç tekrarlamalı. Sonunda, f işaretli borular olmalıdırrom 1-135 (135 10 -6 maksimum seyreltme de yem son çoğaltma son üç kopyalı olduğu). 4 ° C'de (Şekil 3C ve Eppendorf BSA üç tekrarlamalı (üç kuyu) ve üç kez her dilüsyonları için borosilikat tüpleri göstermektedir, bu da bir gece boyunca Eppendorf tüpleri saklayın.
  3. Bir gecelik kültürü ile enkübe çalkalayıcı (Şekil 2E ve 2F) büyüyen, (aşama 2.2 üzerinde yeni boyanmış bir gece boyunca LB AMP100 levhasından tek bir koloni çekilen) BLT5403 hücrelerinin 2 ya da 3 kültür tüpleri başlatın. 500 ml LB (noktasının üzerinde 2.5) için, 100 ug / ml ampisilin ile ekleyin ve 37 ° C'de olacak şekilde çalkalama inkübatöründe kelepçesine Fernbach şişesi yerleştirin ve ertesi sabah (Şekil 2F) havalandırılmıştır.

Not: Yuvarlak üç ve dört p kadar -10 olarak 10 hacim yaklaşık dilüsyonları gerektirebilirLB AMP100 arasında hacme Hage.

İKİNCİ GÜN

  1. Ertesi sabah, kuluçka çalkalayıcısında kelepçelerine otoklav, 9 boş x 250 ml Erlenmeyer şişelere (her mikrotitre plakası için) yerleştirin. BLT5403 hücrelerinin gecede kültürlerinden biri 500 ul ile 500 ml LB 100 AMP aşılamak, (yukarıdaki adım 3.8) mühürlemek ve (37 ° C, 220 rpm) büyümeye başlar Geçen gece başladı. Spektrofotometre (Şekil 2H) açın ve 600 nm de absorbansı okunur olarak ayarlayın.
  2. 4 ° C arasındaki bir mikro çıkarın, plastik filmi çıkarın ve 200 ul 1 x TBS pH 7.5, her zaman 10x yıkama ve ters yıkama arasındaki bir kağıt havlu üzerine plakayı şapırtılı levhanın herhangi bir bağlanmamış protein çıkartılır. 200 ul% 5 plastik sargısıyla plaka (w / v) BSA ve 200 ul,% 5 (ağ / hac) 1 saat süre ile TBS içinde bloke edici tepkin madde (ya da bir gece boyunca uygun ise) ile bloke edin.
  3. Engelleme s yıkayınolution 10x ters yıkar arasında kağıt havlu 4 kat üzerinde plaka şapır şupur 1x TBST'nin 200 ul her zaman, ile. O, bu aşamada 200 ul su ile kuyu dolum plastik wrap ile kapak ve maksimum 1 hafta boyunca saklamak için 4 ° C'de onları koymak mümkündür.

Not: zaman afinite seçimi tamamlanmasından itibaren enfekte faj-BLT5403 eklemek için hazır olan, bu kısa bir süre yeterli başlangıç ​​kültürü, 500 ml hücreler, 0.6 ve 1.0 OD 600 arasında bulunmaktadır. Onlar çok 1,0 ötesine büyümek varsa Hücreler durağan aşamaya yaklaşırken, parçalama nedeniyle kaynak kısıtlamaları oluşabilir. Hücreler 600 0.6 en az önce faj tanıtımı için bir OD elde yoksa, enfeksiyon çokluğu hızla lizat temsil etkileyebilir, hangi hücrelerin öldürülmesi, çok yüksek olabilir. Hücreler henüz afinite seçimi, inoc tamamlanması ile bir OD 0.6 600 yaklaşırken değilsenizulate ikinci (ya da ikinci ve üçüncü her ikisi de), 37 ° C'de (Şekil 2F) çalkalanarak test tüplerinden BLT5403 daha fazla olan bir şişe. OD 1.0 600 çok hızlı yaklaşıyor, ısıtıcı ve çalkalayýcýsýný kapatın ve kültür serin ve oksijen bakteri açlıktan kapağını açın. Fajdan kez sallayarak / ısıtma recommence eklenmiştir.

Buradan faj çapraz bulaşmayı önlemek için filtre bariyer ipuçlarını kullanın.

  1. Şişe aşılanır sonra, proteinler ile, faj kitaplığı (100 ul) koymak plastik film ile kapatın ve plaka 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
  2. 55 dakikada, OD hücrelerin 600 kaydedin. Katlama süresi kabaca her 20 dk. Yasası buna göre (yukarıdaki "Not" bölümüne bakın).
  3. Bir saat sonunda plakadan plastik kaplamayı çıkarmak ve hemen dönüştürülmüş atık olarak faj çalkalanır ve daha sonra hızlı bir şekilde TBC 1x 200 ul ekleyerek yıkayınST. (1 = 100 ul kafa ile bir multipipettor ve ayarlanmış pipet kullanın 2 için bu [yani 200 ul / dalgıç depresyon sunar] ve hızlı bir şekilde gidiyor). 1 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın. 1 dakika sonra, dönüştürülmüş atık, ters kağıt havlu üzerine şaplak plaka içine tampon silkelemek ve tezgah (25 ° C plaka) geri yerleştirin. Yıkama tekrarlayın 10x adımları.
  4. 10. yıkamadan sonra, 4 ° C de 50 ml Falcon tüpü BLT5403 hücrelerinin 200 ul almak ve iyi TTBS son yıkama kaldırıldı hangi alt koyun. Plastik wrap tabak sarın ve (gelişigüzel fajının bağlanmasını ısrarla alınan faj ve / veya yüksek arka plan ilişkin tartışmada nota bakınız) hala bakterileri enfekte yem yapışmış herhangi fajının almak için 20 dakika boyunca 37 ° C'de koydu.
  5. 20 dakika sonunda, plakalar açmak ve 25 ° C de bir replikasyon de BSA 10 ul bakteri alır ve belirgin LB AMP 100 990 ul koyun"1". Bu oyuk iki kez daha tekrarlayın (boru 2 ve 3) bu iyi gelen faj 1/100 dilüsyon 3 üçlü olarak elde edilir. Bu, üç kez örnek BSA çoğaltma biridir. Bu dilüsyonlar BSA bu çoğaltma için ± SEM ortalama titresi tahmin etmek için kullanılacaktır.
  6. Zehirli yem proteinin üç çoğaltılmış kuyuları için, BSA (10 ul her üç üçlü örnekleri) replikasyonu 2 ve 3 için aynı yapın, ve yem protein. Bunların yanı sıra 27 Eppendorf tüpleri ayarlamak ve liziz doğru artan kuyularda enfekte bakteri geriye kalan 170 ul alır.
  7. Balon içindeki bakteriler 0.6-1.0 OD = 600 ise, FERNBACH'ın 50 mi hücreler dokuz 250 ml Erlenmeyer şişelere her bir şişeye içine süzün. De BSA çoğaltma 1 faj ile enfekte olmuş bakteri BLT5403 kalan 170 ul al ve "BSA Rep 1" (sarı bant) işaretli 50 mi hücrelere ekleyin. Dokuz kuyuları için bunu yapın ve onları (inkübatör sallayarak koymak Şekil 2F).
  8. Liziz için güçlü ve zaman zaman-den 37 ° C kuluçka çalkalayıcı (inokülasyon zamanında yaklaşık 3 saat) 'de hücreler izleyin. Bu süre boyunca, uygun etiketlenmiş Eppendorf tüpleri içinde 27 ilk seyreltmeleri (10-2) arasındaki dilüsyonları yapın.
  9. Yukarıdaki 3.12 'den ilk 27 seyreltileri bu dilüsyonları gerçekleştirmek için, Eppendorf tüpü 1 (aslında bu 1/100 seyreltmesinden Triplet örneklerin ilk BSA bir çoğaltma) bakterileri LB 100 ul almak ve eklemek Eppendorf tüpü içinde 4 LB 900 ul (birinci de bu ikinci Triplet örneklerin BSA çoğaltma biri 1 x 10 -4 seyreltme).
  10. Eppendorf tüpüne 7 LB 900 ul ilk üç kere arasında BSA replikasyon, bir (1 x 10 -5 seyreltme, eklemek Eppendorf tüp 4 bakterileri LB 100 ul almadan önce yeni bir bariyer için filtre ucu atın Bu kuyudan örnekleri). Dilüsyonları (d Devamkendi tüm proteinler ve tedaviler (toplam 135 borular) her tekrarlamalı her üçlü için) -6 10 x 1.
  11. Hücreler lize sonra, bir 5 M NaCl stoktan 5 ml ilave etmek suretiyle, 0.5 M NaCl ile kültür getirmek ve bir etiketli bir santrfuj şişesine aktarın.
  12. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüje Temiz,, steril bir 50 ml Falcon tüpü içine süpernatant (virüsü) süzün.
  13. Falcon tüpüne boşaltılmıştır yüzer kloroform birkaç damla ekleyin.
  14. Afinite seçim bir sonraki tur için 4 ° C'de saklayın.

4. Gün Üç

  1. Sonraki turda hazırlanmak için yuvarlak bu yakınlık seçimi oluşturmada kullanılan tüm laboratuvar kapları otoklavlayın veya ağartmak.

5. Titering

  1. Sulandırmalar artan düzende olduğu gibi sayısı çok katı LB 100 AMP tabak gibi (şimdi her borosilikat tüp ve Eppendorf tüp, AYNI numarası ile her biri için 1 tabak olmalıdır). P, 37 ° C inkübatör (Şekil 3D) 'de plakaları ut.
  2. Üst agarozun eritilmesi (1.0 g Bacto Tripton, 05 g maya ekstresi, 0.5 g NaCl, 0.6 g agaroz, 100 ml otoklava olun) üst agaroz şişe kapağı gevşemesine ve dönüşümlü olarak şişe mikrodalga ve üst kadar karıştırmak dönen tarafından Agaroz tamamen eridi. 50 ° C'de (Şekil 3E) soğumaya su banyosu içinde bir şişe yerleştirin.
  3. Bağlı bir pipet pompası ile bir borosilikat 10 ml pipet al. Bir Bunsen beki yakin. Ters bankta bir strafor Falcon tüp tutucu veya soğutucu kapağı açın ve üzerine 1 ile 6 (taze 37 ° C inkübatör dışında) LB100 AMP tabak yerleştirin, Tabak 1 üstte (Şekil 4A). Strafor sıcak tabak tutar.
  4. Yukarıdaki gün hazırlanan (bölüm 3.7 ve 4B ve 4C Rakamlar) numaralı borosilikat test tüplerine her birine 4 ° C ila 250 ul BLT5403 hücreleri koyun. Ar1.5 ml Eppendorf tüpleri (Şekil 4A) 'de seyreltileri ile aynı artan seri sayılı borosilikat tüp değişir.
  5. Borosilikat deney tüpüne 1 (Şekil 4D ve 4E) hücre 250 ul Eppendorf tüpü 1 seyreltmesinden 100 ul koyun. Biraz (çok fazla değil! ~ 3 ucuz bira, Şekil 4F) ateşte pipet içinde ilk 5 ısıtın ve erimiş üst agaroz dalıyoruz. 3 ml yukarı çekin ve hücre / faj (Şekil 4G) üstüne deney tüpüne HIZLA teslim.
  6. Diğer tarafta (Şekil 4H) ile tüp tutan ve plaka (Şekil 4i) üzerindeki içeriği dökün sırasında parmakla hafifçe vurarak karıştırın. Plaka eğin ve bütün plaka üst agaroz ile kaplıdır kadar kabarcıklar ve kuru noktalar kovalamak için test tüpü kullanın. Dik soğumaya bankta, bir kenara koyun.
  7. Borosilikat tüp atın, filtre bariyer ucu çıkarma, bir olsuntaze bir ve bütün dilüsyonları kaplama olmuştur kadar devam. Bu tükenmiş ama en fazla 6 aynı anda ya da serin ve üst agaroz çok hızlı bir şekilde katılaşan olarak inkübatörden LB AMP 100 plakaları al.
  8. Üst agaroz katı bir kez, (BU yapmak önemlidir) ters plakaları çevirin. Aksi takdirde, ağar / agaroz, "ağlayan" kapakta yoğunlaşır, üst agaroz aşağı düşer ve bunun imkansız YA ve) doğru titre yapma ile faj alarak, üzerinde çalışır: 1) 37 ° 'tabak koymak C inkübatör OR [T7 agresif olduğu gibi titreyi saymak 4 saat sonra döneceğim]: 2) titreye saymak için ertesi sabah ters bankta onları bırakın ve onlar hazır.
  9. Kaynayınca kadar, gevşek ve mikrodalga üst agaroz geri üst agaroz şişe kapağı koymak yoksa cam kırılıp veya yaralanmalara karşı korumak için gerekli tüm önlemleri almak. Iki kez yapın. Serin, sıkın izinkap ve uzağa koyun. Her zamanki sıcaklığı su banyosu kısın ya da kapatın. 4 ° C buzdolabında dilüsyonları koydu. Onlar titerlerini yorumlamak ve / veya Titerlenmesi bazı yinelemek için gerekli olacaktır.

6. Titresinin belirlenmesi ve hesaplanması

  1. Plakalar üzerinde oluşan plak incelemek ve confluent lisisinin (Şekil 5A örneğin 10 -2 seyreltme) ile bu atın. Kalan seri seyreltmeleri (ki Şekil 5A nd 5B) doğru bir çetelesini sağlayacak kadar birkaç plak üretti belirler. Bu levhaların (; Şekil 5B Tablo 1) plak numarasını kaydedin.
  2. Seyreltme ile plak sayısının çarpma ve daha sonra, yani enfekte olmuş bakterinin sadece 10 ul, üç kez ve s 'nin her biri için alınmıştır kuyu (alınan enfekte olmuş bakteri ml başına plak oluşturan birim sayısını elde etmek için, 100 çarpıno bu ml başına sayıları) almak için 100 ile çarpılması gerekir. Bu da alınan üç üçlü karşısında (iyi mikrotiter plakasının üzerinden alınan seyreltilmemiş enfekte olmuş bakteri PFU / ml), mililitre başına Plak Oluşturan Birimlerin sayısı (PFU) ortalama.
  3. Üç suret kuyuları için çizelgeler Grand ortalama formu ve bu ortalama (Tablo 1) standart hata hesaplayın. Bu, her afinite seçimi, yuvarlak ve tedavisi için (Şekil 5C) için faj titresi artışın şekilde kaydedilir budur.

7. Plak İzolasyon, PCR ve Dizi

  1. Afinite seçim turu 4 sonunda, 18 bireysel, iyi tanımlanmış, plak koloniler ve steril bir Pasteur Pipet, kürdan kullanarak, sarı pipet veya benzeri bir cihaz, çekirdek bu plak titerleme plakalardan seçin. Tüpler veya ipuçlarını kullanarak, önce Tris-HCI, Eppendorf tüpü (Şekil 5D) pH 8.5 ile iç ıslak.
    2. , borosilikat tüp Tris hiçbir aşırı damla tutan emin olun ampulü bastırın ve yine sıkıştırılmış ile, hemen altında plastik Petri kabı (Şekil 5E) bir iyi izole plaket ile borosilikat pipet itin. Hala ağar / üst agarozda pipet ucu ile ampul bırakın ve özünü emmek (Şekil 5F, oka bakınız).
  2. Kısaca, uygun boru (Şekil 5G) ve girdap içinde 100 ul Tris-HCl, pH 8.5 içine çekirdek boşaltınız.
  3. 10 dakika boyunca 65 ° C 'de bu hacim 20 ul ısıtın.
  4. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, bir tezgah üstü santrifüj içinde 13,000 x g hızında ısıtılmış ses santrifüjleyin. T7-UP ve T7-aşağı primerler ile PCR reaksiyonlarında kullanılmak üzere bu miktar süpernatanından 3 ul al.
  5. 18 izole edilmiş plağın her biri için, ısıtılmış çözeltiler, tavlama 58 ° C sıcaklık ve 35 döngü kullanılarak bir 50 ul PCR reaksiyonu yapmak.
  6. EAC 20 ul çalıştırın% 1 h tepkime (a / h)% 0.015 (h / h) etidyum bromid ihtiva eden agaroz jeli. Uygun koruyucu gözlük ve eldiven nitril laboratuar kullanarak transilluminator ile gözünüzde canlandırın. (DİKKAT: etidyum bromür güçlü bir mutagen olduğu). Jel fotoğrafıdır ve uygun bulaşık maddelerin bertaraf (Şekil 6A ve 6B).
  7. Amplikonlar boş vektörden bir ürün olup, değilse (ürün ağırlık / hacim) TAE agaroz jel (1% 100 bp yakın çalışır, Şekil 6A ve 6B, oklar), bir dizileme şablonu olarak kullanım için geri kalan 30 ul temizleyin. Eğer jel (Şekil 6B, plak 15) üzerindeki tek bir ürünü, jelden en önemli bant (lar) kesmek ve bir kiti kullanılarak jelden DNA ekstrakte edin.
  8. Dizisi T7-UP astar kullanarak boş saçmazlar amplikonlar.
  9. Bağlayıcı kol her sekansı incelemek ve insertin başlangıç ​​bulunduğu bu bilgilerden, belirler. BA kullanınsic Local Alignment Search Tool (BLAST, National Library of Medicine) uç çerçeve içinde olup olmadığını, kodlanmış cDNA'nın kimliğini belirlemek için, var ise, proteinin hangi bölümünü kodlama dizisi (CDS) ile gösterilir ve yakalandı yem.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

(Metabolik yem zehirlenmesi) Faj gösterimli proteinleri ile etkileşim için yem kapasitesini olumsuz yönde mümkün olan bu tekniği için güçlü bir negatif kontrol sağlamaktadır. Bu, yem, iyi mikrotiter plakaya bağlandığı zaman, kendi işlevini korur olmadığını belirlemek de tavsiye edilir. Bu kontrollerin Hem nonpoisoned yem tarafından kurtarıldı etkileşim, faj görüntülenen proteinler meşru olduğunu güveni artacaktır.

Her bir kuyudan üç triplicates örnekleme afinite seçiminde bir rol oynar zaman...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Üç çoğaltılmış kuyularda deneyi çalıştırarak, yem bağlanma aynı proteinin, bağımsız bir şekilde edinilen faj aynı klon elde edilmiş olan CDS bölgenin nükleotid dizisi içinde (yani, hiç bir fark ancak bu olması bile ayırt edilebilir ) bağımsız kuyulardan alınan. Aksi takdirde, yem bağlanmasının, aynı proteini kodlayan faj arasında ayırt etmek için tek yoldur bunlar bağımsız bir şekilde, söz konusu nükleotid dizinin bir bölümünde farklı bölgeleri ters transkribe ise.

Seçilen faj afini...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Tohum Grant (2011-04375), ve ABD'ye Sir Frederick McMaster Araştırma Bursu; Bu proje kısmen bir NSF IOS (0849230) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
TriptonBecton Dickinson Co.
Maya ÖzüBecton Dickinson212750
AgarBecton Dickinson214010
Sodyum KlorürFisher ScientificBP358-10
AgarozAraştırma Ürünleri UluslararasıA20090
Bloke ReaktifEMD Chemicals Inc.69064
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
Sodyum HidroksitFisher ScientificBP359-212
Sodyum Dodesil SülfatFisher ScientificBP166-500
Tris BazFisher ScientificBP152-5
KloroformFisher ScientificBP1145-1
Escherichia coli BLT5403EMD Kimyasallar A.Ş.BLT5403Genotip: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampisilin, Sodyum TuzuAraştırma Ürünleri UluslararasıA40040
Etidyum bromürFisher ScientificBP102-1
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-Aldrich Corp.A-9647
Penta-HIS birincil antikoruQiagen Inc.34660
Keçi anti-fare alkalin fosfataz konjugatıSigma-Aldrich Corp.A-5153
para-NitrofenilfosfatSigma-Aldrich Corp.N-7653
T7-UP astarEMD Kimyasallar A.Ş.5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-AŞAĞI
astarEMD Kimyasallar A.Ş.5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR Arıtma kitiQiagen Inc.28104
Qiaquick Jel Ekstraksiyon kiti Qiagen Inc.28706
Büyük Boya Sonlandırıcı v3.1 Döngü Sıralama KitiInvitrogen Life Technologies4336917
Isıtma BloğuPierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)18780
96 kuyulu Hücre Kültürü PlakalarıCorningCostar 3590
Isotemp İnkübatör FırınıFisher Scientific516D
Pasteur Pipetleri, 5 & # 190; FisherScientific13-678-20A
ChromaView TransilluminatorUVP Inc.TS-15
UV KalkanıOberon071AF
Eldiven, NitrilFisher Scientific19-170-010C
Steril 1.5 ml tüplerUSA Scientific Inc1615-5500
10 ml Borosilikat PipetlerFisher Scientific13-678-25E
Borosilikat kültür tüpleriFisher Scientific14-961-27
Uniskan I, ELISA plaka okuyucuLabsystem ve Flow Laboratuvarları, Helsinki, FinlandiyaTip 362
211705

Kaynaklar

  1. Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
  2. Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
  3. Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
  4. Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
  5. Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
  6. Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
  7. Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
  8. Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
  9. Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
  10. Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
  11. Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
  12. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
  13. Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
  14. Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
  15. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
  16. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
  17. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
  18. Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
  19. Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
  20. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein-Protein EtkileşimleriFaj Titresi İzlemePlak İzolasyonuFaj Kütüphanesi TaramasıStringent YıkamaFaj AmplifikasyonuYem İmmobilizasyonu
Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.